بررسی اثرات سلولی و ملکولی و ضدآپوپتوتیک نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس گیاه درمنه کوهی (Artemisia aucheri) بر سلول‌های سرطان تخمدان
الموضوعات : فصلنامه زیست شناسی جانوریفرناز ابوطالبی 1 , مریم تیموری 2
1 - گروه داروسازی، واحد علوم دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - گروه زیست شناسی، واحد رودهن، دانشگاه آزاد اسلامی، رودهن، ایران
الکلمات المفتاحية: نانوذرات لیپیدی, سرطان تخمدان, گیاه درمنه کوهی, ضدآپوپتوتیک,
ملخص المقالة :
سرطان تخمدان یکی از نه سرطان رایج می‌باشد و یکی از پنج دلیل مهم مرگ ناشی از سرطان در زنان است. گياه درمنه با نام علمی Artemisia aucheri Boiss متعلق به خانواده Asteraceae می‌باشد که در تحقیقات زیادی اثربخشی اسانس و عصاره این گیاه بر روی مهار رشد سلول‌های سرطانی گزارش شده است. امروزه از حاملهای نانو به منظور بارگیری اسانس‌های مختلف گیاهی به جهت جلوگیری از اکسیداسیون اسانس‌ها و پایدار ماندن آنها علاوه بر هدفمند کردن و اثر بخشی بهتر استفاده می‌شود. نانو ذرات لیپیدی جامد SLN امروزه در تحقیقات بسیاری به عنوان سيستمهاي حامل براي بارگذاری ویتامینها، داروها و اسانس‌ها استفاده می‌شوند. با توجه به اهمیت سرطان تخمدان و پتانسیل آنتیاکسیدانی گیاه درمنه کوهی، در این مطالعه اسانس گیاه درمنه در نانو ذرات لیپیدی با هدف بررسی اثرات سلولی و ملکولی و ضدآپوپتوتیک بر سلول‌های سرطان تخمدان بارگذاری شد. ابتدا نانوذرات حاوی اسانس درمنه با روش هموژنایزر بعلاوه سونیکاسیون سنتز و متعاقباً خصوصیات فیزیکوشیمیایی آنها (مثل اندازه ذرات، توزیع اندازه ذرهای، پتانسیل زتا، میزان درصد بازدهی بارگذاری اسانس، شکل ذرات) تعیین شدند. یافتهها نشان داد که افزایش غلظت نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس گیاه درمنه کوهی منجر به کاهش درصد زندهمانی سلول‌های سرطان تخمدان (Hella) در مقایسه با اسانس خالص شد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که نانوذرات لیپیدی حاوی عصاره گیاه آرتمیسیا، مسیر آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی تخمدان فعال کرده و در نتیجه باعث توقف رشد تومور شد.
1. Pooladi M, Abad SK, Hashemi M (2014) Proteomics analysis of human brain glial cell proteome by 2D gel. Indian journal of cancer 51:159
2. Teimouri M, Pooladi M (2021) Anti-Angiogenic and Anti-Proliferative Effects of Physalis Alkekengi Hydroalcholic Extract on Breast Cancer in Mice. Journal of Fasa University of Medical Sciences 10:3684–3691.
3. Fleet JC, DeSmet M, Johnson R, Li Y (2012) Vitamin D and cancer: a review of molecularmechanisms. Biochem J 441:61–76
4 Ebrahimi M, Teimouri M, Pooladi M (2021) The synergistic anticancer traits of graphene oxide plus doxorubicin against BT474 and MCF7 breast cancer stem cells in vitro. Appl Biochem Biotechnol 2021:1–6
5. Teimouri M, Odoumizadeh M (2021) Cytotoxicity of Artemisia Vulgaris Essential Oil Encapsulated in SLN on Breast Cancer Cell Line (MCF7). Archives of Advances in Biosciences 12:11–26
6. Moore RG, Brown AK, Miller MC, Skates S, Allard WJ, Verch T et al (2008) The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol 108:402–408
7. Bookman MA (2012) First-line chemotherapy in epithelial ovarian cancer. Clin Obstet Gynecol 55:96–113
8. Ehsanfar P, Teimouri M, Pooladi M (2020) Investigating Characterizations and Antifungal Effects of Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) Loaded with Essential Oil of Citrus Aurantifolia on Isolated Malassezia Strains. Archives of Advances in Biosciences 11:43–55
9. Siegel RL, Miller KD, Jemal A (2019) Cancer statistics, 2019. Cancer J Clin 69:7–34
10. Wang CZ, Calway T, Yuan CS (2012) Herbal medicines as adjuvants for cancer therapeutics. Am J Chin Med 40:657–669
11. Salimifar M, Fatehi-Hassanabad Z, Fatehi M (2013) A review on natural products for controlling type 2 diabetes with an emphasis on their mechanisms of actions. Curr Diabetes Rev 9:402–411
12. Jafariparizi M, Afsharzadeh S, Akkafi HR, Abbasi S (2017) Floristic study of Artemisia aucheri Boiss.rangelands in Isfahan Province, Iran. Nova Biologica Reperta 4:236–245
13. Bora KS, Sharma A (2011) The genus Artemisia: a comprehensive review. Pharm Biol 49:101–109
14. Lai F, Sinico C, De Logu A, Zaru M, Müller RH, Fadda AM (2007) SLN as a topical delivery system for Artemisia arborescens essential oil: in vitro antiviral activity and skin permeation study. Int JNanomed 2:419
