اثر سایتوتوکسیک نانوذره اکسید آهن مگنتیک کنژوگه با تیمول روی رده سلولی سرطان کبد و ارزیابی بیان ژن کاسپاز 8
الموضوعات :علی صالح زاده 1 , یاسمن علیزاده کلنگستانی 2
1 - دانشیار ، گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
2 - دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست‌شناسی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز ، ایران
الکلمات المفتاحية: اکسید آهن, تیمول, سرطان کبد, فلوسایتومتری,
ملخص المقالة :
مقدمه: استفاده از نانوذرات مغناطیسی برای دارورسانی مؤثر به بافت‌های سرطانی مورد توجه قرار گرفته است. این مطالعه با هدف تعیین اثرات ضدسرطانی نانوذرات اکسید آهن مگنتیک عامل دار شده با گلوکز و کنژوگه با تیمول (Fe3O4@Glu-Thymol NPs) بر سلول‌های رده سرطان کبد انجام شد.
مواد و روش‌ها: آزمایش‌های فیزیکوشیمیایی شامل FT-IR، XRD، EDS، تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی، DLS، و پتانسیل زتا به منظور تعیین گروه‌های عاملی، ساختار کریستالی، شکل، اندازه، و بار سطحی نانوذرات انجام شد. اثرات سیتوتوکسیک نانوذرات بر سلول‌های رده سرطان کبد (HepG2) و رده نرمال (HDF) با آزمایش MTT بررسی شد. آزمایش فلوسایتومتری به منظور تعیین درصد سلول‌های آپوپتوزی و real-time PCR برای تعیین میزان بیان ژن کاسپاز-8 استفاده شد.
یافته‌ها: نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol دارای شکل کروی، ابعاد کمتر از 60 نانومتر، بار سطحی 5/13- میلی ولت و قطر هیدرودینامیک 515 نانومتر بودند. این نانوذرات دارای سمیت وابسته به غلظت برای سلول‌های سرطان کبد بودند و غلظت نیمه مهاری آنان در سلول‌های سرطانی و نرمال به ترتیب 5/67 و 175 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. آزمایش فلوسایتومتری نشان داد که نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش معنادار در میزان آپوپتوز سلولی اولیه و تأخیری شدند و بیان ژن کاسپاز-8 در سلول‌های تیمار شده به میزان 45/2 (p<0.001) برابر افزایش یافت.
نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان دهنده اثرات مهاری مؤثر نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol بر سلول‌های رده سرطان کبد بوده که می‌تواند در توسعه نانو داروهای مغناطیسی مؤثر به منظور دارورسانی هدفمند به بافت‌های سرطانی کبد کمک‌کننده باشد.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209–49. https://doi.org/10.3322/caac.21660
2. Anwanwan D, Singh SK, Singh S, Saikam V, Singh R. Challenges in liver cancer and possible treatment approaches. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1873(1):188314. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2019.188314
3. Gavas S, Quazi S, Karpiński TM. Nanoparticles for cancer therapy: current progress and challenges. Nanoscale Res Lett. 2021;16(1):173. https://doi.org/10.1186/s11671-021-03628-6
4. Vangijzegem T, Stanicki D, Laurent S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opin Drug Deliv. 2019;16(1):69–78. https://doi.org/10.1080/17425247.2019.1554647
5. Islam MT, Khalipha AB, Bagchi R, Mondal M, Smrity SZ, Uddin SJ, et al. Anticancer activity of Thymol: A literature‐based review and docking study with Emphasis on its anticancer mechanisms. IUBMB Life. 2019;71(1):9–19. https://doi.org/10.1002/iub.1935
6. Altintas F, Tunc-Ata M, Secme M, Kucukatay V. The anticancer effects of thymol on HepG2 cell line. Med Oncol. 2023;40(9):260. https://doi.org/10.1007/s12032-023-02134-2
7. Sahoo G, Samal D, Khandayataray P, Murthy MK. A review on caspases: key regulators of biological activities and apoptosis. Mol Neurobiol. 2023;60(10):5805–37. https://doi.org/10.1007/s12035-023-03433-5
8. Habibzadeh SZ, Salehzadeh A, Moradi-Shoeili Z, Shandiz SA. Iron oxide nanoparticles functionalized with 3-chloropropyltrimethoxysilane and conjugated with thiazole alter the expression of BAX, BCL2, and p53 genes in AGS cell line. Inorg Nano-Metal Chem. 2023;53(2):191–8. https://doi.org/10.1080/24701556.2021.2025074
9. Hosseinkhah M, Ghasemian R, Shokrollahi F, Mojdehi SR, Noveiri MJ, Hedayati M, et al. Cytotoxic potential of nickel oxide nanoparticles functionalized with glutamic acid and conjugated with thiosemicarbazide (NiO@Glu/TSC) against human gastric cancer cells. J Clust Sci. 2022;33(5):2045–53. https://doi.org/10.1007/s10876-021-02124-2
10. Shahmoradi SS, Salehzadeh A, Ranji N, Habibollahi H. Trigger of apoptosis in human liver cancer cell line (HepG2) by titanium dioxide nanoparticles functionalized by glutamine and conjugated with thiosemicarbazone. 3 Biotech. 2023;13(6):195. https://doi.org/10.1007/s13205-023-03609-9
11. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45.
