گروه‌های سـازگار مـیسلیومی و تنوع ژنتیـکی در جمعیـت‌های قارچ Sclerotinia sclerotiorum عامل پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه کلزا در استان مازندران
الموضوعات : Plant Pathology
سارا محسنی چمازکتی
1
,
سعید رضائى
2
,
علیرضا دلیلی
3
,
مجید الداغی
4
1 - دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - استادیار، گروه گیاهپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - استادیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان مازندران، ساری، ایران
4 - استادیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان مازندران، ساری، ایران
الکلمات المفتاحية: تنوع ژنتیکی, سازگاری میسلیومی, نشانگرهای ریزماهواره, کلزا, پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه,
ملخص المقالة :
بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه، ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum، یکی از مهم‌ترین بیماري‌هاي کلزا در ایران میباشد. به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی جدایههای S. sclerotiorum، نمونهبرداری از مزارع کلزا در مناطق مختلف استان مازندران انجام گرفت. تعداد 56 جدایه، براساس پراکنش جغرافیایی انتخاب گردید، سپس، جهت بررسی ساختار ژنتیکی جدایه ها، از گروه‌هـای سازگاری میسلیـومی (MCGs) و نشانگرهای ریزمـاهـواره (SSRs) استفاده شد. در مجـموع، 32 گروه سازگاری میسلیومی شناسایی شد که 4/59 درصد از آنها فقط شامل یک جدایه بودند، درحالی‌که سایر گروه‌ها، 7-2 جدایه داشتند. آزمون مولکولی با استفاده از 10 جفت آغازگر ریزماهواره انجام گردید. در نهایت، 31 هاپلوتیپ ریزماهواره در همه جمعیتها شناسایی و چند هاپلوتیپ با فراوانی بالا یافت شدند. تنوع ژنی در هفت جمعیت در محدوده 4120/0 تا 5111/0 متغیر بود. بیشترین و کمترین تنوع ژنتیکی درون جمعیت به ترتیب مربوط به جمعیت شهرستانهای بهشهر و ساری بود. بین هاپلوتیپهای ریزماهواره و گروه‌های سازگاری میسلیومی ارتباط معنیداری مشاهده نشد (75/0V=، 36/0P=). نتایج حاصل از این مطالعه براي اصلاح ارقام مقاوم و توسعه راهبردهای مدیریت بیماري پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه مفید خواهد بود.
یوسف دوست، و. و قوستا، ی. 1394. گروه¬هاي سازگار میسلیومی و بیماریزایی جدایه¬هاي قارچ عامل پوسیدگی سر کلم در ارومیه. مجله علمی کشاورزی 38(1): 78-67.
Ajiboye, T.O. Visser, H.G., Erasmus, E. and Schutte-Smith, M. 2025. Recent strategies for controlling the white mould fungal pathogen (Sclerotinia sclerotiorum) using gene silencing, botanical fungicides and nanomaterials. Sustainable Food Technology 3: 612-636.
Aldrich-Wolfe, L., Travers, S. and Nelson, B.D. 2015. Genetic variation of Sclerotinia sclerotiorum from multiple crops in the north central United States. PLoS One 10(9): e0139188. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139188.
Barari, H., Dalili, S.A. and Hassani, H.M. 2017. Genetic diversity among different isolates of Sclerotinia sclerotiorum in north of Iran. Journal of Bacteriology and Mycology 5(5): 387‒389.
Barari, H., Alavi, V. and Badalyan, S.M. 2012. Genetic and morphological differences among populations of Sclerotinina sclerotiorum by microsatellite markers, mycelial compatibility groups (MCGs) and aggressiveness in North Iran. Romanian Agricultural Research 29: 323-331.
Barari, H., Dalili, S.A. and Badalyan, S.M. 2014. Mycelial compatibility grouping and aggressiveness of Sclerotinia sclerotiorum on different hosts in North of Iran. Jordan Journal of Agricultural Sciences 10(1): 45-57. http://dx.doi.org/10.12816/0029873.
Bolton, M.D., Thomma, B.P.H.J. and Nelson, B.D. 2006. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: Biology and Molecular Traits of a Cosmopolitan Pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.
Carbone, I., Anderson, J.B. and Kohn, L.M. 1999. Patterns of descent in clonal lineages and their multilocus fingerprints are resolved with combined gene genealogies. Evolution 53: 11-21.
Clarkson, J.P., Conventry, E., Kitchen. J., Carter, H.E. and Whipps, J.M. 2013. Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in crop and wild hosts in the UK. Plant Pathology 62(2): 309-324.
Irani, H., Heydari, A., Javan-Nikkhah, M. and Ibrahimov, A.S. 2011. Pathogenicity variation and mycelial compatibility groups in Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Plant Protection Research 51(4) 329-336.
Faraghati, M., Abrinbana, M. and Ghosta, Y. 2022. Genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum populations from sunflower and cabbage in West Azarbaijan province of Iran. Scientific Reports 12: 9263. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13350-7.
Hemmati, R., Javan-Nikkhah, M. and Linde, C.C. 2009. Population genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum on canola in Iran. European Journal of Plant Pathology 125: 617-628.
Karimi, E., Safaie, N. and Shams-Bakhsh, M. 2012. Mycelial compatibility groupings and pathogenic diversity of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary populations on canola in Golestan Province of Iran. Journal of Agricultural Science and Technology 14: 421-434.
Khan, M.A., Cowling, W.A., Banga, S.S., Barbetti, M.J., Cantila, A.Y., Amas, J.C., Thomas, W.J., You, M.P., Tyagi, V., Bharti, B. and Edwards, D. 2023. Genetic and molecular analysis of stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) resistance in Brassica napus (canola type). Helyon 9: 1-12. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e19237.
Kohli, Y., Brunner, L.J., Yoell, H, Milgroom, M.G., Anderson, J.B., Morrall, R.A. and Kohn, L.M. 1995. Clonal dispersal and spatially mixing in populations of the plant pathogenic fungus, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology 4(1): 69-77.
Kohn, L.M. 1995. The clonal dynamic in wild and agricultural plant pathogen populations. Canadian Journal of Botany 73(S1): 1231–1240. http://dx.doi.org/10.1139/b95-383.
Lehner, M.S., Paula Júnior, T.J., Hora Júnior, B.T., Teixeira, H., Vieira, R.F., Carneiro, J.E.S. and Mizubuti, E.S.G. 2015. Low genetic variability in Sclerotinia sclerotiorum populations from common bean fields in Minas Gerais State, Brazil, at regional, local and micro-scales. Plant Pathology 64: 921-931.
Litholdo Júnior, C.G., Gomes, E.V., Lobo Júnior, M., Nasser, L.C.B. and Petrofeza, S. 2011. Genetic diversity and mycelial compatibility groups of the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum in Brazil. Genetics and Molecular Research 10(2): 868-877.
Liu, J., Meng, Q., Zhang, Y., Xiang, H., Li, Y., Shi, F., Ma, L., Liu, C., Liu, Y., Su, B. and Li, Z. 2018. Mycelial compatibility group and genetic variation of sunflower Sclerotinia sclerotiorum in Northeast China. Physiological and Molecular Plant Pathology 102: 185-192. https://doi.org/10.1016/j.pmpp. 2018.03.006.
Liu, K. and Muse, S.V. 2005. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21(9): 2128–2129. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti282.
McDonald, B.A. and Linde, C. 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40: 349-379. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.40.120501. 101443.
Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 3321-3323.
Pakdaman, B.S. and Goltapeh, E.M. 2007. In vitro studies on the integrated control of rapeseed white stem rot disease through the application of herbicides and Trichoderma species. Pakistan Journal of Biological Sciences 10(1): 7-12.
Peakall, R. and Smouse, P.E. 2012. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-An update. Bioinformatics 28(19): 2537-2539.
Pethybridge, S.J., Murphy, S., Lund, M. and Kikkert, J.R. 2024. Survival of Sclerotinia sclerotiorum sclerotia in central New York. Plant Disease 108(5): 1165-1172.
Reich, J., McLaren, D.L., Kim, Y.M., Wally, O., Yevtushenko, D., Hamelin, R. and Chatterton, S. 2024. Predicting airborne ascospores of Sclerotinia sclerotiorum through machine learning and statistical methods. Plant Pathology 73(6): 1586-1601.