15. Müller RH, Mäder K, Gohla S (2000) Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery–areview of the state of the art. European journal of pharmaceutics biopharmaceutics 50:161–177
16. Mukherjee S, Ray S, Thakur RS (2009) Solid lipid nanoparticles: a modern formulation approach in drug delivery system. Indian journal of pharmaceutical sciences 71:349 # 17. Teoh DG, Secord AA (2011) Antiangiogenic therapies in epithelial ovarian cancer. Cancer Control 18:31–43
18. Raha S, Robinson BH (2000) Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing. Trends Biochem Sci 25:502–508
19. Bobrowski K (2005) Free radicals in chemistry, biology and medicine: contribution of radiation chemistry. Nukleonika 50:67–76 Page 12/20
20. Lingayat VJ, Zarekar NS, Shendge RS (2017) Solid lipid nanoparticles: a review. Nanoscience Nanotechnology Research 2:67–72
21. Akrout A, Chemli R, Chreïf I, Hammami M (2001) Analysis of the essential oil of Artemisia campestris L. Flavour Fragr J 16:337–339
22. Gordanian B, Behbahani M, Carapetian J, Fazilati M (2014) In vitro evaluation of cytotoxic activity of flower, leaf, stem and root extracts of five Artemisia species. Research in Pharmaceutical Sciences 9:91
23. Emami SA, Rabe SZ, Ahi A, Mahmoudi M, Tabasi N (2009) Study the cytotoxic and pro-apoptoticactivity of Artemisia annua extracts. Pharmacologyonline 3:1062–1069
24. Mahmoudi M, Rabe SZ, Ahi A, Emami SA (2009) Evaluation of the cytotoxic activity of different Artemisia khorassanica samples on cancer cell lines. Pharmacol online 2:778–786
25. Wong ML, Medrano JF (2005) Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39:75–85
26. Asghari G, Jalali M, Sadoughi E (2012) Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from the seeds of Artemisia aucheri Boiss. Jundishapur journal of natural pharmaceutical products 7:11
27. Gharehmatrossian S, Popov YU, Ghorbanli M, Safaeian S (2012) Antioxidant activities and cytotoxic effects of whole plant and isolated culture of Artemisia aucheri Boiss. Asian Journal of Pharmaceutical Clinical Research 5:95–98
زیستشناسی جانوري، سال هفدهم، شماره چهارم، تابستان 1404، صفحات 104-93، ابوطالبی و تیموری
Investigation of the Cellular, Molecular and Anti-Apoptotic Effects of Lipid Nanoparticles Containing Artemisia aucheri Essential Oil on Ovarian Cancer Cells
Farnaz Aboutalebi, Maryam Teimouri2*
1- Department of Pharmacy, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2- Department of Biology, Roudehen Branch, Islamic Azad University, Roudehen, Iran
*Corresponding author: Teimourimaryam93@gmail.com
Received: 17 March 2025 Accepted: 18 June 2025
DOI: 10.60833/ascij.2025.1208943
Abstract
Ovarian cancer is one of the 9 most common cancers and one of the 5 leading causes of cancer death in women. Artemisia aucheri Boiss belongs to the Asteraceae family, and many studies have reported the effectiveness of its essential oil and extract on inhibiting the growth of cancer cells. Today, nanocarriers are used to load various plant essential oils to prevent oxidation of essential oils and their stability, in addition to better targeting and effectiveness. Solid lipid nanoparticles (SLN) are used in many studies today as carrier systems for loading vitamins, drugs, and essential oils. Given the importance of ovarian cancer and the antioxidant potential of Artemisia aucheri, in this study, the essential oil of Artemisia aucheri was loaded into lipid nanoparticles with the aim of investigating cellular, molecular, and anti-apoptotic effects on ovarian cancer cells. First, nanoparticles containing Artemisia essential oil were synthesized using a homogenizer plus sonication method and subsequently their physicochemical properties (such as particle size, particle size distribution, zeta potential, percentage of essential oil loading efficiency, particle shape) were determined. The findings showed that increasing the concentration of lipid nanoparticles containing Artemisia essential oil led to a decrease in the viability of ovarian cancer cells (Hella) compared to pure essential oil. The results of the present study showed that lipid nanoparticles containing Artemisia extract activated the apoptosis pathway in ovarian cancer cells and consequently stopped tumor growth.
Keywords: Solid Lipid Nanoparticle, Ovarian cancer, Artemisia aucheri, Anti-apoptotic.