12. Faraji N, Mashkoor NR, Emamifar A, Ghamarsoorat F, Ghalehjoughi ZP, Bajgiran FA, et al. The Cytotoxic Effect of Cobalt Oxide Nanoparticle Conjugated by Menthol on Colorectal Cancer Cell Line and Evaluation of the Expression of CASP8 and FEZF1-AS1. J Clust Sci. 2025;36(2):39. https://doi.org/10.1007/s10876-024-02757-z
13. Chauhan AK, Bahuguna A, Paul S, Kang SC. Thymol elicits HCT-116 colorectal carcinoma cell death through induction of oxidative stress. Anti-Cancer Agents Med Chem. 2017;17(14):1942–50. https://doi.org/10.2174/1871520617666170327121228
14. Qoorchi Moheb Seraj F, Heravi-Faz N, Soltani A, Ahmadi SS, Shahbeiki F, Talebpour A, et al. Thymol has anticancer effects in U-87 human malignant glioblastoma cells. Mol Biol Rep. 2022;49(10):9623–32. https://doi.org/10.1007/s11033-022-07867-3
15. Jamali T, Kavoosi G, Safavi M, Ardestani SK. In-vitro evaluation of apoptotic effect of OEO and thymol in 2D and 3D cell cultures and the study of their interaction mode with DNA. Sci Rep. 2018;8(1):15787. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34055-w
16. Li Y, Wen JM, Du CJ, Hu SM, Chen JX, Zhang SG, et al. Thymol inhibits bladder cancer cell proliferation via inducing cell cycle arrest and apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2017;491(2):530–6. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.04.009
17. Altintas F, Tunc-Ata M, Secme M, Kucukatay V. The anticancer effects of thymol on HepG2 cell line. Med Oncol. 2023;40(9):260. https://doi.org/10.1007/s12032-023-02134-2
18. Mandal R, Barrón JC, Kostova I, Becker S, Strebhardt K. Caspase-8: The double-edged sword. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1873(2):188357. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2020.188357
19. Adilakshmi B, Reddy OS, Hemalatha D, Rao KS, Lai WF. ROS-generating poly (Ethylene Glycol)-Conjugated Fe3O4 nanoparticles as cancer-targeting sustained release carrier of doxorubicin. Int J Nanomedicine. 2022;17:4989–5004. https://doi.org/10.2147/IJN.S379200
20. Haghighi A, Shahanipour K, Monajemi R, Yazdanpanahi N, Fouladgar M. Evaluation of the Cytotoxic Effect of Thymol Loaded Albumin-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles on MDA-MB-231 Cell Line and the Expression of Autophagic MAP1LC3A Gene. Pharm Chem J. 2023;57(4):486–500. https://doi.org/10.1007/s11094-023-02910-4
21. Papalazarou V, Maddocks OD. Supply and demand: Cellular nutrient uptake and exchange in cancer. Mol Cell. 2021;81(18):3731–48. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.026
22. Sofi MA, Sunitha S, Sofi MA, Pasha SK, Choi D. An overview of antimicrobial and anticancer potential of silver nanoparticles. J King Saud Univ Sci. 2022;34(2):101791. https://doi.org/10.1016/j.jksus.2021.101791
23. Raza MH, Siraj S, Arshad A, Waheed U, Aldakheel F, Alduraywish S, et al. ROS-modulated therapeutic approaches in cancer treatment. J Cancer Res Clin Oncol. 2017;143:1789–809. https://doi.org/10.1007/s00432-017-2464-9
اثر سایتوتوکسیک نانوذره اکسید آهن مگنتیک کنژوگه با تیمول روی رده سلولی سرطان کبد و ارزیابی بیان ژن کاسپاز 8
یاسمن علیزاده کلنگستانی1 ، علی صالح‌زاده 2*
1. دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست‌شناسی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز ، ایران
2- دانشیار ، گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
محل انجام تحقیق: آزمایشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت
ارسال: 3/4/1404
بازنگری 6/5/1404
پذیرش : 7/5/1404
* نویسنده مسؤل: a.salehzadeh@iau.ac.ir
چکیده
مقدمه: استفاده از نانوذرات مغناطیسی برای دارورسانی مؤثر به بافت‌های سرطانی مورد توجه قرار گرفته است. این مطالعه با هدف تعیین اثرات ضدسرطانی نانوذرات اکسید آهن مگنتیک عامل دار شده با گلوکز و کنژوگه با تیمول (Fe3O4@Glu-Thymol NPs) بر سلول‌های رده سرطان کبد انجام شد.
مواد و روش‌ها: آزمایش‌های فیزیکوشیمیایی شامل FT-IR، XRD، EDS، تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی، DLS، و پتانسیل زتا به منظور تعیین گروه‌های عاملی، ساختار کریستالی، شکل، اندازه، و بار سطحی نانوذرات انجام شد. اثرات سیتوتوکسیک نانوذرات بر سلول‌های رده سرطان کبد (HepG2) و رده نرمال (HDF) با آزمایش MTT بررسی شد. آزمایش فلوسایتومتری به منظور تعیین درصد سلول‌های آپوپتوزی و real-time PCR برای تعیین میزان بیان ژن کاسپاز-8 استفاده شد.
یافته‌ها: نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol دارای شکل کروی، ابعاد کمتر از 60 نانومتر، بار سطحی 5/13- میلی ولت و قطر هیدرودینامیک 515 نانومتر بودند. این نانوذرات دارای سمیت وابسته به غلظت برای سلول‌های سرطان کبد بودند و غلظت نیمه مهاری آنان در سلول‌های سرطانی و نرمال به ترتیب 5/67 و 175 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. آزمایش فلوسایتومتری نشان داد که نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش معنادار در میزان آپوپتوز سلولی اولیه و تأخیری شدند و بیان ژن کاسپاز-8 در سلول‌های تیمار شده به میزان 45/2 (p<0.001) برابر افزایش یافت.
نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان دهنده اثرات مهاری مؤثر نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol بر سلول‌های رده سرطان کبد بوده که می‌تواند در توسعه نانو داروهای مغناطیسی مؤثر به منظور دارورسانی هدفمند به بافت‌های سرطانی کبد کمک‌کننده باشد.
واژگان کلیدی: اکسید آهن؛ تیمول؛ سرطان کبد؛ فلوسایتومتری
Cytotoxic effect of magnetic iron oxide nanoparticles conjugated with thymol on liver cancer cell line and evaluation of caspase-8 gene expression
Yasaman Alizadeh Kolangestani1 , Ali Salehzadeh2*
1 MSc, Department of Biology, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran2 Associate professor, Department of Biology, Ra.C., Islamic Azad University, Rasht, Iran
*Corresponding author: a.salehzadeh@iau.ac.ir
Place of Research: Laboratory of Biology, Rasht University
Submitted: 24 ⁄ 6 ⁄ 2025
Revised: 28 ⁄ 7 ⁄ 2025
Accepted: 29 ⁄ 7 ⁄ 2025
Abstract
Introduction: The application of magnetic nanoparticles for effective drug delivery to cancer tissues has gained attention. This study was conducted to determine the anticancer effects of magnetic iron oxide nanoparticles functionalized with glucose and conjugated with thymol (Fe3O4@Glu-Thymol NPs) on a liver cancer cell line.