Rohlf, F.J. 2009. NTSYSpc: Numerical taxonomy system (Version 2.2). Exeter Software, Setauket, NY, USA.
Saharan, G.S. and Mehta, N. 2008. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Science + Business Media B.V., Amsterdam.
Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Schafer, M.R. and Kohn, L.M. 2006. An optimized method for mycelial compatibility testing in Sclerotinia sclerotiorum. Mycologia 98(4): 593-597. https://doi.org/10.3852/mycologia.98.4.593.
Sexton, A.C. and Howlett, B.J. 2004. Microsatellite markers reveal genetic differentiation among populations of Sclerotinia sclerotiorum from Australian canola fields. Current Genetics 46(6):357-65.
Silva, R.A., Ferro, C.G., Lehner, M., Jr, T.J.P. and Mizubuti, E.S.G. 2021. The population of Sclerotinia sclerotiorum in Brazil is structured by mycelial compatibility groups. Plant Disease 105: 3376-3384.
Sirjusingh, C. and Kohn, L.M. 2001. Characterization of microsatellites in the fungal plant pathogen, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology Notes 1(4): 267–269. https://doi.org/10.1046/j.1471-8278.2001.00102.x.
Tóthová, M., Máčajová, P. and Tóth, P. 2021. Mycelial incompatibility of Sclerotinia sclerotiorum isolates from a single rapeseed field in Slovakia. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 11(2). https://doi.org/10.15414/jmbfs.3369.
Tok, F.M., Derviş, S. and Arslan, M. 2016. Analysis of genetic diversity of Sclerotinia sclerotiorum from eggplant by mycelial compatibility, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) analyses. Biotechnology and Biotechnological Equipment 30(5): 921_928.
Xu, D.F., Li, X.L., Pan, Y.M., Dai, Y.L., Li, P., Chen, F.X., Zhang, H.J., Guo, M. and Gao, Z.M. 2014. Genetic diversity and pathogenicity differentiation of Sclerotinia sclerotiorum on rapeseed (Brassica napus L.) in Anhui Province, China. Genetics and Molecular Research 13(4): 10704-10713. https://doi.org/10.4238/2014.december.18.12.
Yu, Y., Cai, J., Ma, L., Huang, Z., Wang, Y., Fang, A., Yang, Y., Qing, L. and Bi, C. 2020. Population structure and agressiveness of Sclerotinia sclerotiorum from rapeseed (Brassica napus) in Chongqing City. Plant Disease 104: 1201-1206.
گیاهپزشکی کاربردی، جلد 13، شماره 2، سال 1403
گروه‌های سـازگار مـیسلیومی و تنوع ژنتیـکی در جمعیـت‌های قارچ Sclerotinia sclerotiorum عامل پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه کلزا در استان مازندران
Mycelial Compatibility Groups and Genetic Diversity in Populations of Sclerotinia sclerotiorum, the Causal Agent of Sclerotinia Stem Rot of Rapeseed in Mazandaran Province
سارا محسنی چمازکتی1، سعید رضایی2*، سید علیرضا دلیلی3 و مجید الداغی3
دریافت: 1/8/1403 پذیرش: 22/10/1403
چکیده
بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه، ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum، یکی از مهم‌ترین بیماري‌هاي کلزا در ایران میباشد. به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی جدایههای S. sclerotiorum، نمونهبرداری از مزارع کلزا در مناطق مختلف استان مازندران انجام گرفت. تعداد 56 جدایه، براساس پراکنش جغرافیایی انتخاب گردید، سپس، جهت بررسی ساختار ژنتیکی جدایه ها، از گروه‌هـای سازگاری میسلیـومی (MCGs) و نشانگرهای ریزمـاهـواره (SSRs) استفاده شد. در مجـموع، 32 گروه سازگاری میسلیومی شناسایی شد که 4/59 درصد از آنها فقط شامل یک جدایه بودند، درحالی‌که سایر گروه‌ها، 7-2 جدایه داشتند. آزمون مولکولی با استفاده از 10 جفت آغازگر ریزماهواره انجام گردید. در نهایت، 31 هاپلوتیپ ریزماهواره در همه جمعیتها شناسایی و چند هاپلوتیپ با فراوانی بالا یافت شدند. تنوع ژنی در هفت جمعیت در محدوده 4120/0 تا 5111/0 متغیر بود. بیشترین و کمترین تنوع ژنتیکی درون جمعیت به ترتیب مربوط به جمعیت شهرستانهای بهشهر و ساری بود. بین هاپلوتیپهای ریزماهواره و گروه‌های سازگاری میسلیومی ارتباط معنیداری مشاهده نشد (75/0V=، 36/0P=). نتایج حاصل از این مطالعه براي اصلاح ارقام مقاوم و توسعه راهبردهای مدیریت بیماري پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه مفید خواهد بود.
واژگان کلیدی: تنوع ژنتیکی، سازگاری میسلیومی، نشانگرهای ریزماهواره، کلزا، پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه
مقدمه
بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه، ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary میباشد که یکی از مهم‌ترین و مخرب‌ترین عوامل بیماری‌زای گیاهی با دامنه میزبانی و پراکنش جغرافیایی گسترده است. این بیمارگر توانایی آلوده‌سازی بیش از 400 گونه گیاهی، از جمله محصولات زراعی مهمی نظیر سویا، آفتابگردان، کلزا، کاهو، هویج، سیب‌زمینی، لوبیا و نخود را دارد (Bolton et al., 2006). در کلـزا، این بیـماری از عوامـل اصـلی کاهـش عملـکرد مـحـسوب میشـود و در شـرایط آب و هـوایی مسـاعد، به‌ویـژه در جلـگه‌هـای شـمالی دریای خـزر، بهسـرعـت گستـرش مـی‌یابد (Pakdaman and Goltapeh., 2007). بسته به شدت آلودگی و شرایـط مـحـیطی، خـسـارت بیـماری متغیـر بوده
1 و 2- به ترتیب دانشجوی دکتری بیماریشناسی گیاهی و استادیار، گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، آب، غذا و فراسودمندها، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
3- استادیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان مازندران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مازندران، ساری، ایران
نویسنده مسئول مکاتبات: srezaee@srbiau.ac.ir
و در موارد طغیانی و شـیوع شـدید بیـماری مـیتواند تا 100 درصـد کاهـش عمـلـکـرد مـحـصـول را بـه هـمـراه داشـته باشد (Saharan and Mehta, 2008).
مدیریت S. sclerotiorum به دلیل دامنه میزبانی وسیع، توانایی بقای طولانی‌مدت سختینهها در خاک و تنوع ژنتیکی بالا با چالشهای جدی مواجه است. این بیمارگر از دو مسیر متفاوت برای آلودگی استفاده میکند: (1) آلودگی بخش پایینی ساقه از طریق میسلیوم‌های خاکزاد حاصل از جوانه‌زنی میسلیوژنیک سختینهها و (2) آلودگی اندام‌های هوایی گیاه از طریق آسکوسپورهایی که در نتیجه جوانه‌زنی کارپوژنیک تولید می‌شوند (Ajiboye et al., 2025). راهبردهای کنترل بیماری شامل مجموعه‌ای از اقدامات زراعی، شیمیایی و استفاده از ارقام مقاوم است. روش‌های زراعی عمدتاً پیشگیرانه بوده و به دلیل بقای چند ساله سختینهها و دامنه وسیع میزبانی قارچ، اثربخشی محدودی دارند. قارچ‌کش‌ها نیز اگرچه کاربرد گسترده‌ای دارند، اما بهعلت هزینه بالا و وابستگی شدید کارایی به زمان‌بندی مناسب، نتایج متغیری ارائه می‌کنند. از اینرو، ترکیب مقاومت ژنتیکی با مدیریت زراعی و کنترل شیمیایی بهینه، بهعنوان رویکردی کلیدی برای مهار بیماری توصیه می‌شود (Khan et al., 2023). موفقیت این رویکردها، به‌ویژه توسعه ارقام مقاوم، وابسته به شناخت دقیق تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت S. sclerotiorum است (McDonald and Linde, 2002).