بررسی اثرات سلولی و ملکولی و ضدآپوپتوتیک نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس گیاه درمنه کوهی (Artemisia aucheri) بر سلول‌های سرطان تخمدان
فرناز ابوطالبی1، مریم تیموری2*
1- گروه داروسازی، واحد علوم دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- گروه زیستشناسی، واحد رودهن، دانشگاه آزاد اسلامی، رودهن، ایران
*مسئول مکاتبات: teimourimaryam93@gmail.com
تاریخ دریافت: 27/12/1403 تاریخ پذیرش: 28/03/1404
DOI: 10.60833/ascij.2025.1208943
چکیده
سرطان تخمدان یکی از نه سرطان رایج می‌باشد و یکی از پنج دلیل مهم مرگ ناشی از سرطان در زنان است. گياه درمنه با نام علمی Artemisia aucheri Boiss متعلق به خانواده Asteraceae می‌باشد که در تحقیقات زیادی اثربخشی اسانس و عصاره این گیاه بر روی مهار رشد سلول‌های سرطانی گزارش شده است. امروزه از حاملهای نانو به منظور بارگیری اسانس‌های مختلف گیاهی به جهت جلوگیری از اکسیداسیون اسانس‌ها و پایدار ماندن آنها علاوه بر هدفمند کردن و اثر بخشی بهتر استفاده می‌شود. نانو ذرات لیپیدی جامد SLN امروزه در تحقیقات بسیاری به عنوان سيستمهاي حامل براي بارگذاری ویتامینها، داروها و اسانس‌ها استفاده می‌شوند. با توجه به اهمیت سرطان تخمدان و پتانسیل آنتیاکسیدانی گیاه درمنه کوهی، در این مطالعه اسانس گیاه درمنه در نانو ذرات لیپیدی با هدف بررسی اثرات سلولی و ملکولی و ضدآپوپتوتیک بر سلول‌های سرطان تخمدان بارگذاری شد. ابتدا نانوذرات حاوی اسانس درمنه با روش هموژنایزر بعلاوه سونیکاسیون سنتز و متعاقباً خصوصیات فیزیکوشیمیایی آنها (مثل اندازه ذرات، توزیع اندازه ذرهای، پتانسیل زتا، میزان درصد بازدهی بارگذاری اسانس، شکل ذرات) تعیین شدند. یافتهها نشان داد که افزایش غلظت نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس گیاه درمنه کوهی منجر به کاهش درصد زندهمانی سلول‌های سرطان تخمدان (Hella) در مقایسه با اسانس خالص شد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که نانوذرات لیپیدی حاوی عصاره گیاه آرتمیسیا، مسیر آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی تخمدان فعال کرده و در نتیجه باعث توقف رشد تومور شد.
کلمات کلیدی: نانوذرات لیپیدی، سرطان تخمدان، گیاه درمنه کوهی، ضدآپوپتوتیک.
مقدمه
سرطان یکی از دلایل اصلی مرگومیر در بیش از یک سوم جمعیت جهانی است و باعث بیش از 20 درصد کل مرگ و میر در سراسر جهان می‌شود. طبق گزارش آژانس بینالمللی تحقیقات سرطان سازمان بهداشت جهانی که در سال 2014 منتشر شده است، میزان بروز سرطان در حدود 14 میلیون مورد جدید بوده و پیشبینی می‌شود که در سال 2025 به 3/19 میلیون نفر برسد (1). در ایران، میانگین میزان ابتلا به سرطان حدود 1/7 در هر 100000 جمعیت می‌باشد و تخمین زده می‌شود که در هر سال 85000 فرد مبتلا به سرطان می‌شوند و تقریبا 55000 نفر به علت سرطان در هر سال جان خود را از دست می‌دهند (2). در این میان، سرطان تخمدان دومین سرطان زنان و دلیل مرگ و میر ناشی از سرطان دستگاه تناسلی بدخیم زنان است. همچنین، سرطان تخمدان یکی از 9 سرطان رایج می‌باشد و یکی از پنج دلیل مهم مرگ ناشی از سرطان در زنان است که به راحتی در مراحل اولیه قابل تشخیص و درمان است (3). اما اگر به تعویق افتد، درمان مشکل و گاهی ناموفق خواهد بود (4). رایجترین شکل سرطان تخمدان سرطان تخمدان اپیتلیالی است که تاحد زیادی بدون علامت است و بیش از 70 درصد بیماران در مرحله پیشرفته بیماری تشخیص داده می‌شوند که خط اول درمان استاندارد شامل تعیین حجم تومور بوسیله جراحی و درمان مبنی بر شیمیدرمانی ترکیبی است (5). درمان اوليه سرطان تخمدان نتايج كلينيكي خوبي را نشان ميدهد اما بيماران پس از مدتي به درمان مقاوم ميشوند (6). بنابراین، مقاومت به شيميدرماني سدي در برابر درمان سرطان تخمدان به وجود میآورد. در راستای غلبه بر این سد، يافتن داروهايي موثرتر يا مكمل درمان، همراه با عوارض جانبي كمتر براي افزايش طول عمر اين بيماران ضروري است. شواهد سازمان بهداشت جهانی نشان می‌دهد که حدود 70 درصد از جمعیت در سراسر جهان ترجیح می‌دهند از داروهای سنتی و گیاهی برای درمان بیماریهای خود استفاده کنند. در ایران نیز، استفاده از داروهای جایگزین مکمل در دهه گذشته به طور چشمگیری افزایش یافته است (7) . بطوریکه تقریبا 60 درصد از عوامل ضد سرطان از گیاهان دارویی و دیگر منابع طبیعی حاصل می‌شود (8). با این حال هنوز تعداد زیادی از گیاهان دارای پتانسیل ضد سرطانی هستند که هنوز مورد بررسی قرار نگرفتهاند. بنابراین راه حل متناوب برای اثرات مضر داروهای مصنوعی، استفاده از داروهای جایگزین مکمل است. يكي از این گياهان دارويي ارزشمند، گياه درمنه با نام علمي Artemisia می‌باشد که متعلق به خانواده Asteraceae است (9). بسیاری از گونههای این خانواده خواص درمانی از خود نشان دادهاند که به واسطه حضور متابولیتهایی