Materials and Methods: Physicochemical assays including FT-IR, XRD, EDS, scanning electron microscopy, DLS, and zeta potential were performed to determine the functional groups, crystal structure, shape, size, and surface charge of the nanoparticles. The cytotoxic effects of nanoparticles on the liver cancer cell line (HepG2) and normal cell line (HDF) were performed using MTT assay. Flow cytometry was used to determine the percentage of apoptotic cells and real-time PCR was used to assess the expression of the caspase-8 gene.
Results: Fe3O4@Glu-Thymol NPs had a spherical shape, diameter of less than 60 nm, a surface charge of -13.5mV, and a hydrodynamic diameter of 515nm. The nanoparticles exhibited concentration-dependent toxicity for liver cancer cells, and their IC50 in cancer and normal cell lines was 67.5 and 175 μg/mL, respectively. Flow cytometry showed that Fe3O4@Glu-Thymol NPs caused a significant increase in the percentage of early and late apoptosis, and the expression of the caspase-8 gene in treated cells increased by 2.45-fold (p<0.001).
Conclusion: The results of this study indicate the effective inhibitory effects of Fe3O4@Glu-Thymol NPs on liver cancer cells, which can be helpful in the development of effective magnetic nanodrugs for targeted drug delivery to liver cancer tissues.
Keywords: Iron oxide; Thymol; Liver cancer; Flow cytometry
مقدمه
سرطان کبد یکی از شایع‌ترین انواع سرطان است به طوری که با میزان اکتساب سالیانه حدود یک میلیون نفر، ششمین نوع شایع سرطان در نظر گرفته می‌شود. این بیماری از نرخ تلفات بسیار بالایی برخوردار است و سالانه بیش از 830 هزار مورد مرگ در اثر این بیماری در دنیا ثبت می‌شود، به طوری که پس از سرطان ریه، این بیماری به عنوان دومین نوع کشنده سرطان شناخته می‌شود (1). شیوع فزاینده و نرخ کشندگی بالای این بیماری نشان دهنده کارایی پایین روش‌های درمانی کنونی بر علیه این بیماری است. در سالیان گذشته درمان‌های دارویی متعددی برای این بیماری معرفی شده‌اند، با این حال بسیاری از این داروها یا از اثرگذاری قابل قبولی برخوردار نیستند و یا دارای اثرات جانبی و سمیتی زیادی هستند. به همین دلیل نیاز به روش‌های درمانی هدفمند، با کمترین آسیب به سلول‌های سالم، باعث شده است که توسعه نانوذرات مغناطیسی به‌عنوان حامل‌های دارویی و عوامل ضدسرطانی، مورد توجه ویژه قرار گیرد (2).
پیدایش فناوری نانو امیدهای زیادی را در زمینه طراحی داروهای جدید، بهینه‌سازی داروهای موجود و بهبود روش‌های دارو رسانی ایجاد کرده است. استفاده از نانو داروها می‌تواند بر برخی از مشکلات رایج شیمی درمانی مانند ناپایداری دارو درون بدن و پاک‌سازی سریع دارو، اثرات سمیتی ناخواسته، دسترسی زیستی و اثر بخشی محدود داروها غلبه کند. نانوذرات فلزی از جایگاه ویژه‌ای در مطالعات پژوهشی ضد سرطان برخوردار هستند. در سالیان اخیر مطالعات زیادی در مورد اثر ضدسرطانی نانوذرات مختلف فلزی مانند نقره، روی، کبالت، تیتانیوم و ... انجام شده است (3). نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن علاوه بر دارا بودن اندازه کوچک، سمیت پایین و زیست سازگاری قابل قبول، می‌توانند به منظور دارو رسانی هدفمند به بافت‌های توموری مورد استفاده قرار گیرند. هدایت مغناطیسی داروهای ضد سرطانی متصل به نانوذرات اکسید آهن می‌تواند از پراکنش ناخواسته ذرات در بدن جلوگیری کرده و با افزایش موضعی غلظت دارو در بافت‌های هدف سبب افزایش اثربخشی و کاهش اثرات سمیتی ناخواسته شیمی درمانی شود (4).
تیمول، یک مشتق فنلی مونوترپن طبیعی با نام شیمیایی 2-ایزوپروپیل-5-متیل فنول است. این ماده و مشتقات آن به طور گسترده در پزشکی، لوازم آرایشی، غذا و صنایع کشاورزی استفاده می‌شوند. تیمول فعالیت‌های بیولوژیکی متنوعی دارد، که از جمله می‌توان به اثرات آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی، ضدمیکروبی، ضد دیابتی و ... اشاره نمود. شواهد متعددی در دست هستند که نشان می‌دهند تیمول از اثرات ضد سرطانی قابل توجهی بر علیه رده‌های مختلف سلول‌های سرطانی برخوردار است. مطالعات پیشین نشان داده‌اند که تیمول و مشتقات آن فعالیت ضد سرطانی خود را از طریق مکانیسم‌های متعددی از جمله مهار رشد سلولی، القای آپوپتوز، افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن و فعال کردن پروتئین‌های محرک آپوپتوز مانند کاسپازها اعمال می‌کنند. با این حال، مشابه با بسیاری از فلاونوئیدهای طبیعی، تیمول از حلالیت آبی کمی برخوردار است، ویژگی‌ای که سبب کاهش دسترسی زیستی و کاربردهای دارویی این ماده می‌شود (5-6).