تنوع ژنتیکی در پاتوژن‌های قارچی عمدتاً ناشی از جهش‌ها و نوترکیبی است (Liu et al., 2018). شناسایی گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCGs) یکی از روش‌های رایج برای توصیف دودمان‌های همسانه‌ای و ارزیابی تنوع ژنتیکی قارچ‌ها از جمله S. sclerotiorum، بهشمار می‌آید (Carbone et al., 1999). با این حال، MCGها شاخصی غیرمستقیم از تنوع ژنتیکی ارائه داده و قادر به تعیین دقیق روابط فیلوژنتیکی درون یا بین گروه‌ها نیستند (Litholdo Júnior et al., 2011). طی سال‌های اخیر، MCGهای متعددی در جمعیتهای S. sclerotiorum جدا شده از میزبان‌ها و مناطق جغرافیایی مختلف شناسایی و گزارش شده است (Aldrich-Wolfe et al., 2015؛ Barari et al., 2014؛ Irani et al., 2011؛ Karimi et al., 2012؛ Litholdo Júnior et al., 2011؛ Liu et al., 2018؛ Tok et al., 2016؛ Silva et al., 2021؛ Yu et al., 2020).
برای بررسی دقیق‌تر ساختار ژنتیکی و روابـط بین جـدایه‌ها، از روش‌های مـولـکـولی متنوعـی مانند RAPD (Litholdo Júnior et al., 2011؛ Tok et al., 2016)، ISSR (Faraghati et al., 2022؛ Xu et al., 2014) و SSR (Aldrich-Wolfe et al., 2015؛ Barari et al., 2017؛ Clarkson et al., 2013؛ Hemmati et al., 2009؛ Liu et al., 2018؛ Tok et al., 2016؛ Silva et al., 2021؛ Yu et al., 2020) استفاده شده است. در میان این روشها، نشانگرهای ریزماهواره (SSRs) به دلیل چندشکلی بالا، اختصاصی بودن در جایگاه ژنی، چندآللی بودن و قابلیت تکثیر آسان توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، ابزار ارزشمندی در مطالعات ژنتیک جمعیت، تکامل و برنامه‌های به‌نژادی محسوب می‌شوند (Liu et al., 2018).
بررسی‌های پیشین نشان می‌دهند که S. sclerotiorum دارای تنوع ژنتیکی قابل‌توجهی است و هر دو نوع تولیدمثل جنسی و غیرجنسی در آن رخ میدهد (Litholdo Júnior et al., 2011). کلونالیتی در S. sclerotiorum ناشی از تولیدمثل جنسی از طریق خودباروری است که منجر به تولید میلیون‌ها آسکوسپور می‌شود و همچنین از طریق تولید مثل غیرجنسی با تشکیل سختینهها رخ میدهد (Kohn, 1995). با این حال، شواهدی از وقوع دگرلقاحی نیز در برخی مناطق، از جمله ایران، گزارش شده است (Hemmati et al., 2009).
در ایران، مطالعات مختلف با استفاده از SSR و MCG نشاندهنده تنوع ژنتیکی بالا، تعداد متنوعی از گروه‌های سازگاری میسلیومی و ساختار جمعیتی ناهمگن در جمعیتهای S. sclerotiorum بوده‌اند (Barari et al., 2012, 2014, 2017؛ Hemmati et al., 2009؛ Faraghati et al., 2022؛ Karimi et al., 2012). این شواهد اهمیت پایش مستمر تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی این بیمارگر را در طراحی برنامه‌های مدیریتی مؤثر نشان میدهد.
در استان مازندران، قارچ S. sclerotiorum یکی از عوامل اصلی پوسیدگی ساقه کلزا بهشمار می‌رود و طی دهه‌های اخیر موجب کاهش قابل توجه عملکرد محصول شده است. بر این اساس، هدف مطالعه حاضر، بررسی ساختار ژنتیکی جدایههای S. sclerotiorum، عامل پوسیدگی ساقه کلزا، با استفاده از آزمون گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCG) و روش تعیین ژنوتیپ (genotyping) مبتنی بر نشانگرهای SSR، در این استان بوده است.
مواد و روشها
جمعآوری، کشت و جداسازی نمونهها
نمونهبرداری از مزارع کلزا در استان مازندران، از شهرستانهای گلوگاه، بهشهر، نکا، میاندرود، ساری، جویبار و بابل انجام گرفت (شکل 1). بدین ترتیب، نمونهها از گیاهان دارای علایم بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه در فصل زراعی سال 1400 جمعآوری گردید. نمونهها پس از خشک شدن در هوای آزاد، در پاکت‌های کاغذی جداگانه قرار گرفته و به آزمایشگاه مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شدند. سختینه‌های قارچ پس از جداسازی از ساقه و طوقه، ابتدا به مدت 10 ثانیه در محلول هیپوکلریت سدیم %1 و سپس به مدت 3-2 دقیقه در اتانول %70، ضدعفونی سطحی شدند. پس از آن، سختینهها با آب مقطر سترون شستشو داده شده و روی کاغذ خشک‌کن سترون خشک شدند؛ سـپس به تـشتک‌های حاوي محیـط کشت PDA منتقل گردیدند. تشتک‌ها در تاریـکی و در دمـای اتـاق (°C22-24) نگهداری شدند. پرگنه قارچ پس از 5-3 روز ظاهر شد. جدایه‌ها پس از خالص‌سازی به روش نوک هیف، به تشتکهای جدید حاوی PDA منتقل شده و در یخچال تحت دمای °C4 نگهداری شدند.
شکل 1- نقشه پراکنش جغرافیایی جدایههای Sclerotinia sclerotiorum از مزارع کلزا در استان مازندران. این نقشه با استفاده از نرم‌افزار QGIS Desktop (نسخه 8. 40. 3) تهیه شده است.
Fig. 1. Geographic distribution map of Sclerotinia sclerotiorum isolates from rapeseed fields in Mazandaran Province. The map was generated using QGIS Desktop (version 3.40.8)
تعیین گروه‌های سازگار میسلیومی (MCGs)
جهت تعیین سازگاری یا ناسازگاری بین جدایههای مختلف قارچ، آزمون سازگاری میسلیومی بر اساس روش شافر و کوهن (Schafer and Kohn, 2006) انجام شد. جدایه‌ها ابتدا روی محیط کشت PDA کشت داده شدند. سپس، قرصهای میسلیومی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت‌های در حال رشد سه تا چهار روزه برداشته و در تشتکهای ۹ سانتی‌متری حاوی محیطPDA، که به آن ۷۵ میکرولیتر بر لیتر رنگ خوراکی قرمز مک‌کورمیک (McCormick’s red food coloring) به‌منـظور افزایـش وضـوح خطوط واکنـش ناسازگار افزوده شده بود، قرار داده شـدند. قرصهای میـسلیومی با فاصله تقریبی 5/3 سانتی‌متر از یکدیگر جفت شدند. تشتک‌ها در دمای °C22-24 و تاریکی نگهداری و پس از گذشت چهار تا هفت روز مورد ارزیابی قرار گرفتند. هر جدایه با تمام جدایههای دیگر بهصورت دوتایی و در تمامی ترکیبات ممکن جفت شد و هر ترکیب در سه تکرار انجام گردید. جدایه‌ها در صورتی سازگار در نظر گرفته شدند که ریسه‌های دو جدایه در محل تماس بدون تشکیل مرز مشخص با هم ادغام شده و یک کلنی واحد را تشکیل دهند. در مقابل، ناسازگاری با تشکیل خط بهعنوان واکنشی در ناحیه تماس و حد فاصل دو جدایه تعیین گردید، خط مذکور شامل میسلیوم هوایی یا یک نوار قرمز عاری از میسلیوم بود (شکل 2).
شکل 2- واکنشهای سـازگار و ناسـازگار بین جدایههای مختلف S. sclerotiorum روی مـحیط کشت PDA بعد از چهار روز: (a) سازگاری، با ادغام سه کلنی نشان داده شده است؛ (b-c) ناسازگاری، که بهصورت ناحیه واکنش نشان داده شده است: (b) یک ناحیه عاری از میسلیوم همراه با یک خط قرمز مشخص؛ (c) نواری از میسلیوم‌های هوایی یکنواخت.
Fig. 2. Compatible and incompatible reactions among different isolates of S. sclerotiorum tested on PDA medium after four days: (a) Compatibility, indicated by fusion of the three colonies; (b–c) Incompatibility, shown as a barrage zone: (b) a region of no mycelia accompanied by a distinct red line; (c) a band of uniform aerial mycelia.