از جمله فلاونوئیدها، کومارینها، استروئید، پلی اتیلن، مونو و سسکویتپنس و لاکتون سوزویتروپن می‌باشد (10). اسانس‌های گیاهی منابعی سرشار از مواد فعال طبیعی و ضروری بیولوژیک هستندکه دارای اثرات چون خاصیت ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدویروسی، حشرهکش، آنتیاکسیدانت و ضدسرطان می‌باشند (4). گیاه درمنه یکی از مهمترین گیاهان دارویی است که برای درمان انواع بیماریها از جمله سرفه، عفونت گوش میانی و درد در کشورهای شرقی شناخته می‌شود (3). این گیاه دارویی به دلیل داشتن مواد فعال ویژه انواع فعالیتهای دارویی مانند اثرات ضد التهابی، ضد ویروسی و ضد سرطان را دارا می‌باشد (11، 12). انکپسوله کردن اسانس‌های گیاهی يكي از كارآمدترين روشها براي افزايش حلاليت و پايداري اسانس‌ها در شرايط نامساعد محيطي و كنترل تركیبات فعال آن است. توسعه فرمولاسیونهای نانو سایز از ترکیبات فعال زیستی به دلیل اندازه کوچک آن دارای مزیتهای بیشتری در مقایسه با سایر سیستمهای انکپسولاسیون می‌باشد. این سیستم ها به دلیل سایز کم جذب داخل سلولی بالاتری داشته و هدفمند عمل می‌کند. با توجه به ماهیت چرب اسانس‌های گیاهی، نانوذرات لیپید جامد (SLN) به دلیل دارا بودن زیست سازگاری، سمیت کم و تجزیه پذیری مناسب به همراه توانایی کپسوله کردن ترکیبات بیولوژیکی آبگریز می‌توانند به عنوان گزینه ای بسیار سودمند برای حمل اسانس‌های گیاهی مورد استفاده قرار گیرند (12). با توجه به اهمیت سرطان تخمدان و اثر سمیت برخـي از گونههاي درمنه بر سلول‌هاي سرطاني (11، 12). در این مطالعه ترکیبات شیمیایی اسانس با استفاده از دستگاه طیفسنجی جرمی (GC/MS) بررسی شد. سپس. طی فرمولاسیونهای مختلف با استفاده از سورفکتانتها و چربیهای مختلف اسانس در داخل نانوذرات لیپیدی جامد (AR-SLN) با استفاده از هموژنایزر بارگذاری و خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانو ذرات چون اندازه ذرهای، شاخص پراکندگی PDI و پتانسیل زتا با استفاده از دستگاه زتا سایزر مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین میزان بازدهی بارگذاری اسانس در نانو ذرات (EE%) با استفاده از دستگاه UV بررسی و میزان آزادسازی اسانس از نانو ذرات در بافر با استفاده از کیسه دیالیز بررسی و در نهایت فعالیت سایتوسیته اسانس بارگذاری شده در نانوذرات در مقایسه با اسانس خالص بر روی رده سلولی Hella در مقایسه با سلول‌های نرمال HEK-293 با استفاده از روش رنگسنجی مبتنی بر تتراسولیوم کمی (MTT) بررسی شد.
مواد و روشها
جمعآوری و شناسایی ترکیبات درمنه: برای این تحقیق، سر شاخههای هوایی درمنه وحشی با نام علمی Artemisia Aucheri Boiss از منطقه جغرافیایی کرمان جمع آوری سپس طی مرحله خشک کردن گیاه خشک شده آسیاب شد و اسانس توسط کلونجر جمعآوری شد.
روش تهیه نانو ذرات حاوی درمنه: برای ساخت نانوذرات از روش هموژنایزر فشار بالا مذاب استفاده شد. برای این مطالعه، دو نوع سورفکتانت لیپوفیلیک (جامد دهانه 60، دهانه مایع 80) و یک سورفکتانت هیدروفویل و پنج نوع جامد لیپید (اسید استئاریک، اسید پالمیتیک، کلسترول، بیسموت و گلیسریل مونو استئارات) انتخاب شدند. در این در مورد، فاز لیپیدی حاوی سورفکتانت چربی دوست اسانس و چربی در دمای 70 درجه سانتیگراد است. به فاز آبی حاوی سورفکتانت هم دما فاز لیپیدی تحت هموژنایزرهای شیر اضافه می‌شود. سپس انتشار اولیه با فشار 250 بار در سه چرخه متوالی توسط فشار بالا همگن می‌شود. هموژنایزر پس از همه، نمونه تا دمای محیط خنک می‌شود تا نانوذرات تشکیل شود. دارونما نیز طبق روش فوق تهیه شد.
بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانوذرات: تعیین اندازه ذرّهای، شاخص پراکندگی و پتانسیل زتا: اندازه گیری پارامترها در دمای اتاق با زاویه 90 درجه با استفاده از دستگاه زتاسایزر (مالورن انگلستان سری (ZS) انجام شد. برای بررسی پارامترهای مورد نظر، دستگاه بر اساس فاز آبی (3/1 = RI) کالیبره شده و سپس از فیلتر سر سرنگی با اندازه 22/0 میکرومتر عبور داده شدند و اندازه ذرهای، پتانسیل زتا و توزیع اندازه ذرهای در 3 تکرار مورد آنالیز قرار گرفت.
کشت سلولی و گروهبندی: رده سلولی سرطان تخمدان انسان (کد (ATCC: HTB-77 SKOV-3 و همچنین رده سلولی طبیعی HEK293)) طبق پروتکل ارائه شده توسط بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شد. کشت در مکمل محیطی PRMI با 10 درصد سرم جنین گاوی و همچنین پنی سیلین در انکوبه CO2 در 35 درجه سانتیگراد دو رده سلولی به مدت 24 ساعت با ویسکوزیته متفاوت نانوذرات مشاهده و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
رده سلولی SKOV-3: گروه اول (کنترل، SKOV-3 بدون درمان)، گروه دوم (SKOV-3 + 25 میکرولیتر نانو اسانس حاوی دارو) گروه سوم (سلول‌هایSKOV-3 + 50 میکرولیتر اسانس نانودارویی) گروه چهارم (سلول‌های SKOV-3 + 100 میکرولیتر اسانس نانودارویی).
