ارزیابی اثر عصاره گیاه گل گاو زبان (Echium amoenum) بر تکامل سیستم قلبی عروقی جنین ماهی زبرا فیش روی ژن های ApoE، Nkx2-5 و Tbx5 با استفاده از روش Real-time PCR

الموضوعات : Journal of Animal Biology

رژین صلح جویی ¹ , طاهره ناجی ² , سعید محمدی معتمد ³ , نیکو نصوحی ⁴

1 - گروه علوم پایه، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - گروه علوم پایه، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - گروه فارماکوگنوزی، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
4 - گروه علوم پایه، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

تاريخ الإرسال : 03 الخميس , ذو القعدة, 1446 تاريخ التأكيد : 17 الإثنين , صفر, 1447 تاريخ الإصدار : 18 الثلاثاء , صفر, 1447

الکلمات المفتاحية: گل گاوزبان, جنین ماهی زبرا, Nkx2-5 , ApoE , Tbx5, Real-time PCR,

ملخص المقالة :

اختلالات قلبی‌عروقی در میان علل اصلی مرگ‌ومیر در سطح جهانی قرار دارند. علاقه‌ مندی فزاینده‌ای به ترکیبات گیاهی زیست ‌فعال برای پشتیبانی بالقوه از پیامدهای سلامت مرتبط با قلب و عروق پدید آمده است. این مطالعه به بررسی رشد قلبی‌عروقی در جنین ‌های ماهی زبرا (Danio rerio) و بیان ژن ‌های Nkx2-5،ApoE  و Tbx5 در پاسخ به عصاره تصفیه ‌نشده‌ی گل گاوزبان پرداخته است. این عصاره از طریق خیساندن با اتانول ۷۰٪ تهیه شد و جنین‌ های ماهی زبرا با غلظت‌ هایی از ۷٫۸ تا ۱۲۵ میکروگرم/میلی-لیتر از عصاره تیمار شدند. شاخص‌ های مورفولوژیکی جنین ‌های ماهی زبرا، بررسی بافت‌شناسی قلب و بیان ژن‌ ها با استفاده از روش Real-time PCR  مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در غلظت ‌های پایین تا متوسط (۷٫۸ تا ۶۲٫۵ میکروگرم/میلی-لیتر)، عصاره باعث افزایش بیان ژن ‌های هدف در جنین ‌های ماهی زبرا و رشد پیشرفته ‌تر قلب شد. در غلظت ‌های بالاتر (۱۲۵ میکروگرم/میلی-‌لیتر)، جنین‌ ها رشد نکردند، دچار انحنای بدنی شدند و نشانه ‌هایی از استرس اکسیداتیو نشان دادند. بررسی ‌های بافت ‌شناسی نشان داد که در غلظت ‌های زیر سمی، بافت قلب ماهی زبرا از نظر ساختار بافتی طبیعی به نظر می‌رسد و هیچ نشانه‌ای از سمیت حاد وجود ندارد. در مجموع، این مطالعه تأیید می‌کند که عصاره گل گاوزبان و سایر فرآورده‌های طبیعی ممکن است با افزایش بیان ژن در مراحل جنینی رشد قلب، به عنوان یک منبع طبیعی بالقوه برای پشتیبانی قلبی‌عروقی عمل کنند. مطالعات آینده باید برای ارزیابی حاشیه ایمنی گل گاوزبان و تأیید اثربخشی آن در مدل ‌های بالغ و مطالعات بالینی برنامه‌ریزی شوند.

المصادر:

1. World Health Organization. Cardiovascular diseases (CVDs). 2021 [Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds)] (Accessed 2 July 2025).
2. Mendis S, Graham I, Narula J. Addressing the Global Burden of Cardiovascular Diseases; Need for Scalable and Sustainable Frameworks. Glob Heart. 2022;17(1):48.
3. Jin J, Boersch M, Nagarajan A, Davey AK, Zunk M. Antioxidant Properties and Reported Ethnomedicinal Use of the Genus Echium (Boraginaceae). Antioxidants (Basel). 2020;9(8):722.
4. Liu C, Huang Y. Chinese Herbal Medicine on Cardiovascular Diseases and the Mechanisms of Action. Front Pharmacol. 2016;7:469.
5. Safaeian L, Haghjoo Javanmard S, Ghanadian M, Seifabadi S. Cytoprotective and antioxidant effects of Echium amoenum anthocyanin-rich extract in human endothelial cells (HUVECs). Avicenna J Phytomed. 2015;5(2):157-66.
6. Jafari H, Mokaberinejad R, Raeis-Abdollahi E. Echium amoenum from viewpoint of Avicenna: a brief review. Journal of Contemporary Medical Sciences. 2018;4(4):187-90.
7. Pena-Martinez EG, Pomales-Matos DA, Rivera-Madera A, Messon-Bird JL, Medina-Feliciano JG, Sanabria-Alberto L, et al. Prioritizing cardiovascular disease-associated variants altering NKX2-5 and TBX5 binding through an integrative computational approach. J Biol Chem. 2023;299(12):105423.
8. Colombo S, de Sena-Tomas C, George V, Werdich AA, Kapur S, MacRae CA, et al. Nkx genes establish second heart field cardiomyocyte progenitors at the arterial pole and pattern the venous pole through Isl1 repression. Development. 2018;145(3).
9. de Sena-Tomas C, Aleman AG, Ford C, Varshney A, Yao D, Harrington JK, et al. Activation of Nkx2.5 transcriptional program is required for adult myocardial repair. Nat Commun. 2022;13(1):2970.
10. Alagarsamy J, Jaeschke A, Hui DY. Apolipoprotein E in Cardiometabolic and Neurological Health and Diseases. Int J Mol Sci. 2022;23(17).
11. Islam S, Noorani A, Sun Y, Michikawa M, Zou K. Multi-functional role of apolipoprotein E in neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 2025;17:1535280.
12. Ismail AB, Balcioglu O, Ozcem B, Ergoren MC. APOE Gene Variation's Impact on Cardiovascular Health: A Case-Control Study. Biomedicines. 2024;12(3):695.
13. Mahley RW. Apolipoprotein E: from cardiovascular disease to neurodegenerative disorders. J Mol Med (Berl). 2016;94(7):739-46.
14. Li Y, Du J, Deng S, Liu B, Jing X, Yan Y, et al. The molecular mechanisms of cardiac development and related diseases. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):368.
15. Pezhouman A, Nguyen NB, Sercel AJ, Nguyen TL, Daraei A, Sabri S, et al. Transcriptional, Electrophysiological, and Metabolic Characterizations of hESC-Derived First and Second Heart Fields Demonstrate a Potential Role of TBX5 in Cardiomyocyte Maturation. Front Cell Dev Biol. 2021;9:787684.
16. Siatra P, Vatsellas G, Chatzianastasiou A, Balafas E, Manolakou T, Papapetropoulos A, et al. Return of the Tbx5; lineage-tracing reveals ventricular cardiomyocyte-like precursors in the injured adult mammalian heart. NPJ Regen Med. 2023;8(1):13.
17. Garcia-Flores E, Rodriguez-Perez JM, Borgonio-Cuadra VM, Vargas-Alarcon G, Calderon-Colmenero J, Sandoval JP, et al. DNA Methylation Levels of the TBX5 Gene Promoter Are Associated with Congenital Septal Defects in Mexican Paediatric Patients. Biology (Basel). 2022;11(1):96.
18. McElhinney DB, Geiger E, Blinder J, Benson DW, Goldmuntz E. NKX2.5 mutations in patients with congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 2003;42(9):1650-5.
19. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 1995;203(3):253-310.
20. Westerfield M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio): University of Oregon Press; 2000.
21. Chahardehi AM, Arsad H, Lim V. Zebrafish as a Successful Animal Model for Screening Toxicity of Medicinal Plants. Plants (Basel). 2020;9(10).
22. Granados-Riveron JT, Pope M, Bu'lock FA, Thornborough C, Eason J, Setchfield K, et al. Combined mutation screening of NKX2-5, GATA4, and TBX5 in congenital heart disease: multiple heterozygosity and novel mutations. Congenit Heart Dis. 2012;7(2):151-9.
23. Otis JP, Zeituni EM, Thierer JH, Anderson JL, Brown AC, Boehm ED, et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 2015;8(3):295-309.
24. Li S, Li X, Zhao R, Jiang T, Ou Q, Huang H, et al. Esketamine induces embryonic and cardiac malformation through regulating the nkx2.5 and gata4 in zebrafish. Sci Rep. 2025;15(1):7187.
25. Sadighara P, Araghi A, Tajdar-Oranj B, Peivasteh-roudsari L, Mohajer A, Behzadi R. The Effect of Borage (Echium amoenum) on the Mouse Heart and Hematology Parameters. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2019;19(2):154-9.
26. Naseri N, Kalantar K, Amirghofran Z. Anti-inflammatory activity of Echium amoenum extract on macrophages mediated by inhibition of inflammatory mediators and cytokines expression. Res Pharm Sci. 2018;13(1):73-81.
27. Huang Y, Xia Y, Tao Y, Jin H, Ji C, Aniagu S, et al. Protective effects of resveratrol against the cardiac developmental toxicity of trichloroethylene in zebrafish embryos. Toxicology. 2021;452:152697.
28. Mauray A, Felgines C, Morand C, Mazur A, Scalbert A, Milenkovic D. Bilberry anthocyanin-rich extract alters expression of genes related to atherosclerosis development in aorta of apo E-deficient mice. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2012;22(1):72-80.
29. Li M, Cao X, Yan H, Wang M, Tashibolati A, Maiwulanjiang M. Integrating Zebrafish Model to Screen Active Ingredients and Network Pharmacology Methods to Explore the Mechanism of Lavandula angustifolia Therapy for Alzheimer's Disease. ChemistrySelect. 2022;7(28):e202201364.
30. Xiaoyan L, Li C, Liu T, Ke H, Gong X, Wang Q, et al. Chemical analysis, pharmacological activity and process optimization of the proportion of bilobalide and ginkgolides in Ginkgo biloba extract. J Pharm Biomed Anal. 2018;160:46-54.