کاسپازها گروهی از پروتئین‌های با خاصیت پروتئازی هستند که در یک زنجیره آبشاری به دنبال یکدیگر فعال شده و با برش پروتئولیتیک پروتئین‌های سلولی سبب آغاز و پیشروی آپوپتوز می‌شوند. کاسپازهای -8 و -9 نقش کلیدی در شروع زنجیره واکنش‌های فعال‌سازی کاسپازها دارند و به ترتیب کاسپاز آغازگر در مسیرهای آپوپتوز بیرونی و درونی شناخته می‌شوند. با این حال، کاسپاز-8 به دلیل اثراتی که بر روی برخی پروتئین‌های ضدآپوپتوز دارد، می‌تواند در پیشروی مسیر بیرونی آپوپتوز نیز دخیل باشد (7). به همین دلیل، افزایش بیان و فعالیت این پروتئین یک شاخص کلیدی در القای آپوپتوز سلولی در نظر گرفته می‌شود.
تیمول، به‌عنوان یک ترکیب فنولی با خواص ضدسرطانی اثبات‌شده، می‌تواند در قالب نانوذرات اکسید آهن مغناطیسی به طور مؤثری به سلول‌های سرطانی منتقل شود. لذا این مطالعه با هدف سنتز و ارزیابی اثرات ضدسرطانی نانوذرات اکسید آهن مگنتیک کنژوگه با تیمول بر رده سلولی سرطان کبد و بررسی مکانیسم‌های مولکولی احتمالی آن انجام شد تا بتوان گامی در جهت توسعه نانو داروهای هدفمند و موثر برداشت.
مواد و روش‌ها
سنتز نانوذرات
به منظور سنتز نانوذرات اکسید آهن (Fe3O4)، در ابتدا 57/7 گرم FeCl3.6H2O و 17/3 گرم FeCl2.4H2O (شرکت مرک آلمان) در 300 میلی‌لیتر آب مقطر حل شدند در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت حرارت داده شدند. در ادامه 40 میلی‌لیتر محلول یک نرمال آمونیاک (شرکت مرک آلمان) افزوده شد و مخلوط واکنش به مدت 3 ساعت در دمای 80 درجه سانتی‌گراد حرارت دهی شد. پس از تشکیل نانوذرات Fe3O4، مخلوط واکنش سانتریفوژ (مدل UNIVERSAL 320 شرکت Hettich آلمان) شده و نانوذرات با آب مقطر شسته و سپس در آون (مدل UNB 100 شرکت Memmert آلمان) خشک شدند. برای بهبود اتصال نانوذرات به تیمول(شرکت سیگما آلدریچ آلمان)، نانوذرات سنتز شده با استفاده از گلوکز (شرکت مرک آلمان) عامل دار شدند. برای عامل‌دار کردن نانوذرات اکسید آهن، یک گرم Fe3O4 و 5/0 گرم D-گلوکز به 60 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شدند و مخلوط واکنش به مدت 30 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک (مدل SONIC 6MX شرکت GTSONIC چین) و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 180 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد. سپس، نانوذرات عامل‌دار شده جداسازی شدند، و با آب مقطر و اتانول شسته شدند و در نهایت در دمای 70 درجه سانتی‌گراد خشک شدند. در مرحله بعد، یک گرم Fe3O4@Glu و 100 میلی‌گرم تیمول به 50 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شدند، به مدت 30 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک قرار گرفتند و سپس مخلوط واکنش به مدت 24 ساعت در دمای اتاق هم زده شد. در پایان، نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol با استفاده از سانتریفوژ جمع آوری شده و با استفاده از خشک‌کن انجمادی خشک شدند (8).
تعیین ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی نانوذرات
آنالیزهای فیزیکوشیمیایی مورد استفاده شامل FT-IR، XRD، تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی، آنالیز عنصری (EDS)، تعیین پتانسیل زتا و DLS بود. آزمایش FT-IR با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Nicolet IR-100 در محدوده جذبی 400 تا 4000 cm-1 و با هدف ارزیابی گروه‌های عاملی نانوذرات Fe3O4، تیمول و Fe3O4@Glu-Thymol انجام پذیرفت. آزمایش XRD نیز به منظور تخمین ساختار کریستالی نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol و با استفاده از منبع پرتو کبالت و توسط دستگاه شکست اشعه ایکس با مدل XPert Pro (شرکت Malvern Panalytical هلند) انجام شد. تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی گذاره و نگاره با استفاده از میکروسکوپ‌های Zeiss EM-900 TEM (آلمان) و TESCAN Mira3 SEM (جمهوری چک) و با هدف تعیین شکل و اندازه ذرات انجام شد و از آنالیز EDS به منظور آنالیز عنصرهای تشکیل‌دهنده ذرات کمک گرفته شد. همچنین، آزمایش‌های تعیین پتانسیل زتا و DLS (مدل Zetasizer Nano ZS / ZSP شرکت Malvern Panalytical هلند) با هدف اندازه‌گیری بار سطحی و قطر هیدرودینامیک ذرات انجام شدند.
رده‌های سلولی و کشت سلول
رده‌های سلولی مورد استفاده در این پژوهش شامل رده سلولی HDF، به عنوان رده سلول نرمال، و رده سلولی HepG2، به عنوان رده سلولی سرطان کبد بود. سلول‌های مورد استفاده از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شدند. کشت سلول‌ها در محیط کشت DMEM (شرکت Gibco آمریکا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (شرکت Gibco آمریکا) و پنی سیلین-استرپتومایسین (شرکت PanBiotech آلمان) انجام شد و سلول‌ها در انکوباتور (مدل ICB 150 شرکت Memmert آلمان) با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و غلظت دی‌اکسید کربن 5% رشد داده شدند.