رده سلولی HEK-293: گروه اول (کنترل، HEK-293 بدون درمان)، گروه دوم (HEK-293 + 25 میکروگرم/میلیلیتر نانو حاوی اسانس)، گروه سوم (HEK-293 + 50 میکروگرم/میلیلیتر نانو اسانس) و گروه چهارم (HEK-293 + 100 میکروگرم/میلیلیتر نانو حاوی اسانس).
تعیین مقادیر IC50 سنجش MTT: در این آزمون مبناي سنجش، قرار دادن سلول‌ها در معرض غلظتهاي مختلف اسانس و سنجش تعداد سلول‌هاي مرده بود. بدین منظور از ماده موثر زرد رنگ تترازولیوم و ایجاد کریستالهاي بنفش رنگ نامحلول فورمازان در روش MTT استفاده شد. در این روش، ۲۴ ساعت پس از کشت سلول‌ها با غلظت مورد نظر، محیط کشت رویی سلول‌ها تعویض شده و سلول‌ها به مدت ۳ ساعت به همراه محیط کشت حاوی رنگ تترازولیوم کشت داده شدند. در ادامه، محیط با استفاده از 100 میکرولیتر دي متیل سولفیدکسید ترکیب شده و میزان و شدت جذب وری با استفاده از الایزا ریدر با طول موج 570 نانومتر خوانده شد
تست فلوسیتومتری: براي اندازهگيري ميزان مهار رشد سلولي، از روش فلوسايتومتري استفاده شد. به اين صورت كه سلول‌ها پس از تيمارهاي مربوطه، تريپسينه شده، سپس آنها را در دور ١٢٠٠ سانتريفيوژ كرده و دوباره اين كار با ٥ ميليليتر بافر فسفات انجام شد. بعد از سانتريفيوژ مجدد، يك ميليليتر از بافر مخصوص كيت اضافه نموده و بعد از پيپتاژ شديد، ٥ ميكروليتر از انكسين وی اضافه نموده و ١٥ دقيقه در محيط تاريك انكوبه شد. در پایان هم ٤ ميكروليتر محلول پروپيديوم يديد اضافه كرده و با دستگاه فلوسايتومتري آناليز صورت گرفت.
تجزیه و تحلیل دادهها: از ﻧﺮماﻓﺮاز SPSS ورژن 26 و روش t-test اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ و ﻣﻌﻨﺎداري ﻧﺘﺎﯾﺞ در سطح 05/0 >p سنجیده شد. بعد از انجام واکنش Real Time PCR، دادههای دستگاه در فرمولهای مربوطه محاسبه شد و مقادیر 2-ΔΔCt با استفاده از نرمافزار SPSS و آزمون Tukey و One Way ANOVA مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج
با بررسی طیفهای حاصل از گاز کروماتوگرافی (GC/MS)، محاسبه اندیسهای بازداری و مقایسه طیفهای جرمی ترکیبها با ترکیبهای استاندارد، 56 ترکیب مختلف در اسانس درمنه شناسایی شد. بازدهي اسانس 5/1 سيسي برآورد شد. ترکیبهای عمده آن به ترتیب عبارتند از: cis-Thujone (67/27 درصد)، trans-Thujone (78/14درصد) Camphor (79/16) و trans-Verbenol (7 درصد) می‌باشد. تجزیه و تحلیل خصوصیات فیزیکی و شیمیایی SLN، توسط UV-VIS، حداکثر جذب اسانس 274 نانومتر است که منحنی کالیبراسیون اسانس در شکل 1، میانگین جذب و انحراف معیار در 254 نانومتر ترسیم شده است. اولین نشانه تولید نانوذرات لیپیدی تغییر رنگ ذرات سنتز شده است. تغییر رنگ پس از 24 ساعت انکوباسیون به دست آمد. مطالعه DLS نشان داد که اندازه متوسط نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس درمنه 8/112 نانومتر است که در شکل 2 نشان داده شده است. نمودار (شکل 2). ما همچنین پتانسیل زتا را برای ترکیب سنتز شده گزارش می‌کنیم (شکل 3). درتصویر میکروسکوپ الکترونی TEM تایید (شکل 4) این تصویر نشان می‌دهد که لیپید نانوذرات حاوی یک اسانس کروی مصنوعی هستند و به خوبی پراکنده می‌شوند. پس زمینه روشن اطراف نانوذرات کروی مربوط به حلال است. این تضاد به دلیل تفاوت در ویسکوزیته است نانوذرات سنتز شده و حلال مورد استفاده رهاسازی دارو با توجه به نمودار، مشاهده شد که فاز لیپیدی نانو استئارات و سورفکتانت گلیسرول در محدوده 80 آزادسازی بالاتری نسبت به فاز لیپیدی گلیسرول مونو استئارات و سورفکتانت اسپان 60 داشت. RA-SLN فرمولاسیون 47 درصد اسانس را در 2 ساعت اول و 54 درصد اسانس را در24 ساعت اول آزاد کرد. در حالی که در فرمولاسیون RA-SLN4 39 درصد در 2 ساعت اول و در 50 درصد در 24 ساعت آزاد شد. همچنین مشخص می‌شود که آزاد شدن اسانس کمتر از فرمولاسیون است. بنابراین، لیپید نانوحامل‌ها سرعت آزادسازی اسانس را نسبت به اسانس خالص افزایش دادند. جدول 