ارزیابی میزان جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس¬ از شیر گاوهای مبتلا به انواع ورم¬پستان در استان خوزستان و بررسی شیوع ژن mecA و مقاومت به متی¬سیلین در جدایه¬ها
الموضوعات :حمزه اسدی 1 , داریوش غریبی 2 , میثم مکی 3
1 - دانشجوی دکترای تخصصی باکتری‌شناسی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
2 - استاد، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
3 - استادیار، گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
الکلمات المفتاحية: ورم پستان گاو, استافیلوکوکوس او¬رئوس¬, مقاومت به متی¬سیلین, ژن mecA, خوزستان.,
ملخص المقالة :
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از علل های اصلی ورم پستان واگیردار در گاوهای شیری بوده و بروز مقاومت به متیسیلین در سویههای باکتری مذکور از نگرانیهای مهم و عمده در دامپزشکی و بهداشت عمومی میباشد. هدف از انجام مطالعه حاضر ارزیابی فراوانی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در شیر گاوهای مبتلا به ورم پستانهای بالینی و غیربالینی در استان خوزستان و بررسی میزان شیوع ژن mecA و مقاومت به متیسیلین در آنها بود. در تعداد 300 نمونه شیر گاوهای مشکوک به انواع ورم پستان در استان خوزستان، فقط 31 جدایه (33/10 درصد) بر اساس اصول میکروبشناسی تشخیصی و تائید نهائی با روش مولکولی واکنش زنجیرهای پلیمراز برمبنای حضور ژن اختصاصی ترمونوکلئاز (nuc) در ژنوم آنها، به عنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تأیید شد. در بررسی فنوتیپی با روش انتشار دیسک و ارزیابی مقاومت به متیسیلین در جدایهها با ردیابی مولکولی حضور ژن mecA هم مشخص گردید که تنها 2 جدایه (45/6 درصد) واجد ژن مذکور بودند، در حالیکه در روش فنوتیپی، جدایههای مذکور به عنوان استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین (Meticilline Resistance Staphylococcus aureus; MRSA) شناسایی نگردیدند. همچنین بررسی الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی جدایهها براساس روش انتشار دیسک و با استفاده از دیسک‌های آنتیبیوتیکی پنیسیلین، کلیندامایسین، داکسیسیلین، سفوکسیتین و تریمتوپریم-سولفامتوکسازول نشان داد که بیشترین مقاومت مربوط به آنتیبیوتیکهای تری متوپریم-سولفامتوکسازول و داکسیسیلین (45/6 درصد) و کمترین مقاومت هم نسبت آنتی‌بیوتیک پنیسیلین (صفر درصد) میباشد. نتایج این پژوهش نشان داد که در استان خوزستان ورم پستانهای ناشی از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بهعنوان یکی از عوامل مهم ورمپستانهای واگیردار، باید در سیستم مدیریت پرورشی گاوهای شیری مدنظر باشد.
آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی دوره 19، شماره 2، پیاپی 74، تابستان 1404، صفحات: 130-115
DOI: 10.71499/jvcp.2025.1187724"مقاله پژوهشی"
ارزیابی میزان جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس از شیر گاوهای مبتلا به انواع ورمپستان در استان خوزستان و بررسی شیوع ژن mecA و مقاومت به متیسیلین در جدایهها
حمزه اسدی1، داریوش غریبی2*، نغمه موری بختیاری3، میثم مکی4
1- دانشجوی دکترای تخصصی باکتری‌شناسی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
2- استاد، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
3- دانشیار، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
4- استادیار، گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
*نویسنده مسئول مکاتبات: dr.gharibi@gmail.com
(تاریخ دریافت: 27/8/1403 تاریخ پذیرش: 26/11/1403)
چکیده
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از علل های اصلی ورم پستان واگیردار در گاوهای شیری بوده و بروز مقاومت به متیسیلین در سویههای باکتری مذکور از نگرانیهای مهم و عمده در دامپزشکی و بهداشت عمومی میباشد. هدف از انجام مطالعه حاضر ارزیابی فراوانی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در شیر گاوهای مبتلا به ورم پستانهای بالینی و غیربالینی در استان خوزستان و بررسی میزان شیوع ژن mecA و مقاومت به متیسیلین در آنها بود. در تعداد 300 نمونه شیر گاوهای مشکوک به انواع ورم پستان در استان خوزستان، فقط 31 جدایه (33/10 درصد) بر اساس اصول میکروبشناسی تشخیصی و تائید نهائی با روش مولکولی واکنش زنجیرهای پلیمراز برمبنای حضور ژن اختصاصی ترمونوکلئاز (nuc) در ژنوم آنها، به عنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تأیید شد. در بررسی فنوتیپی با روش انتشار دیسک و ارزیابی مقاومت به متیسیلین در جدایهها با ردیابی مولکولی حضور ژن mecA هم مشخص گردید که تنها 2 جدایه (45/6 درصد) واجد ژن مذکور بودند، در حالیکه در روش فنوتیپی، جدایههای مذکور به عنوان استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین (Meticilline Resistance Staphylococcus aureus; MRSA) شناسایی نگردیدند. همچنین بررسی الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی جدایهها براساس روش انتشار دیسک و با استفاده از دیسک‌های آنتیبیوتیکی پنیسیلین، کلیندامایسین، داکسیسیلین، سفوکسیتین و تریمتوپریم-سولفامتوکسازول نشان داد که بیشترین مقاومت مربوط به آنتیبیوتیکهای تری متوپریم-سولفامتوکسازول و داکسیسیلین (45/6 درصد) و کمترین مقاومت هم نسبت آنتی‌بیوتیک پنیسیلین (صفر درصد) میباشد. نتایج این پژوهش نشان داد که در استان خوزستان ورم پستانهای ناشی از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بهعنوان یکی از عوامل مهم ورمپستانهای واگیردار، باید در سیستم مدیریت پرورشی گاوهای شیری مدنظر باشد.
کلیدواژهها: ورم پستان گاو، استافیلوکوکوس اورئوس، مقاومت به متیسیلین، ژن mecA، خوزستان.
مقدمه
استافیلوکوکوس اورئوس، با درگیرکردن حدود 70-5 درصد گاوها، غالب‌ترین پاتوژن گرم مثبت شناخته‌شده‌ای است که مسئول ایجاد ورم پستان بالینی، تحت بالینی و مزمن میباشد (Vasudevan et al., 2003; Zecconi et al., 2013; Dastmalchi Saei et al., 2020). البته میزان کشندگی باکتری فوق خیلی کم است و بیشتر منجر به ورم پستان مزمنی میشود که ممکن است چندین ماه طول بکشد. با این‌حال، آنزیم‌های تجزیه‌کننده و سمومی تولید میکند که به بافت پستان آسیب برگشت‌ناپذیر می‌رساند و در نهایت، تولید شیر کاهش مییابد (Vasudevan et al., 2003; Gilbert et al., 2013). البته بهداشت بافت پستان و بهداشت شیردوشی (ازآنجاکه اصلی‌ترین راه انتقال استافیلوکوکوس اورئوس، کارتیه آلوده است) و حفاظت گاوهای سالم از گاوهای آلوده، عفونت را تا حد زیادی کاهش می‌دهد (Rainard et al., 2018). بیماری ورم پستان در ایران اندمیک بوده و موارد بروز این بیماری نسبتاً بالا میباشد (Abera et al., 2010). درصورتی‌که بیماری فوق به‌موقع تشخیص داده نشود و ایجاد شرایط بهداشتی- درمانی مناسب و قرنطینه‌ای در مورد گاوهای مبتلا، به‌درستی انجام نشود، احتمال دارد که باکتریهای مولد ورم پستان به سایر دام‌ها سرایت کرده و کل گله را آلوده کند که این امر می‌تواند باعث خسارت‌های جبران‌ناپذیر اقتصادی از قبیل هزینه‌های درمان گاوهای مبتلا، کاهش چشمگیر تولید شیر بخصوص در موارد ورم پستان تحتبالینی و نهایتاً حذف دام‌های مبتلا شود (Yarabbi et al., 2014). گذشته از ضررهای اقتصادی، بحث سلامت عمومی و خطری که در انتقال بقایای آنتیبیوتیکی به انسان و ایجاد سویههای مقاوم و نیز تاثیرآن بر پروتکل‌های درمانی در استفاده از اثربخشی آنتیباکتریالهای فعلی وجود دارد هم مطرح است (Cikman et al., 2019). لذا علیرغم اینکه استافیلوکوکوس اورئوس غالبا بهعنوان یکی از عوامل ورمپستان در حیوانات شیری گزارش شدهاست (Aires-de-Sousa et al., 2007)، اما چون باعث ایجاد انواع عفونت‌های بالینی اکتسابی بیمارستانی در پوست، بافت نرم و مسمومیت در انسان نیز میشود (Tong et al., 20015; Srednik et al, 2019)، بنابراین باکتری مذکور بهعنوان یکی از باکتریهای بیماریزای خطرناک مشترک که هم حیوانات و هم انسان را تهدید میکند، در نظر گرفته میشود (Thammavongsa et al., 2015; Carfora et al., 2016; Li et al., 2017).