بررسی تنوع ژنتیکی جدایه‌ها
استخراج DNA و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
برای تهیه توده میسلیوم مورد نیاز جهت استخراج DNA از حاشیه پرگنه در حال رشد هر جدایه، یک قرص میسلیومی پنج میلی‌متری به ارلن حاوی محیط کشت مایع سترون شده عصاره سیب زمینی- دکستروز (PDB) انتقال داده شدند. پس از رشد کافی، توده میسلیومی هر یک از جدایه‌ها با آب مقطر سترون آبکشی شد تا محیط کشت بهطور کامل از روی آن شسته شود. سپس توده میسلیوم روی کاغذ صافی سترون خشک گردید. برای استخراج DNA، حدود یک گرم از میسلیوم خشک شده با استفاده از ازت مایع و هاون سرد پودر و به ویال سترون منتقل گردید و تا زمان استفاده در دمای °C20- نگهداری شد. استخراج DNA با استفاده از روشCTAB انجام شد (Sambrook and Russel, 2001).
برای بررسی تنوع ژنتیکی قارچ S. sclerotiorum، از 10 جفت آغازگر ریزماهواره طراحی شده توسط سیرجوسینگ و کوهن (Sirjusingh and Kohn, 2001)، که در مـطالـعـات پیـشین چـند شـکـلی بـالایی نـشان دادند، استفاده شد (Barari et al., 2012, 2017؛ Hemmati et al., 2009). براي نشان دادن تنوع در تمامی جدایه‌ها، تکثیر DNA با استفاده از واکـنش زنجـیره‌اي پلیمراز و آغازگرها (جدول 1) بهطور جداگانه انجام شد. مخلوط واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 10 میکرولیتر PCR Master Mix (Amplicon, Denmark)، یک میکرولیتر از هر آغازگر (یک میکرولیتر آغازگر مستقیم و یک میکرولیتر آغازگر معکوس) (غلظت نهایی 5/0 میکرومولار برای هر آغازگر)، 5/1 میکرولیتر DNA ژنومی (با غلظت 100 نانوگرم بر میکرولیتر) و آب مقطر دیونیزه به‌منظور تکمیل حجم واکنش بود. پس از قرار دادن میکروتیـوب‌ها در دسـتگاه ترموسـایکلر (Eppendorf Mastercycler)، دمای اتصال آغازگرها در واکنش PCR به شرح جدول 1 تنظیم گردید.
چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت سازی اولیه در °C95 به مدت چهار دقیقه، سپس 32 چرخه شامل واسرشتسازی در °C94 بهمدت 40 ثانیه، اتصال و هیبرید شدن آغازگرها در دمای °C55-63 بسته به نوع آغازگر بهمدت 40 ثانیه، گسترش در °C72 بهمدت یک دقیقه و نهایتاً یک چرخه بسط نهایی در °C72 بهمدت پنج دقیقه بود. الکتروفورز محصولات PCRروی ژل آگارز سه درصد در بافر TAE 1x، در ولتاژ ۱۴۵ ولت به مدت دو تا سه ساعت انجام شد. وزن مولکولی باندها با استفاده از DNA ladder (100 bp DNA Ladder, CinaGen) در محدوده 100 تا ۱۵۰۰ جفت باز بهعنوان مرجع اندازه در طی الکتروفورز تعیین گردید.
تجزیه و تحلیل دادهها
تنوع هاپلوتیپ و فراوانی مرتبط با آن با استفاده از نرم‌افزار PowerMarker 3.25 (Liu and Muse, 2005؛ North Carolina State University, Bioinformatics Research Center, Raleigh, NC, USA) بهدست آمد. شاخصهای تنوع ژنتیکی شامل تعداد آللهای مشاهده شده (Na)، تعداد آللهای مؤثر (Ne)، تنوع ژنی نئی (h)، شاخص تنوع شانون (I)، و فاصله ژنتیکی با بهرهگیری از نرم‌افزار GenAlEx 6.5 (Peakall and Smouse, 2012؛ Australian National University, Research School of Biology, Canberra, Australia) محاسبه شدند. دندروگرام روابط فیلوژنتیکی نیز با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc 2.2 (Rohlf, 2009; Exeter Software, Setauket, NY, USA) ترسیم گردید.
جدول 1- آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده برای تعیین ویژگی جدایههای S. sclerotiorum از کلزا در استان مازندران
Table 1. Microsatellite primers used to characterize isolates of S. sclerotiorum from rapeseed in Mazandaran province
دمای اتصال Tm (Â◦C)b | توالی موتیف Repeat motif | توالی آغازگر Primer sequence (5-3) | جایگاه ژنی Locusa |
63 | (GT)8 | GTAACACCGAAATGACGGC | 5-2 |
63 | (GA)14 | TTTGCGTATTATGGTGGGC ATGGCGCAACTCTCAATAGG | 7-2 |
60 | CA12 | CACTCGCTTCTCCATCTCC | 8-3 |
63 | (CA)9(CT)9 | GCCGATATGGACAATGTACACC | 9-2 |
55 | (CA)9 | CGATAATTTCCCCTCACTTGC | 12-2 |
60 | TACA10 | GTTTTCGGTTGTGTGCTGG GCTCGTTCAAGCTCAGCAAG | 55-4 |
55 | (CT)12
| TCGCCTCAGAAGAATGTGC AGCGGGTTACAAGGAGATGG | 92-4 |
55 | (CATA)25 | TGCATCTCGATGCTTGAATC | 106-4 |
60 | (TATG)9 | ATCCCTAACATCCCTAACGC | 110-4 |
60 | (AGAT)14(AAGC)4 | GCTCCTGTATACCATGTCTTG | 114-4 |
a (Sirjusingh and Kohn, 2001) اقتباس از سیرجوسینگ و کوهن
b Optimized annealing temperature
نتایج
در این مطالعه، تعداد ۵۶ جدایه از قارچ S. sclerotiorum جداسازی و مورد مطالعه قرار گرفتند. این جدایه‌ها از هفت شهرستـان اسـتان مازنـدران، از جـمله گـلوگاه (6 جدایه)، بهـشهر (9 جدایه)، نکا (11 جدایه)، میاندورود (6 جدایه)، ساری (10 جدایه)، جویبار (8 جدایه)، و بابل (6 جدایه) جمعآوری شدند (جدول 2 و شکل 1).
جدول 2- منطقه نمونهبرداری، گروه‌های سازگار میسلیومی (MCGs) و هاپلوتیپ SSR در ۵۶ جدایه S. sclerotiorum.
Table 2. Sampling region, mycelial compatibility groups (MCGs), and SSR haplotype of 56 S. sclerotiorum isolates.