1 خواص فیزیکوشیمیایی نانوذرات حاوی استخراج درمنه (درصد وزنی/وزن). فرمولاسیون سه بار تکرار شد و جدول با استاندارد گزارش شد. آزمایش MTT ویسکوزیته 0،1، 25، 50، 100 میلی مولار عصاره گیاه درمنه را نشان می‌دهد. بعد از 24 ساعت همانطور که با افزایش ویسکوزیته اسانس، قابلیت زنده ماندن SKOV-3 و EK-293 مشاهده می‌شود. رده های سلولی کاهش یافته و نتایج نشان داد که کمترین میزان زندهمانی در سلول‌های سرطانی SKOV-3 مشاهده شد. در 100 میلیمولار و در سلول‌های نرمال در 100 میلیمولار اسانس به دست آمد. بالاترین قابلیت زنده ماندن SKOV-3 و ردههای سلولی HEK-293 در ویسکوزیته اسانس 0 و 1 میلیمولار به دست آمد. با توجه به نتایج، 50 درصد مرگ سلولی برای SKOV-3، ردههای سلولی سرطانی، در ویسکوزیته سلولی 100 میلیمولار و برای HEK-293، IC50 در ویسکوزیته 100 میلیمولار گزارش شده است. در IC50 زیر ویسکوزیته اسانس درمنه و همچنین نانوذرات حاوی استخراج درمنه به طور معنیداری آپوپتوز را نسبت به شاهد افزایش داد (001/0 p <). همچنین نتایج نشان دهنده افزایش آپوپتوز در سلول‌های سرطانی SKOV-3 بود. به عبارت دیگر تیمار نانوذرات با عصاره گیاه درمنه به طور قابل توجهی آپوپتوز را افزایش داد (001/0 p <). نانوذرات حاوی اسانس درمنه باعث آپوپتوز بیشتر در SKOV-3 و سلول‌های رده HEK-293 نسبت به گروه اسانس درمنه می‌شوند. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که نانو ذرات درمنه یکی از داروهای ضد سرطان است و مکانیسم سیتوتوکسیک نانوذرات حاوی درمنه باعث افزایش آپوپتوز سرطان می‌شود. لازم به ذکر است که درصد سلول‌های آپوپتوز در سلول‌های لاین SKOV-3 و HEK-293نسبت به گروه کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت
تجزیه و تحلیل نتایج مولکولی: نتایج ارزیابی مولکولهای RNA استخراج شده توسط اسپکتروفتومتر، روی هم نشان داد که نسبت OD 260/280 تمام نمونههای استخراج شده حدود 92/1 تا 97/1 بود که نشان دهنده کیفیت خوب استخراج است. همچنین ارزیابی مولکول RNA استخراج شده با روش الکتروفورز ژل حدود 1 میکروگرم از نمونه با الکتروفورز افقی روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. باندهای 18 و 28 مرتبط با RNA ریبوزومی به عنوان شاخص کیفیت RNA استخراج شده در نظر گرفته شد که نتایج حاصل شده نشان داد که خالصسازی مولکول RNA برای ادامه این روش کیفیت خوبی دارد. همچنین سنتز DNA برای یک واکنش زنجیره ای پلیمراز، با استفاده از BAX و BCL2 و ژن اکتین FxR انجام شدوآغازگرها پس از پایان واکنش تکثیر، 5 میکرولیتر از نمونه مجدداً در ژل آگارز 2 درصد معلق شدند. ارزیابی کیفیت cDNA سنتز شده نتایج تجزیه و تحلیل سنتز cDNA نشان داد که کیفیت استخراج بالا است. همچنین کیفیت سنتز شده برای واکنش های Real-Time PCR مناسب است. برای انجام واکنش پلیمراز در دستگاه Real-Time PCR ابتدا ویسکوزیته فوروارد و آغازگرهای معکوس بهینه شدند. مقادیر آغازگرها پس از واکنش زنجیرهای پلیمراز برای کنترل ژن‌های -βاکتین، Bax وBCL2 مشخص شد. منحنی ذوب واحد نشاندهنده عدم وجود محصول غیراختصاصی است. پس از واکنش Real-Time، دادههای دستگاه در فرمولهای مربوطه محاسبه و مقادیر آن محاسبه شد. با استفاده از نرمافزار SPSS، آزمون آنالیز واریانس یکطرفه Turkey و آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. سطح بیان Bax و Bcl2، نشان داد که ژن‌ها در مقایسه با ژن مرجع داخلی GAPDH افزایش یافته است. بیان ژن BAX در مقایسه با -βاکتین داخلی حدود 2.6 افزایش یافته است (ژن کنترل)، اما بیان ژن BCL2 در مقایسه با کنترل داخلی حدود 7/1 افزایش داشت. بنابراین، می‌توان نتیجه گرفت که اسانس حاوی نانوذرات لیپیدی بیان BAX و BCL2 را افزایش می‌دهد. درواقع نانوذرات لیپیدی حاوی اسانس مسیر آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی تخمدان فعال کرده و متعاقبا باعث ایجاد رشد تومور متوقف شود.