نص كامل:



زیست­شناسی جانوري، سال هجدهم، شماره اول، پاییز 1404، صفحات 122-109، صلح­جویی و همکاران

 

 

Effect of Echium amoenum Extracts on the Development of Cardiovascular System of Zebrafish Embryos and Expression of Nkx2-5, ApoE, and Tbx5 Genes Using the Real-Time PCR Method

 

Rozhin Solhjoei1, Tahereh Naji1*, Saeed Mohammadi Motamed2, Nikoo Nasoohi1

 

1- Department of Basic Sciences, TeMS.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran

2- Department of Pharmacognosy, TeMS.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran

*Corresponding author: [e-mail]

Received: 01 May 2025                                 Accepted: 11 August 2025

DOI: 10.60833/ascij.2025.1210947

 

Abstract

Cardiovascular disorders rank among the top leading causes of death on a global scale. Increasing interest has emerged in bioactive plant compounds for the potential support of cardiovascular-related health outcomes. This study assessed the cardiovascular development of zebrafish (Danio rerio) embryos and the expression of Nkx2-5, ApoE, and Tbx5 genes with unrefined Echium amoenum extract. The extract was produced through maceration with 70% ethanol, and zebrafish embryos were treated with concentrations of 7.8 to 125 µg/mL concentration of the extract. Morphological indices of zebrafish embryos, application of cardiac histology, and expression of genes through Real-time PCR. The results demonstrated that at low to moderate concentration levels (7.8 to 62.5 µg/mL), the extract produced an upregulation of zebrafish embryos expression of target genes and more advanced cardiac development. In higher concentration (125 μg/mL), the embryos did not develop, displayed a body curvature, and signs of oxidative stress. Examination of histology showed that at subtoxic concentrations, the zebrafish heart tissue appeared histologically normal in its architecture and showed no signs of acute toxicity. Overall, this study supports that Echium amoenum extract and other natural products may act as a potential natural source of cardiovascular support by enhancing gene expression at an embryonic stage of cardiac development. Future studies need to be organized to assess the safety margins of Echium amoenum and verify its efficacy in adult models and clinical studies.

 

Keywords: Nkx2-5, ApoE, Tbx5, Echium amoenum, Zebrafish embryo, Cardiovascular system, Real-time PCR. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقاله پژوهشی

 

اثر عصاره گل گاوزبان (Echium amoenum) بر تکامل سیستم قلبی عروقی جنین گورخرماهی و ژن‌های ApoE، Nkx2-5 و Tbx5 با استفاده از روش Real-Time PCR

رژین صلح­جویی1، طاهره ناجی1*، سعید محمدی معتمد2، نیکو نصوحی1

1- گروه علوم پایه، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2- گروه فارماکوگنوزی، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت: 11/02/1404                          تاریخ پذیرش: 20/05/1404

DOI: 10.60833/ascij.2025.1210947

چکیده

اختلالات قلبی‌عروقی در میان علل اصلی مرگ‌ومیر در سطح جهانی قرار دارند. علاقه‌ مندی فزاینده‌ای به ترکیبات گیاهی زیست ‌فعال برای پشتیبانی بالقوه از پیامدهای سلامت مرتبط با قلب و عروق پدید آمده است. این مطالعه به بررسی رشد قلبی‌عروقی در جنین‌های گورخرماهی یا زبرافیش (Danio rerio) و بیان ژن‌های Nkx2-5،ApoE  و Tbx5 در پاسخ به عصاره تصفیه­‌نشده‌ی گل گاوزبان پرداخته است. این عصاره از طریق خیساندن با اتانول ۷۰ درصد تهیه شد و جنین‌های گورخرماهی با غلظت‌هایی از 8/7 تا ۱۲۵ میکروگرم/میلی­لیتر از عصاره تیمار شدند. شاخص‌­های مورفولوژیکی جنین‌های گورخرماهی، بررسی بافت‌شناسی قلب و بیان ژن‌ها با استفاده از روش Real-time PCR  مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در غلظت‌های پایین تا متوسط (8/7 تا 5/62 میکروگرم/میلی­لیتر)، عصاره باعث افزایش بیان ژن‌های هدف در جنین‌های گورخرماهی و رشد پیشرفته­‌تر قلب شد. در غلظت‌های بالاتر (۱۲۵ میکروگرم/میلی­لیتر)، جنین‌ها رشد نکردند، دچار انحنای بدنی شدند و نشانه­‌هایی از استرس اکسیداتیو نشان دادند. بررسی­‌های بافت­‌شناسی نشان داد که در غلظت‌های زیر سمی، بافت قلب زبرافیش از نظر ساختار بافتی طبیعی به نظر می‌رسد و هیچ نشانه‌ای از سمیت حاد وجود ندارد. در مجموع، عصاره گل گاوزبان و سایر فرآورده‌های طبیعی ممکن است با افزایش بیان ژن در مراحل جنینی رشد قلب، به عنوان یک منبع طبیعی بالقوه برای پشتیبانی قلبی‌عروقی عمل کنند. مطالعات آینده باید برای ارزیابی حاشیه ایمنی گل گاوزبان و تأیید اثربخشی آن در مدل­‌های بالغ و مطالعات بالینی برنامه‌ریزی شوند.