جدایه Isolate | منطقه نمونه برداری (شهرستان) Sampling region (County) | گروه سازگاری میسلیومی MCG | هاپلوتیپ haplotype | جدایه Isolate | منطقه نمونه برداری (شهرستان) Sampling region (County) | گروه سازگاری میسلیومی MCG | هاپلوتیپ haplotype |
GS1 | Sangyabsar (G) سنگی ابسر | 1 | 10 | MD2 | Darabkola (M)دارابکلا | 19 | 17 |
GG1 | Ghalepayan (G) قلعه پایان | 14 | 4 | MA2 | Asram (M) اسرام | 11 | 2 |
GG3 | Ghalepayan (G) قلعه پایان | 9 | 11 | MJ1 | Jafkhaneh (M) جف خانه | 11 | 1 |
GL2 | Lamrask (G) لمراسک | 1 | 1 | MT2 | Dashtenaz (M) دشت ناز | 3 | 18 |
GH1 | Hasanabad (G) حسن آباد | 13 | 12 | ST1 | شویلاشت-اروت Shevilasht-Erout (S) | 25 | 1 |
GM2 | Mehdiraje (G) مهدیراجه | 1 | 1 | SL2 | شویلاشت-خاله خیل Shevilasht-Khalekheyl (S) | 2 | 1 |
BH1 | Hosseinabad (BE) حسین آباد | 28 | 4 | SN1 | شویلاشت-نوکنده Shevilasht-Nokandeh1 (S) | 2 | 19 |
BT1 | Gharetape (BE) غارتپه | 1 | 1 | SE | پنبه زرکوتی Panbehzarkoti-Esfandan (S) | 15 | 20 |
BG2 | Gorjimahale (BE) گرجی محله | 1 | 13 | SJ1 | فریم-جعفرکلا Farim- Jafarkola (S) | 18 | 1 |
BV1 | Rakavand (BE) رکاوند | 31 | 4 | SB1 | سمسکنده-اسبوکلا Semeskandeh- Esbukola (S) | 10 | 1 |
BV2 | Rakavand (BE) رکاوند | 32 | 14 | SB2 | سمسکنده-اسبوکلا Semeskandeh- Esbukola (S) | 2 | 21 |
BP2 | Pasand (BE) پسند | 6 | 15 | SR1 | شویلاشت-کرسام Shevilasht- Karsam (S) | 9 | 22 |
BZ1 | Tazehabad (BE) تازه آباد | 21 | 9 | SR2 | شویلاشت-کرسام Shevilasht- Karsam (S) | 16 | 3 |
BL1 | klack (BE) کلاک | 22 | 9 | SU1 | فرح آباد سوته-شمال North Farahabad- Souteh (S) | 16 | 23 |
BE1 | Emamdeh (BE) امامده | 1 | 1 | JD | Duncha (J) دونچا | 24 | 24 |
NU1 | Umal (N) اومال | 7 | 4 | JM2 | Mianmelk (J) میان ملک | 8 | 3 |
NA2 | Ablou (N) آبلو | 29 | 2 | JM3 | Mianmelk (J) میان ملک | 4 | 25 |
NA3 | Ablou (N) آبلو | 2 | 2 | JR | Rangrizmahaleh (J) رنگریزمحله | 26 | 26 |
NP1 | Chalehpol (N) چاله پل | 4 | 8 | JL | Aliabad (J) علی آباد | 27 | 3 |
NP2 | Chalehpol (N) چاله پل | 7 | 7 | JK1 | Kordkola (J) کردکلا | 4 | 27 |
NP3 | Chalehpol (N) چاله پل | 7 | 7 | JK2 | Kordkola (J) کردکلا | 8 | 3 |
NB | Berijan (N) بریجان | 23 | 4 | JO1 | Golmahaleh (J) گل محله | 6 | 2 |
NN1 | Nozarabad (N) نوذرآباد | 1 | 16 | BM1 | Moalemkola (BA) معلم کلا | 5 | 28 |
NZ1 | Ziaratkola (N) زیارتکلا | 12 | 6 | BM3 | Moalemkola (BA) معلم کلا | 20 | 1 |
NZ2 | Ziaratkola (N) زیارتکلا | 12 | 2 | BA2 | Lalehabad (BA) لاله آباد | 5 | 29 |
NS2 | Samandareh (N) سامان دره | 4 | 8 | BA3 | Lalehabad (BA) لاله آباد | 5 | 30 |
MS | Sourbon (M) سوربان | 17 | 2 | BF1 | Afrakoti (BA) افراکوتی | 30 | 31 |
MU1 | Ussa (M) اوسا | 3 | 6 | BF3 | Afrakoti (BA) افراکوتی | 5 | 4 |
a G, Galugah; BE, Behshahr; N, Neka; M, Miandorod; S, Sari; J, Juybar; BA, Babol
سازگاری میسلیومی
مطالعات مربوط به تعیین گروههاي سازگار میسلیومی برای گروه‌بندی جدایههای S. sclerotiorum بر اساس سازگاری میسلیومی آنها انجام شد. از بین 56 جدایه بررسی شده، 32 گروه سازگار میسلیومی شناسایی شد که 5/62 درصد آنها تنها شامل یک جدایه بودند و در بقیه گروه‌ها، بیش از یک جدایه در هر گروه وجود داشت (جدول 2). گروه سازگاری میسلیومی MCG 1 با هفت جدایه، بیشترین تعداد جدایه‌ها را به خود اختصاص داد. این جدایه‌ها از شهرستانهای گلوگاه، بهشهر و نکا جمعآوری شده بودند. سایر MCGها شامل 2 تا 4 جدایه بودند. نتایج بهدست آمده نشان داد که جدایههای یک منطقه نمونهبرداری اغلب بهMCG های متفاوتی تعلق داشتند. بهعنوان مثال، دو جدایه SR1 و SR2 از مزارع کرسام در ساری به ترتیب در MCG 9 وMCG 16 قرار گرفتند، در حالیکه دو جدایه JK1 و JK2 از مزارع کردکلا در جویبار به MCG 4 و MCG 8 اختصاص یافتند. با اینحال، در برخی موارد، جدایههای یک منطقه در یک MCG مشترک قرار گرفتند. بهعنوان نمونه دو جدایه NZ1 و NZ2 که از مزارع زیارت کلا در نکا جمعآوری شدند، هر دو به MCG 12 تعلق داشتند (جدول 2).
تنوع ژنتیکی بر اساس نشانگرهای ریزماهواره
تنوع ژنتیکی ۵۶ جدایه S. sclerotiorum با استفاده از 10 جفت پرایمر ریزماهـواره که تنـوع آللی مناسبی را نشان دادهاند، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تکثیر ۱۰ جفت پرایمر در جدول 3 ارائه شده است. در مجموع 46 آلل شناسایی شد که تعداد آلل‌ها در هر لوکوس بین ۲ تا 14 عدد متغیر بود. میانگین تعداد آلل در کل جایگاه‌ها برابر با 6/4 بود. اندازه آلل‌ها بین ۱6۸ تا 600 جفت باز متغیر بود، بهطوریکه کوچک‌ترین باند مربوط به نشـانگر 2-7 و بزرگ‌ترین باند مربوط به نشانگر 4-106 شناسایی شد. دامنه تنوع ژنی نئی بین 2812/0 تا 8820/0 متغیر بود (جدول 3). بر اساس داده‌های ریزماهواره‌ای، در مجموع 31 هاپلوتیپ در میان ۵۶ جدایه از هفت جمعیت S. sclerotiorum شناسایی شد (جدول 2 و 4). تعـداد هاپلوتیـپ‌ها در هر جـمعیت بین 5 تا 7 متـغیر بود (جدول 4) و 9 هاپلـوتیپ بـین دو یا چنـد جدایه مشترک بودند (شکل 3).
جدول 3- تنوع ژنتیکی در ۱۰ جایگاه ریزماهواره مورد استفاده برای تحلیل S. sclerotiorum جمع‌آوری‌شده از استان مازندران
Table 3. Genetic variation at 10 microsatellite loci used to analysis S. sclerotiorum collected from Mazandaran province
تنوع ژنی Gene diversity | محدوده اندازه Size range (bp) | آلل های مشاهده شده Alleles observed | جایگاه ژنی Locus |
0.4591 | 318-320 | 2 | 5-2 |
0.3367 | 168-172 | 2 | 7-2 |
0.5503 | 240-255 | 4 | 8-3 |
0.2812 | 356-370 | 3 | 9-2 |
0.4649 | 212-220 | 3 | 12-2 |
0.6109 | 178-220 | 5 | 55-4 |
0.4789 | 369-377 | 3 | 92-4 |
0.8820 | 498-600 | 14 | 106-4 |
0.6926 | 340-357 | 4 | 110-4 |
0.6664 | 350-388 | 6 | 114-4 |
a تنوع ژنی محاسبه شده توسط روش نئی (نئی 1973)
a Gene diversity calculated via Nei's method (Nei 1973)
متداول‌ترین هاپلوتیپ در 10 جدایه (GL2، GM2، BE1، BT1، MJ1، SL2، SB1، SJ1، ST1، BM3) مشاهده شد، که این جدایه‌ها از پنج شهرستان گلوگاه، بهشهر، میاندرود، ساری و بابل جمعآوری شدهاند. دومین هاپلوتیپ رایج، که در سه لوکوس با هاپلوتیپ نخست تفاوت داشت، در مجموع در 6 جدایه (NA3، NZ2، NA2، MA2، MS، JO1) شناسایی شد. این جدایه‌ها از شهرستانهای نکا، میاندرود و جویبار جمعآوری شدهاند. تعداد 22 هاپلوتیپ باقی‌مانده (% 97/70) با فراوانی کم، تنها در یک جدایه مشاهده شدند. هاپلوتیپهای مشترک میان جمعیتها نشاندهنده تبادل هاپلوتیپ‌ها بین جمعیتها و یا نشاندهنده جمعیتهایی با منشأ یکسان هستند (Hemmati et al., 2009).