جدول 1- خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانو ذرات حاوی اسانس درمنه (% وزنی/وزنی) هر فرمولاسیون سه بار تکرار
Table 1 Physicochemical properties of Nanoparticles containing Artemisia extraction (weight percent/ weight)
شکل 1- منحنی استاندارد اسانس درمنه در طول موج 274 نانومتر
Fig. 1. Standard curve of Artemisia extraction at 274 nm of wavelength
شکل2- نمونهای از طیف حاصل از تعیین اندازه ذرهای و شاخص پراکندگی در فرمولاسیون AR-SLN3
Fig. 2. An example of the spectrum obtained from particle size determination and dispersion index in the ARSLN3 formulation
شکل 3- نمونهای از پتانسیل زتا در فرمولاسیون SLN3-AR
Fig. 3. An example of zeta potential in the AR-SLN3 formulation
شکل 4- عکس TEM مربوط به SLN حاوی اسانس درمنه
Fig. 4. TEM image of SLN containing spherical Artemisia extraction
شکل 5- نمودار مقایسهای آزادسازی شاهد، فرمولاسیون RA-SLN4 و RA-SLN3 در محیط بافر 4/7 = pH
Fig. 5. Comparative graph of control release, RA-SLN4 and RA-SLN3 formulation in buffer environment PH=7.4
بحث
با توجه به اهمیت سرطان تخمدان و پتانسیل آنتیاکسیدانی درمنه، این مطالعه با هدف بررسی اثرات سلولی، مولکولی و ضدآپوپتوز اسانس بر روی نانوذرات لیپیدی در سلول‌های سرطانی تخمدان می‌باشد. ترکیبات اصلی نانوذرات لیپیدی شامل لیپید جامد، سورفکتانتها و آب بود. انتخاب مناسب چربیها، سورفکتانتها، ترکیبات و مقادیر آنها می‌تواند بر اندازه ذرات، پایداری ذخیرهسازی طولانی مدت، بارگیری دارو و آزاد سازی دارو مؤثر می‌باشد. این بدان معناست که هر دارو به فرمول خاصی برای SLN نیاز دارد (17، 16). مطالعه قبلی روی اسانس درمنه وجود آلفا پینن، بتا - پینن، D ژرماکرن و لیمونن، گزارش شد که از رشد سلول‌های سرطانی سینه، کبد و ملانوم انسان جلوگیری می‌کند. جوپاتولین همچنین یکی از القاء کنندههای آپوپتوز در سلول‌های HL-60 و سرطان معده است (18). SLNها از یک یا مخلوطی از لیپیدها ساخته شده اند که در دمای محیط و دمای بدن جامد هستند. نوع و مقدار لیپیدها بر اندازه ذرات نانوذرات تأثیر میگذارد. هر لیپید دارای چندین ترکیب شیمیایی است (19). مقدار ویسکوزیته لیپید مورد استفاده نانوذرات می‌تواند متفاوت از 2 تا 8 درصد مقدار لیپید مورد استفاده بستگی به تکنیک تولید نانوذرات دارد. مطالعات نشان دادهاند که افزایش ویسکوزیته لیپید با افزایش ورود دارو به داخل بدن همراه است. از طرف دیگر، افزایش محتوای لیپید باعث افزایش اندازه ذرات می‌شود (20). در این مطالعه، محتوای لیپید چهار بار استفاده شد و به دلیل مقدار کم اسانس استخراج شده گیاه تنها چهار فرمول با استفاده از دو نوع لیپید و دو نوع سورفکتانت تهیه شد. سپس تفاوت نوع لیپید و سورفکتانت به عنوان عامل موثر بر نانوذرات تهیه شده پارامترهایی مانند اندازه ذرات و توزیع مورد بررسی قرار گرفت. نتایج مطالعه آکروت و همکاران وی نشان داد که عصاره متانولی تهیه شده از قسمتهای مختلف درمنه وحشی دارای خواص سیتوتوکسیک بر سلول‌های می‌باشد (21). در یک مطالعه مشابه، گوردانیان و همکارانش گزارش کردند که سمیت در قسمتهای هوایی درمنه نسبت به سایر اندامها بالاتراست. علت آن را تجمع مواد آنتیاکسیدانی در سر شاخههای هوایی گزارش کردهاند، نوع و مقدار سورفکتانت مهمترین عامل موثر بر کیفیت نانو ذرات است .استفاده نامطلوب و کم از سورفکتانتها نه تنها باعث افزایش اندازه ذرات می‌شود گاهی موجب عدم ایجاد نانوذره می‌شود (22، 23). سورفکتانتهای مختلف توزیع متفاوتی بر روی سطح نانوذرات دارند. استفاده از چندین سورفکتانت برای دستیابی به اندازه و پایداری ذرات بهینه است (24). تحقیقات نشان داده است که استفاده از سورفکتانت با لیپوفیل HLB در کنار سورفکتانت با HLB هیدروفیل پتانسیل زتا را افزایش می‌دهد و در نتیجه پایداری را افزایش می‌دهد. به همین دلیل، در در این مطالعه ترکیب دو سورفکتانت Twin 80 با HLB Hydrophilic و Span 60 با 3/4 HLB استفاده شد. از سوی دیگر، مطالعات نشان داده است که با افزایش سورفکتانت با هیپوفیلیک HLB، اندازه ذرات افزایش می‌یابد، یکی از مزایای Real-Time PCR ترسیم منحنی ذوب است که پس از PCR تکمیل شد. نتایج حاصل از اثرات سلولی اسانس نانوذرات لیپیدی بر سلول‌های سرطانی تخمدان نشان داد که افزایش ویسکوزیته نانوذرات لیپیدی حاوی درمنه باعث کاهش بقا می‌شود. سلول‌های هلا نتایج ما با یافتههای اصغری و همکاران (1391) که در مطالعه آنها انجام شده، مطابقت دارد. در بررسی اثر عصاره متانولی درمنه نشان دادند که دارای خواص آنتیاکسیدانی است و خواص کشنده سلولی و پتانسیل استفاده در درمان سرطان را دارد. آنها همچنین نشان دادند که با افزایش ویسکوزیته عصاره درمنه باعث کاهش زنده ماندن سلول‌های سرطانی وابسته به دوز شد. (26) به طور مشابه، قره ماتروسیان و همکاران (2012) نشان دادند که عصاره متانولی درمنه توانایی مهار رشد سلولی به روشی وابسته به غلظت را دارا می‌باشد (26).