کلمات کلیدی: گل گاوزبان، جنین گورخرماهی،Nkx2-5 ،ApoE ، Tbx5، Real-time PCR.

مقدمه

 

بیماری‌های قلبی‌عروقی عامل نزدیک به ۳۰ درصد از مرگ‌­ومیرهای جهانی هستند و به این ترتیب، اصلی‌ترین علت مرگ در سراسر جهان محسوب می‌شوند. شواهد قابل‌توجهی وجود دارد که نشان می‌دهد استرس اکسیداتیو یکی از عوامل مهم در بروز بیماری‌­های قلبی‌عروقی است. این نقش از طریق تأثیر بر اختلال عملکرد اندوتلیال، پراکسیداسیون لیپیدها، التهاب و آترواسکلروز (تشکیل پلاک‌­های چربی در رگ­‌ها) ایفا می‌شود (1-3). در تلاش برای یافتن مداخلات طبیعی و ایمن‌تر، تمرکز فزاینده‌ای بر استفاده از ترکیبات زیست­‌فعال گیاهی (مانند فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها) که دارای خواص آنتی­‌اکسیدانی و ضدالتهابی هستند، وجود دارد. یکی از گیاهان خاص در این زمینه، گل گاوزبان (Echium amoenum) است که سابقه­‌ای طولانی در طب سنتی ایرانی دارد و به عنوان گیاهی محافظ عروق و تقویت‌کننده قلب شناخته می‌شود. گلبرگ­‌های این گیاه عمدتاً حاوی آنتوسیانین­‌ها (نظیر سیانیدین و دلفینیدین) و اسید رزماری هستند (4-6). داده‌های برون­تنی (in vitro) شواهدی از اثرات سیتوپروتکتیو (محافظت از سلول‌ها) گل گاوزبان ارائه می‌دهند: صفائیان و همکاران (2015) (5) گزارش کردند که عصاره­های غنی از آنتوسیانین گل گاوزبان موجب افزایش زنده­مانی سلول‌های اندوتلیال ورید نافی انسان (HUVECs) تحت استرس H2O2 شدند، سطح هیدروپراکسید را کاهش دادند و ظرفیت آنتی ‌اکسیدانی (FRAP) را افزایش دادند؛ همه این موارد بدون بروز سمیت سلولی تا غلظت ۱۰۰۰ میکروگرم/میلی‌­لیتر مشاهده شد. این داده‌­ها نشان‌دهنده توان قابل‌توجه عصاره در محافظت از سلول‌های اندوتلیال در شرایط استرس اکسیداتیو هستند. مکانیسم‌­های مولکولی به‌ویژه در ارتباط با رشد قلب، هنوز به طور کافی بررسی نشده‌اند. مدل جنینی گورخرماهی یا زبرافیش (Danio rerio) یک سیستم تحقیقاتی قدرتمند محسوب می‌شود، زیرا دارای روند رشد شفاف، اندام‌زایی سریع و شباهت ژنتیکی بالایی با انسان (~۷۰ درصد) است. در فاصله‌ی ۴۸ تا ۷۲ ساعت پس از لقاح، قلب این موجود شکل می‌گیرد و این امکان فراهم می‌شود تا رشد قلبی، سمیت‌زایی قلبی یا محافظت قلبی را به‌صورت پویا در این گونه بررسی کنیم (3-5، 7). عوامل رونویسی اصلی قلب که در این بازه زمانی فعال هستند عبارت‌اند از: Nkx2-5 یک فاکتور رونویسی مهم و محافظت‌ شده است که در مراحل اولیه رشد قلب نقش اساسی دارد. این ژن به ‌عنوان اولین نشانگر سلول‌های پیش­‌ساز قلب شناخته می‌شود و در تمایز کاردیومیوسیت‌­ها، ساختار قلبی و سیستم هدایت الکتریکی مؤثر است. Nkx2-5 با تنظیم ژن‌هایی مانند GATA4، TBX5 و مسیرهای BMP، Wnt و Notch عمل می‌کند. همچنین، مطالعات اخیر نشان داده‌اند که این ژن در بازسازی قلب بالغ پس از آسیب نیز نقش دارد و اختلال در آن موجب کاهش ترمیم و تکثیر سلولی می‌شود (8، 9). جهش­های ژن Nkx2-5 به‌عنوان یکی از عوامل ژنتیکی مهم در ایجاد نقایص مادرزادی قلبی (مانند نقص­‌های دیواره‌ای، اختلالات هدایت الکتریکی و...) شناسایی شده‌اند و بدین ترتیب نقش تعیین‌کننده ‌ای در رشد و بیماری‌­های قلبی‌عروقی ایفا می‌کند.آپولیپوپروتئین E (ApoE) یک پروتئین مهم در انتقال لیپیدهاست که نقش تسهیل‌کننده‌ای در پاک­‌سازی چربی­‌ها ایفا می‌کند. این پروتئین با حذف لیپوپروتئین­‌های غنی از تری‌گلیسیرید و کلسترول از گردش خون، به حفظ هموستاز لیپید پلاسما کمک می‌کند. از یک سو، ApoE به‌ عنوان گیرنده‌ای مهم برای لیپوپروتئین­‌ها در پاک­سازی چربی­ها عمل می‌کند و از سوی دیگر، در سلامت عروق نیز نقش دارد؛ این نقش از طریق تنظیم التهاب، خروج کلسترول (cholesterol efflux) و حفظ یکپارچگی اندوتلیال از راه سیگنال‌دهی گیرنده‌-واسطه انجام می‌شود. کمبود ApoE یا داشتن ایزوفرم­‌های پرخطر مانند ε4 با افزایش LDL، آترواسکلروز و اختلال عملکرد عروقی مرتبط است (10-13). Tbx5 یک فاکتور رونویسی مهم از خانواده T-box است که برای مورفوژنز قلب، تشکیل حفره‌­های قلبی، سپتاسیون (جدا شدن حفره‌­ها) و تشکیل سیستم هدایتی قلب ضروری است. Tbx5 در مراحل اولیه رشد در نواحی قلب­‌ساز اولیه که دهلیزها و بطن­‌ها را تشکیل می‌دهند، بیان می‌شود. از بین رفتن ژن Tbx5a منجر به نقایص شدید در خم شدن قلب و ساختار حفره‌ای آن می‌شود (فنوتیپ معروف به Heartstring). در پستانداران نیز سلول‌های پیش­‌ساز بیان‌کننده Tbx5 در ساخت میوکارد و بافت هدایتی الکتریکی قلب نقش دارند، بنابراین Tbx5 برای توسعه ساختاری و عملکرد الکتریکی قلب حیاتی است. اختلال در عملکرد Tbx5 منجر به نقایص مادرزادی قلبی مانند نقایص دیواره­‌ای (سپتوم) و اختلالات در سیستم هدایتی می‌شود (14-16). اختلال در عملکرد هر یک از این ژن‌ها می‌تواند منجر به نقایص مادرزادی قلبی یا افزایش ریسک بیماری­‌های قلبی‌عروقی شود (17، 18). هدف این تحقیق، بررسی تأثیرات وابسته به دوز عصاره گل گاوزبان (Echium amoenum) بر رشد قلب در جنین گورخرماهی است. این ارزیابی از طریق بررسی بیان ژن‌های Nkx2-5، Tbx5 و ApoE با استفاده از روش qRT-PCR انجام می‌شود. همچنین، تعیین دوز کشنده ۵۰ درصد (LD₅₀)، پاسخ به استرس اکسیداتیو و بررسی مسیرهای سیگنال‌ دهی مهم قلبی از جمله Wnt، Notch و BMP نیز در این مطالعه مد نظر قرار دارد.