جدول 4- تخمین تنوع ژنتیکی جمعیتهای قارچ S. sclerotiorum بر اساس نشانگر SSR
Table 4. Estimation of genetic variability in S. sclerotiorum populations based on SSR marker
If | He | Ned | Nac | H(unique) | Hb | na | Population | جمعیت |
0.8030 | 0.4888 | 2.2325 | 2.60 | 2 | 5 | 6 | Galugah | گلوگاه |
0.8751 | 0.5111 | 2.4545 | 2.90 | 4 | 7 | 9 | Behshahr | بهدشت |
0.8256 | 0.4909 | 2.3174 | 2.80 | 3 | 6 | 11 | Neka | نکا |
0.7780 | 0.4666 | 2.1454 | 2.60 | 2 | 5 | 6 | Miandorod | میان دورود |
0.7034 | 0.4120 | 1.8291 | 2.70 | 5 | 7 | 10 | Sari | ساری |
0.8123 | 0.5062 | 2.1951 | 2.60 | 4 | 6 | 8 | Juybar | جویبار |
0.7493 | 0.4444 | 2.1012 | 2.60 | 4 | 6 | 6 | Babol | بابل |
a اندازه جمعیت، b هاپلوتیپ، c تعداد آللهای مشاهده شده، d تعداد آللهای موثر، e تنوع ژنی نئی، f شاخص اطلاعات شانون
a Population size, b Haplotype, c Observed number of alleles, d Effective number of alleles,
e Nei gene diversity, f Shannon information index
شکل 3- فراوانی هاپلوتیپهای ریزماهواره برای جمعیتهای S. sclerotiorum از کلزا در مازندران برای 9 هاپلوتیپ شامل بیش از یک جدایه
Fig. 3. Microsatellite haplotype frequency for seven S. sclerotiorum populations from rapeseed in Mazandaran for 9 haplotypes comprising more than one isolate
بحث
در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 56 جدایه قارچ S. sclerotiorum بر اساس گروههاي سازگاري میسلیومی (MCGs) و نشانگرهای ریز ماهواره (SSR) مورد بررسی قرار گرفت. گروه‌های سازگاری میسلیومی نشاندهنده توانایی ادغام یا عدم ادغام میسلیوم بین جدایه‌ها هستند، در حالیکه نشانگرهای ریزماهواره بهعنوان ابزاری حساس برای تحلیل ساختار ژنتیکی و ارزیابی تنوع جمعیتی شناخته می‌شوند.
نتایج این تحقیق نشان داد که ساختار جمعیتی S. sclerotiorum در مزارع کلزای استان مازندران، شامل ترکیبی ناهمگن از گروه‌های سازگاری میسلیومی است. شناسایی 32 گروه سازگاری از میان 56 جدایه مورد بررسی، بیانگر تنوع ژنتیکی بالای این قارچ در مناطق مطالعه شده میباشد. چنین تنوعی میتواند حاصل نرخ بالاي مهاجرت، تبادل ژنتیکی یا نوترکیبی در جمعیتهای قارچی باشد (Kohli et al., 1995). از میان 32 گروه شناسایی شده، 20 گروه تنها شامل یک جدایه بودند. این امر میتواند ناشی از جهش‌های تصادفی یا ورود اخیر این گروه‌ها به منطقه باشد. مطالعات مشابه نیز در مناطق مختلف جهان از جمله شمال شرق چین (Liu et al., 2018)، ایالات متحده آمریکا (Aldrich-Wolf et al., 2015)، و ایران (Irani et al., 2011؛ Barari et al., 2012, 2014؛ یوسفدوست و قوستا، 1394) گزارش شدهاند که همگی بر وجود تنوع بالا در MCGهای این قارچ در میزبانهایی مانند آفتابگردان، کلزا، سویا، لوبیا، هویج و کلم تأکید دارند.
شکل 4- دندروگرام (UPGMA)، نشاندهنده روابط ژنتیکی میان هفت جمعیت S. sclerotiorum بر اساس فاصله ژنتیکی نئی
Fig. 4. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) dendrogram showing the genetic relationships among the seven populations of S. sclerotiorum based on Nei’s genetic distance
در همین راستا، کریمی و همکاران (Karimi et al., 2012) تعداد 35 گروه سازگاری میسلیومی مجزا را از میان 57 جدایه جمع‌آوری‌شده از مزارع کلزا در استان گلستان شناسایی کردند که مؤید تنوع بالای جمعیتهای این قارچ در ایران است. مطـالعات مشـابه از سـایر منـاطـق جغرافیایی نیز یافته‌های مـشابهی را گزارش کرده‌اند. به‌عنـوان مثال، یو و همکاران (Yu et al., 2020) در بررسی 90 جدایه از مزارع کلزای شهر چونگ‌چینگ در چین، 47 گروه سازگاری میسلیومی شناسایی کردند که 72 درصد از آنها شامل تنها یک جدایه بودند. همچنین، توتووا و همکاران (Tóthová et al., 2021) نیز در مطالعه‌ای روی ۴۰ جدایه از مزارع کلزا در اسلواکی، تنوع قابل‌توجهی در ساختار جمعیتی این قارچ گزارش کردند. بهطور کلی، مطالعات انجام‌شده بر روی مجموعه‌های متنوعی از جدایههای S. sclerotiorum در مزارع کلزا از مناطق جغرافیایی مختلف، اطلاعات ارزشمندی را در خصوص شناخت بهتر تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی این بیمارگر فراهم می‌آورند.
نشانگرهای ریزماهواره، که به دلیل نرخ بالای جهش و ماهیت چندآللی خود شناخته شدهاند، به‌ویژه در تحلیل‌های فیلوژنتیکی دقیق از ارزش بالایی برخوردارند (Sirjusingh and Kohn, 2001). در این تحقیق، با استفاده از ۱۰ نشانگر ریزماهواره، تعداد 46 جایگاه پلی‌مورفیک (آلل) در ۵۶ جدایه جمع‌آوری‌شده از هفت شهرستان استان مازندران شناسایی شد. جایگاه 4-106 با 14 باند بیشترین آلل را در میان آللهای تولیدی به خود اختصاص داد. همچنین، این جایگاه با مقدار تنوع ژنی نسبتاً بالا (8820/0) نشان میدهد که دارای تنوع آللی بالایی در میان جدایههاست و میتواند نشانگر مناسبی برای بررسی تمایز ژنتیکی باشد، زیرا تفکیک بهتری در بین جمعیتها و درون جمعیتها انجام میدهد. تعداد کل هاپلوتیپ‌ها بر اساس ترکیب‌های آللی منحصر به فرد در جایگاه‌های ریزماهواره و شمارش هاپلوتیپهای متمایز موجود تعیین گردید. در مجموع، 31 هاپلوتیپ از ۵۶ جدایه (% 36/55) شناسایی شد و 22 جدایه تنها دارای یک هاپلوتیپ بودند. کلارکسون و همکاران (Clarkson et al., 2013) تعداد 228 هاپلوتیپ SSR را در 384 جدایه (%59) از بریتانیا شناسایی کردند، در حالیکه یو و همکاران (Yu et al., 2020) تعداد 52 هاپلوتیپ را در 90 جدایه (%58) از شهر چونگ‌کینگ چین گزارش کردند. بهطور مشابه، لـهنر و همکاران (Lehner et al., 2015) نسبت مشـابهی از هاپـلوتیپ‌ها را در جـمعـیت‌های S. sclerotiorum در برزیل شناسایی کردند. براری و همکاران (Barari et al., 2017) نیز در بررسی 52 جدایه از مزارع کلزا در استان مازندران تعداد 27 هاپلوتیپ را گزارش کردند. همچنین، سکستون و هاولت (Sexton and Howlett, 2004) با استفاده از هشت نشانگر ریزماهواره بر روی 154 جدایه S. sclerotiorum جمعآوری شده از مزارع کلزا در استرالیا، تعداد 82 هاپلوتیپ (25/53) مختلف را شناسایی کردند که بسیاری از آنها در هر جمعیت منحصربهفرد بودند. این یافته‌های مشابه در مناطق جغرافیایی مختلف، نشاندهنده تنوع ژنتیکی بالای این قارچ بیماری‌زا است.