تعیین زنده‌مانی سلول‌ها
از آزمایش MTT به منظور اندازه‌گیری میزان زنده‌مانی سلول‌های تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات استفاده شد. برای انجام این آزمایش، در ابتدا سلول‌ها در چاهک‌های پلیت 96 خانه کشت سلولی با تراکم 10000 سلول در هر چاهک تقسیم شدند و سپس غلظت‌های مختلف از نانوذرات از 81/7 تا 500 میکروگرم/میلی‌لیتر به چاهک‌ها اضافه شد. چاهک‌هایی هم بدون اضافه شدن نانوذرات به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند. سلول‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. در ادامه 100 میکرو لیتر از محلول MTT 5/0 میلی‌گرم/میلی‌لیتر به هر چاهک اضافه شد و سلول‌ها به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس محتویات چاهک‌ها با استفاده از سمپلر تخلیه شد و مقدار 200 میکرو لیتر DMSO به منظور حل کردن کریستال‌های فورمازان افزوده شد. پس از 30 دقیقه، مقدار جذب نوری هر چاهک در طول موج 570 نانومتر با استفاده از یک دستگاه خوانشگر پلیت سنجش شد و میزان زنده‌مانی سلول‌ها با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد (9):
آزمایش فلوسایتومتری
به منظور تعیین اثر تیمار سلول‌های رده سرطان کبد با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol بر میزان آپوپتوز سلولی، در ابتدا سلول‌های رده HepG2 کشت داده شدند و سپس غلظت نیمه مهاری (IC50) نانوذرات به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سلول‌های تیمار نشده به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند. در ادامه، سلول‌ها با بافر نمکی فسفات (PBS) شستشو داده شدند و سپس با استفاده از رنگ‌های propidium iodide (PI) و Annexin V رنگ‌آمیزی شدند. در پایان، سلول‌ها با استفاده از یک دستگاه فلوسایتومتری Partec (ساخت آلمان) به منظور تعیین درصد سلول‌های آپوپتوزی آنالیز شدند (10).
تعیین میزان بیان ژن کاسپاز-8
در ابتدا سلول‌های رده سرطان کبد با غلظت نیمه مهاری نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس، سلول‌ها جمع‌آوری و با بافر نمکی فسفات شستشو داده شدند. در ادامه، محتوی RNA تام سلولی با استفاده از محلول تجاری ترایزول (TriZolTM, ThermoFisher) استخراج شده و در مرحله بعد، مولکول‌های cDNA ، توسط کیت سنتز cDNA AddBio (کره جنوبی) و طبق دستورالعمل سازنده کیت ساخته شدند. از ژن GAPDH به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد و تکثیر ژن‌ها با استفاده از مستر میکس سایبر گرین PCR (AddBio، کره جنوبی) انجام شد. بیان نسبی ژن کاسپاز-8 با استفاده از روش ΔΔct-2 محاسبه شد (11). توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول 1 ارائه شده است.
جدول 1. توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه
References | Product size | Sequences (5′-3′) | Primers |
(12) | 143 bp | GACTGGATTTGCTGATTACCTACCTAA CCTCAATTCTGATCTGCTCACTTCT | Caspase8-Forward Caspase8-reverse |
(12) | 74 bp | CCCACTCCTCCACCTTTGAC CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA | GAPDH-forward GAPDH-reverse |
آنالیز آماری
آزمایش‌های MTT و بیان ژن در سه تکرار انجام شدند و از آزمون آماری ANOVA با سطح معنی‌داری 05/0>p استفاده شد. برای انجام آزمون آماری از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 0/9 استفاده شد.
یافته‌ها
بر اساس طیف XRD، با توجه به شکل مقادیر θ2 برابر 32 ، 42، 53 و 63 درجه مربوط به نانوذرات اکسید آهن است که مطابق با شماره کارت 03-0863 میباشد. همچنین با توجه به آمورف بودن ساختار تیمول، پیک‌هایی در θ2 برابر 7، 17، 3/19، 4/21، 2/26 درجه در این طیف قابل مشاهده است، که مربوط به تیمول میباشد (شکل 1).
در نوار FT-IR برای نانوذرات Fe3O4 طول موجهای جذبی شدید درcm-1 420، 580 و 624 به ترتیب ناشی از پیوندهای Fe-O مربوط به یونهای Fe2+ و Fe3+ واقع در جایگاههای هشت‌وجهی و یون Fe3+ واقع در جایگاه چهاروجهی است که این نشانهی شکل‌گیری ساختار Fe3O4 میباشد. در نوار FT-IR مربوط به تیمول، طول‌موج‌های در 587، 785، 893 به ترتیب مربوط به پیوندهای C-C، C-H، =CH، 1248 و 1618 مربوط به C-H، =CHمیباشد. همان‌طور که مشاهده می‌شود در طیف c، پیک‌های مربوط به ماده‌ی تیمول و نانو ذره اکسید آهن وجود دارد و نتایج نشان‌دهنده‌ی سنتز موفق میباشد (شکل 2). بر اساس نتایج تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol دارای شکل کروی و با اندازه قطر کمتر از 50 نانومتر بودند (شکل 3).
شکل 1. آنالیز XRD نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol
شکل 2. طیف FT-IR تیمول، Fe3O4 و نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol. وجود پیک‌های مربوط به هر دو ماده سازنده در ساختار نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol نشان دهنده سنتز صحیح آنان است.
شکل 3. تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی گذاره (a) و نگاره (b) نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol. ذرات سنتز شده دارای ابعاد کمتر از 60 نانومتر و دارای شکل کروی هستند.
همچنین، آنالیز عنصری نانوذرات نشان داد که از عناصر آهن، اکسیژن و کربن با درصد وزنی به ترتیب 7/55%، 3/25% و 19% تشکیل شده و هیچ‌گونه ناخالصی عنصری در ساختار نانوذرات مشاهده نشد (شکل 4). آنالیزهای پتانسیل زتا و DLS هم نشان دادند که بار سطحی ذرات در محیط آبی 5/13- میلی ولت بوده و به دلیل جذب آب، اندازه هیدرودینامیک ذرات به 515 نانومتر رسید (شکل 5).
شکل 4. آنالیز عنصری نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol نشان دهنده خالص بودن عنصری ذرات میباشد.