مواد و روش­ها

مواد مورد استفاده در این مطالعه شامل گیاهان گل گاوزبان (Echium amoenum) و گل میخک (Eugenia caryophyllata) از عطاری‌ های محلی و گورخرماهی­‌های بالغ (Danio rerio) از مرکز پرورش ماهیان زینتی بود. جنین‌های زبرا در محیط E3 (پارس طوس) نگهداری و با غذای خشک فلووال و آرتمیا تغذیه شدند. مواد شیمیایی مورد استفاده شامل اتانول ۷۰، ۹۵ و ۱۰۰ درصد، ایزوپروپانول، دی­‌متیل ‌سولفوکساید (DMSO)، کلروفرم و زایلن (مرک) بودند. در آزمایش‌های مولکولی از محلول TRIzol (کالازیست)، آب بدون آنزیم RNase (DEPC)، آب دیونیزه و مقطر (سینوهه)، و محلول RNAlater (سیناکلون) استفاده شد. سنتز cDNA با کیت Thermo Scientific و پرایمر رندوم هگزامر (سیناکلون) انجام شد. برای qRT-PCR از پرایمرهای اختصاصی ژن‌های Nkx2-5، Tbx5، ApoE و GAPDH (سیناکلون) و مسترمیکس PCR (پارس طوس) استفاده شد. الکتروفورز ژل با استفاده از پودر آگارز و بافر TBE (سینوهه) انجام شده و رنگ‌آمیزی با DNA Green Viewer (پارس طوس) صورت گرفت. در رنگ‌آمیزی بافت ‌شناسی نیز از پارافرمالدئید ۴ درصد، پارافین (سینوهه) و رنگ­‌های هماتوکسیلین و ائوزین (سیناکلون) استفاده شد.

تهیه عصاره گیاه گل گاوزبان (Echium amoenum): شکوفه‌­های گل گاوزبان ایرانی (Echium amoenum Fisch. & C.A. Mey) در فصل رشد بهار 2024 از منطقه البرز ایران جمع­‌آوری شدند. این گیاه از نظر طبقه‌ بندی، از گروه گیاه ‌شناسی، شناسایی شد و یک نمونه آزمایشی در هرباریوم دانشکده علوم دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد پزشکی تهران، با شماره آزمایشی 347-PMP/A نگهداری شد. گلبرگ­‌ها در دمای اتاق در سایه خشک، آسیاب و به پودر تبدیل شدند و 10 گرم پودر با استفاده از استخراج‌کننده سوکسله با 100 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد به مدت 6 ساعت استخراج شد. عصاره با استفاده از دستگاه تبخیر چرخشی در دمای 45 درجه سانتی‌گراد و فشار کاهش یافته فیلتر و تغلیظ شد. عصاره خام تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. تمام غلظت‌های کاری (62/15 تا 250 میکروگرم/میلی­‌لیتر) درست قبل از قرار گرفتن در معرض عصاره، به صورت تازه در محیط کشت جنینی E3 تهیه شدند.

نگهداری و جمع‌آوری جنین گورخرماهی: گورخر ماهی­های بالغ در سیستم پرورش آبزیان با گردش مجدد در دمای ۲۸٫۵ درجه سانتی‌گراد و با چرخه نوری ۱۴ ساعت روشنایی و ۱۰ ساعت تاریکی نگهداری شدند. جنین‌ها از طریق جفت‌گیری طبیعی به‌دست آمدند و بر اساس معیارهای استاندارد رشد، طبق توصیف Kimmel و همکاران (19) و Westerfield (20) مرحله‌بندی شدند. جنین‌هایی که در مرحله ۲ تا ۴ سلولی قرار داشتند و سالم تشخیص داده شدند، برای تیمار انتخاب شدند. تمامی مراحل آزمایش مطابق با تأییدیه کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم پزشکی تهران انجام گرفت (کد اخلاق: IR.IAU.PS.REC.1402.584).

الگوی تیمار و انتخاب دوزها: جنین‌ها با عصاره E. amoenum در غلظت‌های 62/15، 31.25، 5/62، 125 و 250 میکروگرم/میلی­لیتر در محیط کشت E3 که در پلیت­‌های 24 خانه‌ای (10 جنین در هر خانه، 3 تکرار در هر دوز) چیده شده بود، تیمار شدند و جنین‌های گروه کنترل فقط محیط کشت E3 را دریافت کردند. جنین‌ها به مدت 96 ساعت پس از کشت در دمای 5/28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و روزانه از نظر مرگ و میر، ناهنجاری و ضربان قلب ارزیابی شدند.

محاسبه دوز کشنده 50 درصد (LD50): بقای جنین هر ساعت پس از مواجهه ارزیابی شد. LD50 با استفاده از آنالیز پروبیت بر اساس مقادیر مرگ و میر 96 hpf در غلظت‌های مختلف تعیین شد.

استخراج RNA و سنتز cDNA: در ۷۲ hpf، کل RNA از ۲۵ جنین جمع‌آوری ‌شده در هر گروه درمانی با استفاده از معرف TRIzol® (Invitrogen) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. صحت RNA با الکتروفورز ژل آگارز یک درصد تأیید شد و غلظت آن با استفاده از اسپکتروفتومتر NanoDrop تعیین شد. سنتز cdDNA روی ۱ میکروگرم RNA با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول RevertAid (Thermo Fisher) انجام شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی در زمان واقعی (qRT-PCR): بیان ژن‌های Nkx2-5، Tbx5 و ApoE با استفاده از qRT-PCR مبتنی بر SYBR Green ارزیابی شد. پرایمرها با استفاده از Primer-BLAST (NCBI) طراحی و از یک ارائه ‌دهنده تجاری سفارش داده شدند. واکنش­ها در سیستم Bio-Rad CFX96 به­صورت سه‌تایی اجرا شدند. بیان نسبی ژن نسبت به β-actin نرمال ‌سازی و طبق روش 2^–ΔΔCt محاسبه شد.

تحلیل آماری: هر آزمایش در سه تکرار انجام شد. داده‌­ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) بیان شدند. از آنالیز واریانس یک­‌طرفه با آزمون تعقیبی توکی برای تعیین معنی‌داری آماری بین گروه‌ها استفاده شد (05/0p <). تمام تجزیه و تحلیل­‌های آماری با استفاده از GraphPad Prism 9.0 انجام شد.