در این مطالعه، ۹ هاپلوتیپ بین دو یا چند جدایه مشترک بود و دو هاپلوتیپ با بیشترین فراوانی، در تمام شهرستانهای بررسی شده مشاهده شدند. چنین الگوهایی ممکن است ناشی از چند فرآیند هم‌زمان باشد، از جمله تکثیر کلونال ژنوتیپ(های) موفق از طریق تولیدمثل غیرجنسی و ماندگاری سختینهها که امکان بقا و گسترش محلی را فراهم میکند. علاوه بر این، انتقال انسان‌محور (مثلاً از طریق خاک یا تجهیزات کشاورزی آلوده) میتواند جریان ژنی بین مزارع مجاور را تسریع کند. اگرچه شواهد مستقیم برای S. sclerotiorum محدود است، اما ساختار جمعیتی غالباً کلونال این قارچ نشان میدهد که جابجایی محلی و انسان‌محور میتواند نقش داشته باشد. انتقال طبیعی نیز حائز اهمیت است؛ سختینهها میتوانند مدت طولانی در شرایط مزرعه‌ای باقی بمانند و توسط آب جابهجا شوند، که بقای محیطی و پراکنش را تسهیل میکند (Pethybridge et al., 2024). آسکوسپورهای هوازاد نیز عامل مهمی در پراکنش درون‌مزرعه‌ای و بین‌مزارع هستند و نقش کلیدی در پراکنش ژنتیکی در فواصل دور دارند. این آسکوسپورها محصول آمیزشهای جنسی میان ژنوتیپهای مشابه یا متفاوتاند، که میتوانند منجر به تولید نسلهایی با ساختار ژنتیکی مشابه شوند (Reich et al., 2024). ترکیب پراکنش هوابرد آسکوسپورها با گسترش کلونال، میتواند منجر به توزیع گسترده ژنوتیپهای مشابه شود؛ سازوکاری که با ساختار جمعیتی غالباً کلونال S. sclerotiorum سازگار است. گزارش‌هایی از وجود هاپلوتیپهای ریزماهواره مشترک در بین جمعیتهای مناطق مختلف از جمله چین نیز وجود دارد (Yu et al., 2020). همچنین، بر اساس گزارش همتی و همکاران (Hemmati et al., 2009)، از میان 80 هاپلوتیپ شناسایی شده از استانهای مازندران، گلستان، گیلان و اردبیل، 19 هاپلوتیپ (% 7/23) در میان دستکم دو جمعیت منطقهای مشترک بودند.
در تجزیه خوشهای جمعیتها بر اساس دندروگرام (UPGMA)، جمعیتهای بهشهر و گلوگاه کمترین فاصله ژنتیکی (035/0) را نشان داده و در یک خوشه نزدیک به هم قرار گرفته‌اند. این میتواند نشاندهنده تبادل ژنی یا منشاء ژنتیکی مشترک آنها باشد. جمعیت نکا نیز در مرحله بعد به این خوشه افزوده شده و ارتباط نسبتاً نزدیکی با این دو جمعیت دارد. در گروه اول، جمعیتهای ساری و میاندرود از سایر جمعیتها متمایز شدند. در سمت دیگر، جمعیت بابل در یک خوشه مجزا قرار گرفت و بیشترین فاصله ژنتیکی (248/0) را با جویبار نشان داد.
در ایـن پژوهـش، همـبسـتگی بـیـن هاپلوتیـپ‌هـای ریزماهـواره و گـروه‌هـای سـازگاری میـسلیـومـی مـعنی‌دار نـبود (75/0 = r، 36/0= p [Cramér’s V]. در واقـع، تطابق قابـل‌توجهی بیـن هاپلـوتیـپ‌های حاصل از نشانگرهای ریزماهواره‌ای (SSR) و گروه‌های سازگاری میسلیومی (MCGs) مشاهده نشد؛ بهطوریکه هر گروه سازگاری میسلیومی شامل جدایه‌هایی با هاپلوتیپهای متفاوت بود و در مقابل، جدایههای متعلق به یک هاپلوتیپ نیز الزاماً در یک گروه سازگاری قرار نداشتند. این الگو با یافته‌های پژوهش‌های پیشین (Hemmati et al., 2009) هم‌راستا است که عدم ارتباط نزدیک بین MCGها و نشانگرهای SSR را گزارش کرده‌اند. یو و همکاران (Yu et al., 2020) نیز در جمعیتهای S. sclerotiorum شهر چونگ‌چینگ چین، ارتباط معناداری بین هاپلوتیپهای SSR و گروه‌های MCG نیافتند و این امر را به احتمال وقوع نوترکیبی در جمعیت نسبت دادند.
یکی از دلایل احتمالی این عدم همبستگی میتواند وقوع نوترکیبی ژنتیکی (جنسی یا شبه‌جنسی) در جمعیت باشد، که منجر به بازآرایی آلل‌ها در جایگاه‌های SSR می‌شود بدون آن‌که الگوهای سازگاری میسلیومی تغییر یابد. علاوه بر این، اپیستازی و اثرات برهم‌کنش ژنی نیز ممکن است سبب فرگشت مستقل ژن‌های دخیل در تعیین MCG از تنوع ژنومی در نشانگرهای SSR گردند. از سوی دیگر، SSRها اغلب نواحی غیرکُدکننده ژنوم را نشان می‌دهند، در حالیکه گروه‌های سازگاری میسلیومی تحت کنترل مجموعه‌ای از ژن‌های خاص سازگاری هتروکاریونی قرار دارند؛ بنابراین تنوع در این دو سیستم الزاماً هم‌راستا نیست. احتمال وجود جریان ژنی بین جمعیتها و جهش‌های نقطه‌ای در ژن‌های کنترل‌کننده سازگاری میسلیومی نیز میتواند به ایجاد چنین الگوهای ناهمخوانی منجر شود.
با این حال، یافته‌های متناقضی نیز در این زمینه گزارش شدهاند. بهعنوان مثال، سیلوا و همکاران (Silva et al., 2021) وجود همبـسـتـگـی نزدیـکـی بـیـن MCGs و MLLs (multi-locus lineage) را گـزارش کـردنـد. همچنین لیو و همکاران (Liu et al., 2018) نشان دادند همبستگی قوی بین نتایج آزمون MCGs و نشانگرهای ریزماهواره وجود دارد. در مطالعه آلدریچ ولف و همکاران (Aldrich-Wolfe et al., 2015) جدایههای متعلق به یک گروه سازگاری میسلیومی معمولاً دارای هاپلوتیپهای یکسان یا بسیار مشابه بودند، بهطوریکه اختلاف آنها تنها در یک یا دو جایگاه از مجموع ۱۲ جایگاه پلی‌مورفیک مشاهده شد. سکستون و هاولت (Sexton and Howlett, 2004) نیز نشان دادند که توالی‌ها یا هاپلوتیپهای مشابه یا نزدیک، معمولاً به گروه‌های MCG مشابه تعلق داشتند، یعنی نشانگرهای ریزماهواره با گروه‌بندی MCG همخوانی داشتند. این گزارش‌های متناقض حاکی از آن است که میزان همبستگی بینMCG ها وSSR ها ممکن است به جمعیت مورد بررسی، شرایط بوم‌شناختی، ساختار ژنتیکی منطقهای و روش‌های تحلیلی مورد استفاده وابسته باشد.
نتایج این تحقیق اطلاعات ارزشمندی درباره تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی S. sclerotiorum در مزارع کلزای استان مازندران ارائه میدهد. یافته‌ها نشان میدهد که این قارچ دارای توانایی بالایی در سازگاری با شرایط محیطی مختلف است و میتواند تحت تأثیر تغییرات اکوسیستمی دچار تحول ژنتیکی شود. شناخت دقیق تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت این پاتوژن میتواند نقش کلیدی در تدوین راهبردهای مؤثر برای مدیریت بیماری ایفا کند. بهطور کلی، برنامه‌های اصلاحی باید بر اساس شناخت دقیق ساختار ژنتیکی پاتوژن در هر منطقه طراحی شوند تا بتوانند مقاومت پایدار و مؤثری در برابر بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه ایجاد کنند. نتایج این تحقیق بر اهمیت پرورش ارقام مقاوم کلزا متناسب با ساختار ژنتیکی جمعیتهای پاتوژن در هر منطقه تأکید دارد. انتخاب و توسعه ارقامی که بهطور ویژه برای مقابله با ساختار ژنتیکی پاتوژن‌های بومی طراحی شدهاند، میتواند اثربخشی راهکارهای مدیریت بیماری را بهبود بخشیده و از خسارات اقتصادی ناشی از آن جلوگیری کند.