شکل 5. تعیین بار سطحی (a) و قطر هیدرودینامیک (b) نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol
زنده‌مانی سلول
بررسی میزان زنده‌مانی سلول‌های رده نرمال و رده سرطان کبد در اثر تیمار با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol با انجام آزمایش MTT انجام شد. بر اساس نتایج، نانوذرات سنتز شده در غلظت 25/31 میکروگرم/میلی‌لیتر باعث کاهش معنی‌دار زنده‌مانی سلول‌های رده نرمال شدند، در حالی که این غلظت در رده سلول سرطان کبد 62/15 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. این نتایج نشان دهنده اثرات سمیتی وابسته به غلظت در هر دو رده سلولی است. همچنین، غلظت نیمه مهاری نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol در کشت‌های سلولی رده نرمال و سرطان کبد به ترتیب 175 و 5/67 میکروگرم/میلی‌لیتر بود، که نشان دهنده سمیت بیشتر نانوذرات مذکور برای سلول‌های سرطانی است. نتایج در شکل 6 نمایش داده شده است.
شکل 6. زنده‌مانی سلول‌های رده سرطان کبد و رده نرمال در اثر مواجهه با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol. نتایج نشان دهنده کاهش وابسته به غلظت در زنده‌مانی سلول‌ها است. اثرات سمیتی نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol بر سلول‌های سرطانی قوی‌تر از سلول‌های طبیعی بود. تفاوت معنی‌داری با *** نشان داده شده است(:p<0/001***).
نتایج فلوسایتومتری
بررسی درصد سلول‌های آپوپتوزی در سلول‌های رده سرطان کبد نشان داد که تیمار این سلول‌ها با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش قابل توجه در میزان آپوپتوز سلولی می‌شود. بر اساس نتایج این آزمایش، جمعیت سلول‌هایی که دچار آپوپتوز اولیه و تأخیری شدند در گروه شاهد به ترتیب 29/1% و 96/0% بود که پس از تیمار با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol به 5/12 و 09/6 % افزایش یافت. نتایج در شکل 7 نمایش داده شده است.
شکل 7. آنالیز فلوسایتومتری سلول‌های HepG2. (a) شاهد، (b) تیمار شده با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol. نتایج نشان دهنده افزایش قابل توجه آپوپتوز سلولی در سلول‌های تیمار شده است. Q1: نکروز سلولی، Q2: آپوپتوز تأخیری، Q3: آپوپتوز اولیه و Q4: سلول‌های سالم.
بررسی بیان ژن کاسپاز-8
بررسی میزان بیان ژن کاسپاز-8 در سلول‌های رده HepG2 نشان داد که تیمار سلول‌ها با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش معنی‌دار بیان این ژن می‌گردد. به دنبال تیمار سلول‌های مذکور با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol به مدت 24 ساعت، میزان بیان ژن کاسپاز-8 به میزان 45/2 برابر افزایش نشان داد که نشانگر یک افزایش معنی‌دار در بیان آن است. نتایج در شکل 8 نشان داده شده است.
شکل 8. بیان ژن کاسپاز-8 در سلول‌های رده HepG2. تیمار سلول‌ها با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol باعث افزایش بیان معنی‌دار ژن کاسپاز-8 شد. علامت *** نشان دهنده وجود تفاوت معنی‌دار است. (:p<0.001***).
بحث
سرطان کبد به عنوان دومین نوع کشنده سرطان شناخته می‌شود. تعداد موارد مرگ‌ومیر بالای ناشی از این بیماری نشانگر کارایی پایین روش‌های درمانی کنونی بر علیه این بیماری است. استفاده از فناوری نانو، امیدهای جدیدی را در زمینه بهبود دارو رسانی و اثربخشی داروهای ضدسرطانی ایجاد کرده است. بر این اساس، در مطالعه حاضر به ارزیابی اثرات ضد سرطانی نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol در سلول‌های رده سرطان کبد و ارزیابی مکانیسم‌های احتمالی آن پرداخته شد. نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol دارای اثرات سمیتی معنی‌داری بر روی سلول‌های سرطانی بودند و سبب کاهش قابل توجه زنده‌مانی سلول‌های سرطانی شدند. اثرات ضد سرطانی نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol را می‌توان به میزان زیادی به حضور تیمول در فرمولاسیون این نانوذرات مرتبط دانست. مطالعات پیشین نشان داده‌اند که تیمول می‌تواند از طریق مکانیسم‌های متعددی از رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی جلوگیری کند. Chauhan و همکاران نشان دادند که تیمول می‌تواند سبب ایجاد استرس اکسیداتیو در سلول‌های رده سرطان کولورکتال شده و با ایجاد آسیب به DNA و میتوکندری سبب القای آپوپتوز در سلول‌های سرطانی شود. آنان همچنین نشان دادند که میزان کاسپاز-3 و سیتوکروم c در سلول‌های تیمار شده با تیمول افزایش معنی‌داری می‌یابد، که نشان‌دهنده مکانیسم القای آپوپتوز توسط این ماده در سلول‌های سرطانی است (13). همچنین، در مطالعه دیگری، مشاهده شد که تیمول می‌تواند سبب افزایش بیان ژن‌های p53 و Bax، که ژن‌های محرک آپوپتوز هستند، در سلول‌های سرطانی شده و به این ترتیب باعث القای آپوپتوز در سلول‌ها و کاهش زنده‌مانی آنان شود. در آن مطالعه، افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن به عنوان مکانیسم ضد سرطانی تیمول در نظر گرفته شد (14). نتایج مشابهی نیز از اثر تیمول در سلول‌های رده سرطان پستان مشاهده شد. Jamali و همکاران نشان دادند که تیمار سلول‌های رده سرطان پستان با تیمول می‌تواند سبب افزایش بیان کاسپازهای -3، -8 و -9، افزایش مقدار رادیکال‌های آزاد اکسیژن، توقف چرخه سلولی و آسیب به DNA شود، که با نتایج این مطالعه مبنی بر افزایش بیان کاسپاز-8 و القای آپوپتوز در سلول‌های سرطان کبد تیمار شده با نانوذرات مطابقت دارد (15). همچنین، Liو همکاران دو مکانیسم اصلی ضد سرطانی تیمول را شامل مهار مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt، از طریق MAPKها، و تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن دانستند (16).