نتایج

برای ارزیابی کمیت و خلوص RNA استخراج‌شده، نسبت جذب 260 به 280 اندازه‌گیری شد. این نسبت نشان‌دهنده خلوص اسید نوکلئیک است و مقدار مناسب برای RNA بین 8/1 تا 2 در نظر گرفته می‌شود (جدول 1). عصاره گل گاوزبان در دوزهای پایین تا متوسط ​​هیچ اثر مضری بر مورفولوژی جنین گورخرماهی نشان نداد؛ اما غلظت‌های بالاتر (5/62 و ۱۲۵ میکروگرم/میلی­لیتر) باعث تغییراتی مانند انحنای بدن و توقف رشد شدند. این اثرات وابسته به دوز و زمان بودند (شکل 1). افزایش وابسته به دوز و زمان در مرگ و میر جنین گورخرماهی با عصاره گل گاوزبان مشاهده شد (شکل 2). مرگ و میر در ۷۲ ساعت با غلظت ۱۲۵ میکروگرم/میلی­لیتر بیش از ۵۰ درصد بود. بر اساس مدل،LD50 ، 72 ساعته ۱۰۱ میکروگرم/میلی­لیتر تخمین زده شد. طبق شکل A 3 بافت قلب گروه کنترل بدون تغییر و بدون هیچ آسیب و التهابی همراه بود، بنابراین نمره آسیب هیستوپاتولوژیک صفر بود.مطابق شکل B 3 مقطع قلب جنین در گروه کنترل ساختار سالم و منظم با کاردیومیوسیت­‌های طبیعی بدون نشانه‌ای از آسیب یا التهاب را نشان داد و با امتیاز صفر آسیب بافتی مطابقت داشت. مطابق شکل C 3 در مقطع گروه LD50، ساختار قلب دچار اختلالاتی مانند کاهش نظم سلولی، افزایش فضای بین­‌سلولی و دژنراسیون کاردیومیوسیت­‌ها شده است. این تغییرات با امتیازهای آسیب بافتی (دژنراسیون ۳، نکروز ۲، التهاب ۲) مطابقت دارد و نشان‌ دهنده اثرات سمی عصاره در دوز بالا است. مطابق شکل D3، در مقطع قلب گروه LD50، نکروز، دژنراسیون و نواحی التهابی به‌وضوح مشاهده می‌شود. تخریب کامل کاردیومیوسیت­‌ها، از دست رفتن آرایش سلولی و تجمع سلول‌های التهابی نشان‌ دهنده آسیب شدید بافتی است که با امتیازهای ثبت ‌شده (دژنراسیون: ۳، نکروز: ۲، التهاب: ۲) مطابقت دارد.مطابق شکل E 3، در گروه زیر LD50، بافت قلبی دچار دژنراسیون خفیف تا متوسط شده، اما ساختار کلی حفظ شده و نشانه‌ای از نکروز یا التهاب دیده نمی‌شود. این بیانگر آسیب خفیف عصاره در دوزهای زیر LD50 است.مطابق شکل F 3، در گروه زیر LD50، دژنراسیون خفیف تا متوسط در میوکاردها مشاهده شد، اما بدون نشانه‌ای از نکروز یا التهاب. این تغییرات نشان‌ دهنده اثرات خفیف و غیرکشنده عصاره هستند، درحالی­که ساختار کلی قلب تا حد زیادی حفظ شده است. آنالیز BLAST نشان داد پرایمرهای طراحی‌شده اختصاصی هستند و فقط با ژن‌های هدف در ژنوم گورخرماهی هم‌ترازی دارند، بنابراین برای Real-time PCR مناسب و قابل اعتماد هستند (شکل 4). کیفیت RNA با ژل آگارز 2/1 درصد و کمیت آن با نانودراپ بررسی شد. وجود باندهای S 18 و S 28 ریبوزومی نشان‌دهنده سلامت و عدم تجزیه RNA بود (شکل 5). بیان ژن‌های Nkx2-5، ApoE و Tbx5 در غلظت‌های 5/62 و LD50 عصاره بررسی شد. نتایج با منحنی تکثیر در دستگاه Real-time PCR ثبت و در شکل 6 نمایش داده شد. افزایش فلورسانس در طول چرخه‌های PCR را نشان می‌دهد که مقدار Ct هر ژن را مشخص می‌کند. یکنواختی منحنی­ها در تکرارها و نبود سیگنال غیرطبیعی، صحت واکنش و اختصاصی بودن پرایمرها را تأیید می‌کند. شکل 7 نمودار مشتق تغییرات فلورسانس بر اساس دما را نشان می‌دهد که برای تأیید اختصاصی بودن تکثیر ژن‌ها استفاده شده است. وجود یک قله مشخص در دمای ثابت نشان‌دهنده تولید محصول اختصاصی و عدم وجود پرایمر-دایمر یا محصولات غیراختصاصی است. شباهت قله‌ ها در نمونه‌ها بیانگر دقت و تکرارپذیری بالای واکنش PCR می‌باشد. شکل 8 بیان ژن ApoE را در گروه‌های تیماری مختلف نشان می‌دهد. در غلظت زیر LD50، افزایش معناداری در بیان ژن نسبت به کنترل مشاهده شد (0001/0p < )، اما در گروه LD50 کاهش نسبی دیده شد که از نظر آماری معنادار نبود. این نتایج نشان می‌دهد غلظت‌های پایین عصاره موجب افزایش بیان ApoE می‌شوند، در حالی­که دوزهای بالاتر ممکن است اثر مهارکننده داشته باشند. شکل 9 نشان می‌دهد که بیان ژن Tbx5 در گروه زیر LD50 به‌ طور معناداری افزایش یافته است (001/0p < )، درحالی‌که در گروه LD50 کاهش چشمگیری داشته و پایین‌تر از هر دو گروه دیگر بوده است (001/0p < ). این یافته‌ها بیانگر حساسیت بالای Tbx5 به دوز عصاره هستند؛ به ‌طوری‌که دوز پایین بیان را افزایش و دوز بالا آن را به ‌طور قابل توجهی کاهش داده است. بر اساس شکل 10، بیان ژن Nkx2-5 در گروه زیر LD50 به‌ طور معناداری افزایش یافته است (01/0p < )، درحالی­که در گروه LD50 کاهش قابل توجهی نشان داده است (001/0p <). این نتایج نشان می‌دهد که دوز پایین عصاره بیان این ژن را تحریک و دوز بالا آن را سرکوب می‌کند، که بیانگر حساسیت ژن Nkx2-5 به دوز و استرس محیطی است و احتمالاً در مسیرهای تکوینی قلب نقش دارد.

 

 

 

جدول 1- بررسی کمیت RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ

Table 1. Quantification of extracted RNA using Nanodrop

Sample	(μg/μl) Concentration	(260/280) OD
E	142.253	2.773
F	223.293	2.607
G	148.093	2.219
H	134.813	2.466

 

 

 

شکل1- ویژگی‌های مورفولوژیکی جنین گورخرماهی پس از درمعرض قرار گرفتن با عصاره Echium amoenum

Fig 1. Morphological characteristics of zebrafish embryos after exposure to Echium amoenum extract.