منابع References
یوسف دوست، و. و قوستا، ی. 1394. گروههاي سازگار میسلیومی و بیماریزایی جدایههاي قارچ عامل پوسیدگی سر کلم در ارومیه. مجله علمی کشاورزی 38(1): 78-67.
Ajiboye, T.O. Visser, H.G., Erasmus, E. and Schutte-Smith, M. 2025. Recent strategies for controlling the white mould fungal pathogen (Sclerotinia sclerotiorum) using gene silencing, botanical fungicides and nanomaterials. Sustainable Food Technology 3: 612-636.
Aldrich-Wolfe, L., Travers, S. and Nelson, B.D. 2015. Genetic variation of Sclerotinia sclerotiorum from multiple crops in the north central United States. PLoS One 10(9): e0139188. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139188.
Barari, H., Dalili, S.A. and Hassani, H.M. 2017. Genetic diversity among different isolates of Sclerotinia sclerotiorum in north of Iran. Journal of Bacteriology and Mycology 5(5): 387‒389.
Barari, H., Alavi, V. and Badalyan, S.M. 2012. Genetic and morphological differences among populations of Sclerotinina sclerotiorum by microsatellite markers, mycelial compatibility groups (MCGs) and aggressiveness in North Iran. Romanian Agricultural Research 29: 323-331.
Barari, H., Dalili, S.A. and Badalyan, S.M. 2014. Mycelial compatibility grouping and aggressiveness of Sclerotinia sclerotiorum on different hosts in North of Iran. Jordan Journal of Agricultural Sciences 10(1): 45-57. http://dx.doi.org/10.12816/0029873.
Bolton, M.D., Thomma, B.P.H.J. and Nelson, B.D. 2006. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: Biology and Molecular Traits of a Cosmopolitan Pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.
Carbone, I., Anderson, J.B. and Kohn, L.M. 1999. Patterns of descent in clonal lineages and their multilocus fingerprints are resolved with combined gene genealogies. Evolution 53: 11-21.
Clarkson, J.P., Conventry, E., Kitchen. J., Carter, H.E. and Whipps, J.M. 2013. Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in crop and wild hosts in the UK. Plant Pathology 62(2): 309-324.
Irani, H., Heydari, A., Javan-Nikkhah, M. and Ibrahimov, A.S. 2011. Pathogenicity variation and mycelial compatibility groups in Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Plant Protection Research 51(4) 329-336.
Faraghati, M., Abrinbana, M. and Ghosta, Y. 2022. Genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum populations from sunflower and cabbage in West Azarbaijan province of Iran. Scientific Reports 12: 9263. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13350-7.
Hemmati, R., Javan-Nikkhah, M. and Linde, C.C. 2009. Population genetic structure of Sclerotinia sclerotiorum on canola in Iran. European Journal of Plant Pathology 125: 617-628.
Karimi, E., Safaie, N. and Shams-Bakhsh, M. 2012. Mycelial compatibility groupings and pathogenic diversity of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary populations on canola in Golestan Province of Iran. Journal of Agricultural Science and Technology 14: 421-434.
Khan, M.A., Cowling, W.A., Banga, S.S., Barbetti, M.J., Cantila, A.Y., Amas, J.C., Thomas, W.J., You, M.P., Tyagi, V., Bharti, B. and Edwards, D. 2023. Genetic and molecular analysis of stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) resistance in Brassica napus (canola type). Helyon 9: 1-12. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e19237.
Kohli, Y., Brunner, L.J., Yoell, H, Milgroom, M.G., Anderson, J.B., Morrall, R.A. and Kohn, L.M. 1995. Clonal dispersal and spatially mixing in populations of the plant pathogenic fungus, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology 4(1): 69-77.
Kohn, L.M. 1995. The clonal dynamic in wild and agricultural plant pathogen populations. Canadian Journal of Botany 73(S1): 1231–1240. http://dx.doi.org/10.1139/b95-383.
Lehner, M.S., Paula Júnior, T.J., Hora Júnior, B.T., Teixeira, H., Vieira, R.F., Carneiro, J.E.S. and Mizubuti, E.S.G. 2015. Low genetic variability in Sclerotinia sclerotiorum populations from common bean fields in Minas Gerais State, Brazil, at regional, local and micro-scales. Plant Pathology 64: 921-931.
Litholdo Júnior, C.G., Gomes, E.V., Lobo Júnior, M., Nasser, L.C.B. and Petrofeza, S. 2011. Genetic diversity and mycelial compatibility groups of the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum in Brazil. Genetics and Molecular Research 10(2): 868-877.
Liu, J., Meng, Q., Zhang, Y., Xiang, H., Li, Y., Shi, F., Ma, L., Liu, C., Liu, Y., Su, B. and Li, Z. 2018. Mycelial compatibility group and genetic variation of sunflower Sclerotinia sclerotiorum in Northeast China. Physiological and Molecular Plant Pathology 102: 185-192. https://doi.org/10.1016/j.pmpp. 2018.03.006.
Liu, K. and Muse, S.V. 2005. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21(9): 2128–2129. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti282.
McDonald, B.A. and Linde, C. 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40: 349-379. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.40.120501. 101443.
Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 3321-3323.
Pakdaman, B.S. and Goltapeh, E.M. 2007. In vitro studies on the integrated control of rapeseed white stem rot disease through the application of herbicides and Trichoderma species. Pakistan Journal of Biological Sciences 10(1): 7-12.
Peakall, R. and Smouse, P.E. 2012. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-An update. Bioinformatics 28(19): 2537-2539.
Pethybridge, S.J., Murphy, S., Lund, M. and Kikkert, J.R. 2024. Survival of Sclerotinia sclerotiorum sclerotia in central New York. Plant Disease 108(5): 1165-1172.
Reich, J., McLaren, D.L., Kim, Y.M., Wally, O., Yevtushenko, D., Hamelin, R. and Chatterton, S. 2024. Predicting airborne ascospores of Sclerotinia sclerotiorum through machine learning and statistical methods. Plant Pathology 73(6): 1586-1601.
Rohlf, F.J. 2009. NTSYSpc: Numerical taxonomy system (Version 2.2). Exeter Software, Setauket, NY, USA.
Saharan, G.S. and Mehta, N. 2008. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Science + Business Media B.V., Amsterdam.
Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Schafer, M.R. and Kohn, L.M. 2006. An optimized method for mycelial compatibility testing in Sclerotinia sclerotiorum. Mycologia 98(4): 593-597. https://doi.org/10.3852/mycologia.98.4.593.
Sexton, A.C. and Howlett, B.J. 2004. Microsatellite markers reveal genetic differentiation among populations of Sclerotinia sclerotiorum from Australian canola fields. Current Genetics 46(6):357-65.
Silva, R.A., Ferro, C.G., Lehner, M., Jr, T.J.P. and Mizubuti, E.S.G. 2021. The population of Sclerotinia sclerotiorum in Brazil is structured by mycelial compatibility groups. Plant Disease 105: 3376-3384.
Sirjusingh, C. and Kohn, L.M. 2001. Characterization of microsatellites in the fungal plant pathogen, Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Ecology Notes 1(4): 267–269. https://doi.org/10.1046/j.1471-8278.2001.00102.x.
Tóthová, M., Máčajová, P. and Tóth, P. 2021. Mycelial incompatibility of Sclerotinia sclerotiorum isolates from a single rapeseed field in Slovakia. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 11(2). https://doi.org/10.15414/jmbfs.3369.
Tok, F.M., Derviş, S. and Arslan, M. 2016. Analysis of genetic diversity of Sclerotinia sclerotiorum from eggplant by mycelial compatibility, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) analyses. Biotechnology and Biotechnological Equipment 30(5): 921_928.
Xu, D.F., Li, X.L., Pan, Y.M., Dai, Y.L., Li, P., Chen, F.X., Zhang, H.J., Guo, M. and Gao, Z.M. 2014. Genetic diversity and pathogenicity differentiation of Sclerotinia sclerotiorum on rapeseed (Brassica napus L.) in Anhui Province, China. Genetics and Molecular Research 13(4): 10704-10713. https://doi.org/10.4238/2014.december.18.12.
Yu, Y., Cai, J., Ma, L., Huang, Z., Wang, Y., Fang, A., Yang, Y., Qing, L. and Bi, C. 2020. Population structure and agressiveness of Sclerotinia sclerotiorum from rapeseed (Brassica napus) in Chongqing City. Plant Disease 104: 1201-1206.