در این مطالعه مشاهده شد که تیمار سلول‌های HepG2 با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش درصد سلول‌های آپوپتوزی می‌شود. در مطالعه مشابهی، Altintas و همکاران نشان دادند که تیمول سبب افزایش معنی‌دار میزان آپوپتوز سلولی در سلول‌های رده HepG2 شد که با یافته‌های این مطالعه منطبق است (17). در مطالعه ما همچنین مشاهده شد که تیمار سلول‌های سرطان کبد با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol سبب افزایش معنی‌دار بیان ژن کاسپاز-8 می‌شود. کاسپاز-8 به عنوان یک کاسپاز آغازگر فعال‌سازی آبشار کاسپازی در مسیر آپوپتوز بیرونی شناخته می‌شود. این پروتئین در پاسخ به اتصال لیگاندهای مرگ به گیرنده‌های سطح سلولی فعال می‌شود و با برش پروتئولیتیک کاسپاز-3 سبب پیشروی آپوپتوز در مسیر بیرونی می‌شود. علاوه بر این، کاسپاز-8 می‌تواند از طریق برهمکنش با پروتئین Bid با مسیر درونی آپوپتوز تلاقی داشته و سبب تحریک پیشروی آن گردد. بنابراین این پروتئین، نقش بسیار مهمی در آغاز و پیشروی مسیرهای آپوپتوز بر عهده دارد (18). همسو با نتایج فلوسایتومتری، افزایش بیان ژن کاسپاز-8 در سلول‌های تیمارشده با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol نشان دهنده قابلیت این ذرات در مهار سلول‌های سرطان کبد از طریق القای آپوپتوز میباشد.
کاهش معنی‌دار زنده‌مانی سلول‌های رده سرطان کبد توسط با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol نشان می‌دهد که نانوذرات اکسید آهن می‌توانند به عنوان یک حامل مناسب برای دارو رسانی به سلول‌های سرطانی عمل کنند و به این ترتیب سبب بهبود اثر بخشی و افزایش پایداری نانو داروها شوند. همسو با نتایج این مطالعه، Adilakshmi و همکاران (19) نشان دادند که نانوذرات عامل دار شده اکسید آهن مگنتیک می‌توانند به منظور دارو رسانی موفق داروی دوکسوروبیسین به سلول‌های رده سرطان پستان عمل نمایند. همچنین، در یک مطالعه جدید نشان داده شد که نانوذرات اکسید آهن پوشش دهی شده با آلبومین می‌توانند به عنوان حامل برای تیمول عمل کرده و سبب کاهش زنده‌مانی سلول‌های سرطان پستان رده MDA-MB-231 شوند، که با نتایج این مطالعه منطبق است (20).
نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol اثرات مهاری بسیار قوی‌تری بر روی سلول‌های رده سرطان کبد در مقایسه با سلول‌های طبیعی داشتند. این یافته نشان دهنده اثرگذاری انتخابی این نانوذرات بر سلول‌های سرطانی است. سلول‌های سرطانی از سرعت رشد و متابولیسم بالاتری نسبت به سلول‌های طبیعی برخوردارند. به همین دلیل این سلول‌ها از نیازمندی غذایی و جذب مواد غذایی بالاتری برخوردار بوده و جذب ترکیبات برون سلولی به آن‌ها با سرعت بیشتری انجام می‌شود (21-22). بر اساس این فرضیه، جذب بیشتر نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol به سلول‌های سرطانی ممکن است دلیل حساسیت بیشتر آنان به این نانوذرات نسبت به سلول‌های طبیعی باشد. اگرچه، آزمایش‌های تکمیلی برای تائید یا رد این فرضیه مورد نیاز است. علاوه بر این، سلول‌های سرطانی به دلیل تولید انرژی و سرعت متابولیک بالاتر از سلول‌های طبیعی، مقادیر بیشتری از رادیکال‌های آزاد اکسیژن را تولید کرده و همواره تحت تنش اکسیداتیو بالاتری قرار دارند (23). مواجهه این سلول‌ها با نانوذرات Fe3O4@Glu-Thymol و ازدیاد تولید رادیکال‌های آزاد در این سلول‌ها نیز می‌تواند دلیل دیگری برای توضیح حساسیت بالاتر سلول‌های سرطانی به نانوذرات مذکور باشد.
نتيجهگيري
مطالعه حاضر به استفاده از نانوفرمولاسیون جدید شامل نانوذرات Fe₃O₄ عامل‌دار شده با گلوکز و کنژوگه با تیمول، بررسی هم‌زمان اثرات زیستی (MTT) و مولکولی (Real-time PCR) و مقایسه با رده سلولی نرمال پرداخته است. همچنین، بررسی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی کامل نانوذرات با استفاده از چندین تکنیک تحلیلی از جمله FTIR، XRD، SEM، DLS و زتا پتانسیل به اعتبار داده‌ها افزوده است. با این حال، مطالعه حاضر دارای محدودیت‌هایی نیز میباشد. اول اینکه آزمایش‌ها فقط در شرایط in vitro و تنها بر یک رده سلولی سرطان کبد انجام شد. دوم، تنها یک ژن آپوپتوتیک مورد بررسی قرار گرفت و سایر اجزای مسیرهای آپوپتوز مانند کاسپاز-3، Bax، Bcl-2 یا سیتوکروم c مورد ارزیابی قرار نگرفتند. همچنین، تولید ROS یا آسیب DNA مستقیماً در این مطالعه اندازه‌گیری نشد. پیشنهاد می‌شود در مطالعات آینده از روش‌های مکمل مانند سنجش ROS، تحلیل میتوکندری و ارزیابی پروتئین‌های کلیدی مسیرهای آپوپتوز استفاده شود. در نهایت، بررسی اثربخشی و ایمنی این نانوذرات در مدل‌های حیوانی جهت ارزیابی عملکرد in vivo ضروری است.