 

 

 

 

شکل 2- میزان مرگ ومیر در جنین گورخرماهی پس از تیمار در غلظت‌های مختلف با عصاره Echium amoenum

Fig 2. Mortality rate in zebrafish embryos after treatment with different concentrations of Echium amoenum extract

A

 

B

 

C

  

D

E

 

F

شکل 3- A. مقطع قلب گورخرماهی در گروه کنترل، B. مقطع قلب در گروه کنترل که میوکاردهای نرمال دیده می‌شود، C. مقطع قلب گورخرماهی در گروه LD50 که مقاطع آبشش و قلب دیده می‌شود، D. مقطع قلب در گروه LD50، E. مقطع گورخرماهی در گروه کمتر از LD50، F. مقطع قلب در گروه کمتر از LD50.

Fig 3. A. Cross-section of zebrafish heart in the control group B. Cross-section of the heart in the control group showing normal myocardium. C. Cross-section of zebrafish heart in the LD50 group showing gills and heart. D. Cross-section of the heart in the LD50 group. E. Cross-section of zebrafish in the less than LD50 group. F. Cross-section of the heart in the less than LD50 group.

 

C

B

A

 

شکل 4- Blast پرایمر های طراحی شده: A: Nkx2-5، B: Tbx5 و C: ApoE

Fig 4. Blast primers designed: A: Nkx2-5, B: Tbx5 and C: ApoE

 

شکل 5- باندهای حاصل از استخراج RNA بر روی ژل الکتروفورز

Fig 5. Bands from RNA extraction on gel electrophoresis

 

 

شکل 6- منحنی تکثیر ژن‌های Nkx2-5,ApoE و Tbx5

Fig 6. Proliferation curve of Nkx2-5, ApoE and Tbx5 genes

 

 

شکل 7- منحنی ذوب ژن‌های Nkx2-5، ApoE و Tbx5 پس از انجام واکنش qPCR

Fig 7. Melting curve of Nkx2-5, ApoE and Tbx5 genes after qPCR reaction

 

 

شکل 8- تغییرات بیان ژن ApoE تحت تأثیر تیمار با غلظت‌های مختلف، 5/62 و 101 میکروگرم/میلی­لیتر

Fig 8. Changes in ApoE gene expression under the influence of treatment with different concentrations, 62.5 and 101 micrograms/ml

 

 

شکل 9- تغییرات بیان ژن Tbx5 تحت تأثیر تیمار با غلظت‌های مختلف، 5/62 و 101 میکروگرم/میلی­لیتر

Fig 9. Changes in Tbx5 gene expression under the influence of treatment with different concentrations, 62.5 and 101 micrograms/ml

 

شکل 10. تغییرات بیان ژن Nkx2-5 تحت تأثیر تیمار با غلظت‌های مختلف، 5/62 و 101 میکروگرم/میلی­لیتر

Fig 10. Changes in Nkx2-5 gene expression under the influence of treatment with different concentrations, 62.5 and 101 μg/ml

 

 

بحث

 