نتیجهگیری
به طور کلی، نتایج مطالعه نشان داد که نانوذرات لیپیدی حاوی عصاره گیاه آرتمیسیا، مسیر آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی تخمدان فعال کرده و در نتیجه باعث توقف رشد تومور شد.
منابع
1. Pooladi M, Abad SK, Hashemi M. Proteomics analysis of human brain glial cell proteome by2D gel. Indian J Cancer. 2014;51:159.
2. Teimouri M, Pooladi M. Anti-angiogenic and anti-proliferative effects of physalis alkekengi hydroalcholic extract on breast cancer in mice. J Fasa Univ of Med Sci. 2021;10:3684-3691.
3. Fleet JC, DeSmet M, Johnson R, Li Y. Vitamin D and cancer: a review of molecular mechanisms. Biochem J. 2012; 441:61-76.
4. Ebrahimi M, Teimouri M, Pooladi M. The synergistic anticancer traits of graphene oxide plus doxorubicin against BT474 and MCF7 breast cancer stem cells in vitro. Appl Biochem Biotechnol. 2021;2021:1-6.
5. Teimouri M, Odoumizadeh M. Cytotoxicity of Artemisia vulgaris essential oil encapsulated in SLN on breast cancer cell line (MCF7). Arch Adv Biosci. 2021;12:11-26.
6. Moore RG, Brown AK, Miller MC, Skates S, Allard WJ, Verch T et al. The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol. 2008; 108:402-408.
7. Bookman MA. First-line chemotherapy in epithelial ovarian cancer. Clin Obstet Gynecol. 2012;55:96-113.
8. Ehsanfar P, Teimouri M, Pooladi M. Investigating characterizations and antifungal effects of solid lipid nanoparticles (SLNs) loaded with essential oil of Citrus aurantifolia on isolated Malassezia strains. Arch Adv Biosci. 2020;11:43-55.
9. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. Cancer J Clin. 2019;69:7-34.
10. Wang CZ, Calway T, Yuan CS. Herbal medicines as adjuvants for cancer therapeutics. Am J Chin Med. 2012;40:657-669.
11. Salimifar M, Fatehi-Hassanabad Z, Fatehi M. A review on natural products for controlling type 2 diabetes with an emphasis on their mechanisms of actions. Curr Diabetes Rev. 2013;9:402-411.
12. Jafariparizi M, Afsharzadeh S, Akkafi HR, Abbasi S. Floristic study of Artemisia aucheri Boiss. rangelands in Isfahan Province, Iran. Nova Biologica Reperta 2017;4:236-245.
13. Bora KS, Sharma A. The genus Artemisia: a comprehensive review. Pharm Biol. 2011;49:101-109.
14. Lai F, Sinico C, De Logu A, Zaru M, Müller RH, Fadda AM. SLN as a topical delivery system for Artemisia arborescens essential oil: in vitro antiviral activity and skin permeation study. Int J Nanomed. 2007; 2:419.
15. Müller RH, Mäder K, Gohla S. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery–a review of the state of the art. Eur J Pharma Biopharm. 2000;50:161-177.
16. Mukherjee S, Ray S, Thakur RS. Solid lipid nanoparticles: a modern formulation approach in drug delivery system. Indian J Pharm Sci. 2009; 71:349.
17. Teoh DG, Secord AA. Antiangiogenic therapies in epithelial ovarian cancer. Cancer Control. 2011; 18:31-43.
18. Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing. Trends Biochem Sci. 2000; 25:502-508.
19. Bobrowski K. Free radicals in chemistry, biology and medicine: contribution of radiation chemistry. Nukleonika. 2005; 50:67-76.
20. Lingayat VJ, Zarekar NS, Shendge RS. Solid lipid nanoparticles: a review. Nanosci Nanotechnol Res. 2017;2:67-72.
21. Akrout A, Chemli R, Chreïf I, Hammami M. Analysis of the essential oil of Artemisia campestris L. Flavour Fragr J. 2000;16:337-339.
22. Gordanian B, Behbahani M, Carapetian J, Fazilati M. In vitro evaluation of cytotoxic activity of flower, leaf, stem and root extracts of five Artemisia species. Res Pharm Sci. 2014; 9:91.
23. Emami SA, Rabe SZ, Ahi A, Mahmoudi M, Tabasi N. Study the cytotoxic and pro-apoptotic activity of Artemisia annua extracts. Pharmacol Online. 2009; 3:1062-1069.
24. Mahmoudi M, Rabe SZ, Ahi A, Emami SA. Evaluation of the cytotoxic activity of different Artemisia khorassanica samples on cancer cell lines. Pharmacol Online. 2009; 2:778-786
25. Wong ML, Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 2005;39:75-85.
26. Asghari G, Jalali M, Sadoughi E. Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from the seeds of Artemisia aucheri Boiss. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 2012;7:11.
27. Gharehmatrossian S, Popov YU, Ghorbanli M, Safaeian S. Antioxidant activities and cytotoxic effects of whole plant and isolated culture of Artemisia aucheri Boiss. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:95-98.