References
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209–49. https://doi.org/10.3322/caac.21660
2. Anwanwan D, Singh SK, Singh S, Saikam V, Singh R. Challenges in liver cancer and possible treatment approaches. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1873(1):188314. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2019.188314
3. Gavas S, Quazi S, Karpiński TM. Nanoparticles for cancer therapy: current progress and challenges. Nanoscale Res Lett. 2021;16(1):173. https://doi.org/10.1186/s11671-021-03628-6
4. Vangijzegem T, Stanicki D, Laurent S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opin Drug Deliv. 2019;16(1):69–78. https://doi.org/10.1080/17425247.2019.1554647
5. Islam MT, Khalipha AB, Bagchi R, Mondal M, Smrity SZ, Uddin SJ, et al. Anticancer activity of Thymol: A literature‐based review and docking study with Emphasis on its anticancer mechanisms. IUBMB Life. 2019;71(1):9–19. https://doi.org/10.1002/iub.1935
6. Altintas F, Tunc-Ata M, Secme M, Kucukatay V. The anticancer effects of thymol on HepG2 cell line. Med Oncol. 2023;40(9):260. https://doi.org/10.1007/s12032-023-02134-2
7. Sahoo G, Samal D, Khandayataray P, Murthy MK. A review on caspases: key regulators of biological activities and apoptosis. Mol Neurobiol. 2023;60(10):5805–37. https://doi.org/10.1007/s12035-023-03433-5
8. Habibzadeh SZ, Salehzadeh A, Moradi-Shoeili Z, Shandiz SA. Iron oxide nanoparticles functionalized with 3-chloropropyltrimethoxysilane and conjugated with thiazole alter the expression of BAX, BCL2, and p53 genes in AGS cell line. Inorg Nano-Metal Chem. 2023;53(2):191–8. https://doi.org/10.1080/24701556.2021.2025074
9. Hosseinkhah M, Ghasemian R, Shokrollahi F, Mojdehi SR, Noveiri MJ, Hedayati M, et al. Cytotoxic potential of nickel oxide nanoparticles functionalized with glutamic acid and conjugated with thiosemicarbazide (NiO@Glu/TSC) against human gastric cancer cells. J Clust Sci. 2022;33(5):2045–53. https://doi.org/10.1007/s10876-021-02124-2
10. Shahmoradi SS, Salehzadeh A, Ranji N, Habibollahi H. Trigger of apoptosis in human liver cancer cell line (HepG2) by titanium dioxide nanoparticles functionalized by glutamine and conjugated with thiosemicarbazone. 3 Biotech. 2023;13(6):195. https://doi.org/10.1007/s13205-023-03609-9
11. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45.
12. Faraji N, Mashkoor NR, Emamifar A, Ghamarsoorat F, Ghalehjoughi ZP, Bajgiran FA, et al. The Cytotoxic Effect of Cobalt Oxide Nanoparticle Conjugated by Menthol on Colorectal Cancer Cell Line and Evaluation of the Expression of CASP8 and FEZF1-AS1. J Clust Sci. 2025;36(2):39. https://doi.org/10.1007/s10876-024-02757-z
13. Chauhan AK, Bahuguna A, Paul S, Kang SC. Thymol elicits HCT-116 colorectal carcinoma cell death through induction of oxidative stress. Anti-Cancer Agents Med Chem. 2017;17(14):1942–50. https://doi.org/10.2174/1871520617666170327121228
14. Qoorchi Moheb Seraj F, Heravi-Faz N, Soltani A, Ahmadi SS, Shahbeiki F, Talebpour A, et al. Thymol has anticancer effects in U-87 human malignant glioblastoma cells. Mol Biol Rep. 2022;49(10):9623–32. https://doi.org/10.1007/s11033-022-07867-3
15. Jamali T, Kavoosi G, Safavi M, Ardestani SK. In-vitro evaluation of apoptotic effect of OEO and thymol in 2D and 3D cell cultures and the study of their interaction mode with DNA. Sci Rep. 2018;8(1):15787. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34055-w
16. Li Y, Wen JM, Du CJ, Hu SM, Chen JX, Zhang SG, et al. Thymol inhibits bladder cancer cell proliferation via inducing cell cycle arrest and apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2017;491(2):530–6. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.04.009
17. Altintas F, Tunc-Ata M, Secme M, Kucukatay V. The anticancer effects of thymol on HepG2 cell line. Med Oncol. 2023;40(9):260. https://doi.org/10.1007/s12032-023-02134-2
18. Mandal R, Barrón JC, Kostova I, Becker S, Strebhardt K. Caspase-8: The double-edged sword. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1873(2):188357. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2020.188357
19. Adilakshmi B, Reddy OS, Hemalatha D, Rao KS, Lai WF. ROS-generating poly (Ethylene Glycol)-Conjugated Fe3O4 nanoparticles as cancer-targeting sustained release carrier of doxorubicin. Int J Nanomedicine. 2022;17:4989–5004. https://doi.org/10.2147/IJN.S379200
20. Haghighi A, Shahanipour K, Monajemi R, Yazdanpanahi N, Fouladgar M. Evaluation of the Cytotoxic Effect of Thymol Loaded Albumin-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles on MDA-MB-231 Cell Line and the Expression of Autophagic MAP1LC3A Gene. Pharm Chem J. 2023;57(4):486–500. https://doi.org/10.1007/s11094-023-02910-4
21. Papalazarou V, Maddocks OD. Supply and demand: Cellular nutrient uptake and exchange in cancer. Mol Cell. 2021;81(18):3731–48. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.026
22. Sofi MA, Sunitha S, Sofi MA, Pasha SK, Choi D. An overview of antimicrobial and anticancer potential of silver nanoparticles. J King Saud Univ Sci. 2022;34(2):101791. https://doi.org/10.1016/j.jksus.2021.101791
23. Raza MH, Siraj S, Arshad A, Waheed U, Aldakheel F, Alduraywish S, et al. ROS-modulated therapeutic approaches in cancer treatment. J Cancer Res Clin Oncol. 2017;143:1789–809. https://doi.org/10.1007/s00432-017-2464-9