نتایج این مطالعه نشان داد که غلظت‌های پایین­‌تر این عصاره به‌ طور معنی ‌داری بیان ژن‌های کلیدی Nkx2-5، Tbx5 و ApoE را افزایش می‌دهد (21). Nkx2-5 و Tbx5 از مهم‌ترین فاکتورهای رونویسی در تکوین قلب هستند؛ افزایش بیان آن­‌ها احتمالاً بیانگر تحریک روند تمایز کاردیومیوست­‌ها و پیشبرد شکل‌گیری ساختارهای قلبی است (22). به‌علاوه، ApoE نیز که در متابولیسم لیپید و انتقال چربی­‌ها نقش دارد، در حضور عصاره افزایش بیان نشان داد. افزایش ApoE می‌تواند حاکی از بهبود توان انتقال لیپید از زرده به رویان و تنظیم بهتر متابولیسم چربی طی رشد باشد (23). تأمین مناسب لیپید و کلسترول برای رشد قلبی عروقی مهم است و شاید در برخی موارد از تغییرات نامطلوب جلوگیری کند. برعکس، قبلاً نشان داده شده است که بیان پایین Nkx2-5 با ناهنجاری‌­های قلبی عروقی همراه است (24)؛ بنابراین، مشاهده افزایش بیان این ژن‌ها در حضور عصاره E. amoenum، نشان‌دهنده تأثیر حمایتی و تقویت‌کننده بر رشد طبیعی قلب است. در مقابل، اثر عصاره به غلظت عصاره بستگی داشت و در غلظت‌های بالا (بیشتر از 5/62 میکروگرم/میلی­لیتر)، افزایشی در بیان مشاهده نشد و بیان ژن‌ها همراه با وقوع ناهنجاری ‌های مورفولوژیکی و مرگ و میر بیشتر جنین کاهش یافت. این داده‌ها نشان می‌دهد که محدوده دوز مؤثر و اثر دووجهی (هورمتیک) عصاره، بین 0 تا 100 میکروگرم/میلی­لیتر است. آزمایشات نشان داد که دوزهایی که کم در نظر گرفته می‌شوند، ظاهراً فعالیت تحریکی و مفید دارند، درحالی­که دوزهای بالا ظاهراً اثر مهاری یا سمی بر رشد قلب دارند. با این حال، در نوزاد گورخرماهی که با دوز 100 میکروگرم/میلی­لیتر، که معادل LD₅₀ (حدود 101 میکروگرم/میلی­لیتر) است، دوز داده شده بود، هم سمیت قلبی تأیید نشد و هم بافت‌ شناسی هیچ تفاوت معنی­داری با گروه کنترل نشان نداد. تنها تغییر جزئی در این غلظت، واکوئله ‌شدن برخی سلول‌ها بود که می‌تواند نشانگر آغاز استرس سلولی در دوزهای بالا باشد. روی هم رفته، عدم مرگ بافت قلبی در دو دوز متوسط ​​نشان می‌دهد که عصاره E. amoenum می‌تواند اثرات مطلوب خود را تا حدی بدون ایجاد سمیت ساختاری اعمال کند. با این وجود، در دوزهای بالاتر باید احتیاط شود. گزارش شده است که مقادیر زیاد این گیاه باعث عوارض جانبی (مانند سمیت خونی و آسیب گلبول ‌های قرمز) می‌شود (25). پیکروزید (ترکیبات فنلی) و عملکرد آنتی­اکسیدانی معمولاً به سطوح بالای آنتوسیانین­‌های این گیاه (یعنی سیانیدین و دلفینیدین) نسبت داده می‌شود (5). اکسیداسیون بیش از حد، رشد قلب را مختل کرده و باعث آسیب بافتی می‌شود. بنابراین، در دسترس بودن ترکیبات آنتی ‌اکسیدانی در محیط جنینی احتمالاً از، از دست دادن بیان ژن‌های حیاتی جلوگیری کرده و پارامترهای مناسب‌تری را برای فعالیت مسیرهای سیگنالینگ رشد ایجاد می‌کند. پیش تیمار سلول‌های اندوتلیال با عصاره غنی از آنتوسیانین E. amoenum به طور قابل توجهی پراکسیدهای داخل سلولی و خارج سلولی را کاهش می‌دهد، درحالی­که ظرفیت آنتی‌اکسیدانی (FRAP) را نیز بهبود می‌بخشد (5). مواد مؤثر این گیاه می‌توانند وضعیت اکسیداتیو سلول‌ها را به نفع ترمیم فیزیولوژیکی و پسرفت مرگ سلولی تعدیل کنند. عصاره این گیاه بیان آنزیم­های التهابی iNOS و COX-2 و همچنین سیتوکین ‌های پیش ‌التهابی مانند TNF-α، IL-1β و IL-6 را در ماکروفاژهای تحریک‌ شده مهار می‌کند (26). مهار التهاب در محیط جنینی می‌تواند آسیب التهابی به بافت‌ های در حال رشد را کاهش داده و روند طبیعی رشد قلب را حفظ کند. بنابراین، افزایش بیان ژن‌های Nkx2-5 و Tbx5 توسط عصاره ممکن است از طریق کاهش سیگنال ‌های مهاری ناشی از استرس اکسیداتیو/التهابی که به طور معمول این ژن‌ها را مهار می‌کنند، ایجاد شود. جدا از خواص آنتی ‌اکسیدانی مستقیم، عصاره E. amoenum احتمالاً بر مسیرهای مولکولی که واسطه رشد قلب هستند، تأثیر می‌گذارد. به عنوان مثال، ترکیب پلی‌فنولی رسوراترول با فعال کردن مسیر دفاعی آنتی‌اکسیدانی Nrf2 و در عین حال مهار مسیرهای سمی، از نقص ‌های قلبی ناشی از سم در جنین‌های گورخرماهی محافظت می‌کند (27). آنتوسیانین­‌های موجود در گل گاوزبان نیز ممکن است مسیرهای مشابهی را آغاز کنند. به عبارت دیگر، این ترکیبات می‌توانند با تحریک فاکتورهای رونویسی تقویت‌کننده بقای سلولی (مانند Nrf2) بیان ژن‌های محافظ قلب را افزایش دهند و همزمان مسیرهای مضر مانند فعالیت بیش از حد فاکتورهای التهابی را مهار کنند. نتیجه نهایی این تنظیم دو مرحله­‌ای، هم تقویت برنامه ژنتیکی رشد قلب و هم افزایش یکپارچگی ساختاری-عملکردی قلب جنین است. نتایج این مطالعه با مطالعات قبلی در مورد پیامدهای قلبی عروقی عصاره‌های گیاهی غنی از آنتی­‌اکسیدان مطابقت دارد. از دیرباز گل گاوزبان برای بیماری­‌های قلبی و اختلالات گردش خون مورد استفاده قرار گرفته است و از آن زمان تاکنون برخی از تحقیقات فراتر از توصیف خواص آن پرداخته‌اند (26). به عنوان مثال، آنتوسیانین‌­های موجود در انواع توت­‌ها (مانند زغال‌اخته) از طریق مدل‌­های حیوانی و با تعدیل بیان ژن‌های دخیل در استرس اکسیداتیو، التهاب و رگ‌زایی، اثرات ضد تصلب شرایین را نشان داده‌اند (28). در موش‌های فاقد ژن ApoE، مکمل آنتوسیانین زغال اخته توانست بیان صدها ژن را در آئورت تعدیل کرده و پیشرفت تصلب شرایین را کند نماید (28). این تغییرات شامل کاهش بیان آنزیم‌ های اکسیداتیو (مانند Aox1، Cyp2e1) و چسبندگی سلولی (مانند Jam-A) و افزایش بیان ژن‌های اتصال بین سلولی بود که همگی نشان‌ دهنده تشکیل یک محیط ضد التهابی و عاری از استرس اکسیداتیو در دیواره رگ بودند (28). اگرچه مدل ما ممکن است متفاوت باشد (یعنی رشد جنینی)، افزایش بیان ژن‌های Nkx2-5، Tbx5 و ApoE با عصاره گل گاوزبان ممکن است بخشی از همان پاسخ محافظتی قلبی عروقی مرتبط با فعالیت ترکیبات آنتی ‌اکسیدانی/ضد التهابی باشد. برعکس، نتایج ما از این واقعیت پشتیبانی می‌کند که عصاره‌های غنی از پلی‌ فنول نه تنها در پیشگیری از بیماری­‌های قلبی در بزرگسالان مفید هستند، بلکه می‌توانند نقش مثبتی در مسیرهای رشد قلبی در مراحل جنینی داشته باشند. مطالعه لی و همکاران (29) نشان داد که ترکیبات غیراساسی اسطوخودوس در مدل آلزایمر گورخرماهی باعث بهبود علائم از طریق مسیرهای التهابی و متابولیکی شدند. مطالعه حاضر اثرات عصاره Echium amoenum را بر تکامل قلب جنین بررسی کرد. هر دو مطالعه کارایی مدل زبرا را در غربالگری دارویی و نقش دوزمحور ترکیبات طبیعی در بهبود عملکرد اندام­‌ها تأیید می‌کنند. عصاره جینکو بیلوبا در دوزهای پایین برای جنین‌های گورخرماهی بی‌خطر بود، اما دوز عصاره مضر بود و منجر به کاهش بقا و رشد شد. دوزهای پایین/متوسط ​​رشد را افزایش می‌دهند، سپس با دوزهای بالا رشد کاهش می­‌یابد (30). هم شیائویان و همکارانش و هم مطالعه ما تأیید کردند که اثربخشی و سمیت عصاره­های گیاهی هر دو به دوز و میلی­گرم/لیتر مواد مؤثر اولیه عصاره­‌ها وابسته هستند. در مطالعه حاضر، عصاره‌­های غلیظ شده با دوزهای پایین گل گاوزبان، بیان قلبی را افزایش داده و از بافت محافظت کردند، در الی­که غلظت‌های بالای عصاره اثر معکوس داشتند و باعث آسیب و کاهش بیان ژن شدند. این امر منجر به این نتیجه می‌شود که برای به دست آوردن فواید درمانی یک عصاره گیاهی، باید دوز و میلی­گرم/لیتر بهینه از مواد مؤثر نیز تعریف شود.

نتیجه­گیری 

عصاره گل گاوزبان در دوزهای کم تا متوسط ​​(8/7-5/62 میکروگرم/میلی­‌لیتر) اثرات مثبتی بر رشد قلبی عروقی جنین‌های گورخرماهی دارد. تعیین توالی رونوشت­ها نشان داد که تجزیه و تحلیل PCR افزایش قابل توجهی در بیان Nkx2-5، ApoE و Tbx5 در گروه‌های تحت درمان در مقایسه با گروه کنترل نشان داد. Nkx2-5، ApoE و Tbx5 تنظیم‌کننده‌های رونویسی برای تمایز کاردیومیوسیت­ها، حفرات قلب و متابولیسم لیپید هستند که نشان می‌دهد این عصاره مسیرهای مولکولی لازم برای رشد قلب را تحریک می‌کند. در دوزهای زیر کشنده، بافت قلب هیچ آسیب ساختاری آشکاری نشان نداد و معماری طبیعی خود را حفظ کرد. اگرچه عصاره گل گاوزبان اثرات مفید و رشدی را در غلظت‌های پایین نشان می‌دهد، اما این رشد احتمالاً در نتیجه استرس اکسیداتیو و اختلال در متابولیسم در دوزهای بالاتر به اوج خود می­رسد و به چیزی کشنده تبدیل شود. مدل جنین گورخرماهی به دلیل اندازه کوچک، ماهیت شفاف، رشد سریع و توانایی انجام ژنوتیپینگ و ارزیابی­‌های بافت‌شناسی، مدل بسیار خوبی برای غربال­گری محصولات طبیعی است.

تشکر و قدردانی

بدین­وسیله از دانشکده علوم دارویی دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی تهران که امکان انجام این پژوهش را فراهم­ کرده­است (کد رهگیری پایان­نامه: 162810713)، تشکر و قدردانی می­شود.

منابع

1. World Health Organization. Cardiovascular diseases (CVDs). 2021 [Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/ detail/cardiovascular-diseases-(cvds)] (Accessed 2 July 2025).

2. Mendis S, Graham I, Narula J. Addressing the Global Burden of Cardiovascular Diseases; Need for Scalable and Sustainable Frameworks. Glob Heart. 2022;17(1):48.

3. Jin J, Boersch M, Nagarajan A, Davey AK, Zunk M. Antioxidant Properties and Reported Ethnomedicinal Use of the Genus Echium (Boraginaceae). Antioxidants (Basel). 2020;9(8):722.

4. Liu C, Huang Y. Chinese Herbal Medicine on Cardiovascular Diseases and the Mechanisms of Action. Front Pharmacol. 2016;7:469.

5. Safaeian L, Haghjoo Javanmard S, Ghanadian M, Seifabadi S. Cytoprotective and antioxidant effects of Echium amoenum anthocyanin-rich extract in human endothelial cells (HUVECs). Avicenna J Phytomed. 2015;5(2):157-66.

6. Jafari H, Mokaberinejad R, Raeis-Abdollahi E. Echium amoenum from viewpoint of Avicenna: a brief review. Journal of Contemporary Medical Sciences. 2018;4(4):187-90.

7. Pena-Martinez EG, Pomales-Matos DA, Rivera-Madera A, Messon-Bird JL, Medina-Feliciano JG, Sanabria-Alberto L, et al. Prioritizing cardiovascular disease-associated variants altering NKX2-5 and TBX5 binding through an integrative computational approach. J Biol Chem. 2023;299(12):105423.

8. Colombo S, de Sena-Tomas C, George V, Werdich AA, Kapur S, MacRae CA, et al. Nkx genes establish second heart field cardiomyocyte progenitors at the arterial pole and pattern the venous pole through Isl1 repression. Development. 2018;145(3).

9. De Sena-Tomas C, Aleman AG, Ford C, Varshney A, Yao D, Harrington JK, et al. Activation of Nkx2.5 transcriptional program is required for adult myocardial repair. Nat Commun. 2022;13(1):2970.

10. Alagarsamy J, Jaeschke A, Hui DY. Apolipoprotein E in Cardiometabolic and Neurological Health and Diseases. Int J Mol Sci. 2022;23(17).

11. Islam S, Noorani A, Sun Y, Michikawa M, Zou K. Multi-functional role of apolipoprotein E in neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 2025;17:1535280.

12. Ismail AB, Balcioglu O, Ozcem B, Ergoren MC. APOE Gene Variation's Impact on Cardiovascular Health: A Case-Control Study. Biomedicines. 2024;12(3):695.

13. Mahley RW. Apolipoprotein E: from cardiovascular disease to neurodegenerative disorders. J Mol Med (Berl). 2016;94(7):739-46.

14. Li Y, Du J, Deng S, Liu B, Jing X, Yan Y, et al. The molecular mechanisms of cardiac development and related diseases. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):368.

15. Pezhouman A, Nguyen NB, Sercel AJ, Nguyen TL, Daraei A, Sabri S, et al. Transcriptional, Electrophysiological, and Metabolic Characterizations of hESC-Derived First and Second Heart Fields Demonstrate a Potential Role of TBX5 in Cardiomyocyte Maturation. Front Cell Dev Biol. 2021; 9:787684.

16. Siatra P, Vatsellas G, Chatzianastasiou A, Balafas E, Manolakou T, Papapetropoulos A, et al. Return of the Tbx5; lineage-tracing reveals ventricular cardiomyocyte-like precursors in the injured adult mammalian heart. NPJ Regen Med. 2023;8(1):13.

17. Garcia-Flores E, Rodriguez-Perez JM, Borgonio-Cuadra VM, Vargas-Alarcon G, Calderon-Colmenero J, Sandoval JP, et al. DNA Methylation Levels of the TBX5 Gene Promoter Are Associated with Congenital Septal Defects in Mexican Paediatric Patients. Biology (Basel). 2022;11(1):96.

18. McElhinney DB, Geiger E, Blinder J, Benson DW, Goldmuntz E. NKX2.5 mutations in patients with congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 2003;42(9):1650-5.

19. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 1995;203(3):253-310.

20. Westerfield M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio): University of Oregon Press; 2000.

21. Chahardehi AM, Arsad H, Lim V. Zebrafish as a Successful Animal Model for Screening Toxicity of Medicinal Plants. Plants (Basel). 2020;9(10).

22. Granados-Riveron JT, Pope M, Bu'lock FA, Thornborough C, Eason J, Setchfield K, et al. Combined mutation screening of NKX2-5, GATA4, and TBX5 in congenital heart disease: multiple heterozygosity and novel mutations. Congenit Heart Dis. 2012;7(2):151-9.

23. Otis JP, Zeituni EM, Thierer JH, Anderson JL, Brown AC, Boehm ED, et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 2015;8(3):295-309.

24. Li S, Li X, Zhao R, Jiang T, Ou Q, Huang H, et al. Esketamine induces embryonic and cardiac malformation through regulating the nkx2.5 and gata4 in zebrafish. Sci Rep. 2025;15(1):7187.

25. Sadighara P, Araghi A, Tajdar-Oranj B, Peivasteh-roudsari L, Mohajer A, Behzadi R. The Effect of Borage (Echium amoenum) on the Mouse Heart and Hematology Parameters. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2019;19(2):154-9.

26. Naseri N, Kalantar K, Amirghofran Z. Anti-inflammatory activity of Echium amoenum extract on macrophages mediated by inhibition of inflammatory mediators and cytokines expression. Res Pharm Sci. 2018;13(1):73-81.

27. Huang Y, Xia Y, Tao Y, Jin H, Ji C, Aniagu S, et al. Protective effects of resveratrol against the cardiac developmental toxicity of trichloroethylene in zebrafish embryos. Toxicology. 2021;452:152697.

28. Mauray A, Felgines C, Morand C, Mazur A, Scalbert A, Milenkovic D. Bilberry anthocyanin-rich extract alters expression of genes related to atherosclerosis development in aorta of apo E-deficient mice. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2012;22(1):72-80.

29. Li M, Cao X, Yan H, Wang M, Tashibolati A,

Maiwulanjiang M. Integrating Zebrafish Model to Screen Active Ingredients and Network Pharmacology Methods to Explore the Mechanism of Lavandula angustifolia Therapy for Alzheimer's Disease. ChemistrySelect. 2022;7(28):e202201364.

30. Xiaoyan L, Li C, Liu T, Ke H, Gong X, Wang Q, et al. Chemical analysis, pharmacological activity and process optimization of the proportion of bilobalide and ginkgolides in Ginkgo biloba extract. J Pharm Biomed Anal. 2018;160:46-54

122