توانایی استافیلوکوکوس اورئوس در به‌اشتباه انداختن سیستم ایمنی میزبان، آن را به یکی از مقاوم‌ترین باکتریهای بیماری‌زا در تاریخ درمان آنتیبیوتیکی تبدیل کردهاست (Hiramatsu et al., 2014) و در حال حاضر گسترش سویههای مقاوم به متیسیلین این باکتری (Meticilline Resistance Staphylococcus aureus; MRSA)، به عنوان یک نگرانی مهم برای سلامت حیوانات و انسان در سراسر جهان مطرح میباشد (García-Alvarez et al., 2011; Ba et al., 2014; van Rijen et al., 2014). توانائی مقاومت نسبت به متیسیلین در برخی سویههای استافیلوکوکوس اورئوس عمدتاً توسط بیان ژن mecA که روی یک عنصر ژنتیکی متحرک به نام SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) قرار دارد ایجاد میشود. بیان ژن مذکور منجر به تولید یک پروتئین تغییریافته پیوندشونده به پنیسیلین بنام PBP2a (Penicillin Binding Protein 2a) در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس میشود که نسبت به آنتیبیوتیکهای بتالاکتام حساسیت بسیار کمی دارد و لذا این باکتری در برابر آنتیبیوتیکهای بتالاکتام مقاوم میشود (Hiramatsuet et al., 2001; Abed et al, 2021; Kamroodi et al, 2022).
باتوجه به اینکه مطالعات ژنتیکی در مورد جدایههای حاصله از ورم پستان بالینی و تحت بالینی دراثر درگیری با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در ایران و به‌خصوص استان خوزستان انجام شده با این حال توصیه میشود مطالعات جامع تری در این خصوص صورت گیرد. از طرف دیگر باید توجه داشت که تاکنون واکسن مؤثری بر ضد بیماری ورمپستان در کشور ایران در دسترس نیست (Kerro and vidlund., 2024) و لذا بهترین راه مقابله با آن، پیشگیری و در صورت بروز ورمپستان، استفاده از آنتیبیوتیکهای مختلف میباشد.
با توجه به اهمیت مطالب ارائهشده، مطالعه حاضر به‌منظور بررسی حضور استافیلوکوکوس اورئوس در نمونههای شیر جمع‌آوری‌شده از گاوهای مبتلا به ورم پستان بالینی و تحتبالینی استان خوزستان و همچنین تعیین فراوانی حضور ژن mecA و ارزیابی الگوی حساسیت و یا مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس انجام گردید.
مواد و روشها
در طی پژوهش حاضر، نمونه‌گیری از فارمهای گاو شیری صنعتی شهرستان‌های بهبهان، قلعه تل، اهواز، باغ‌ملک و موارد ارجاعی به بیمارستان دانشکده دامپزشکی اهواز از اردیبهشت 1401 تا اردیبهشت 1402 به‌صورت مقطعی از گاوهای مبتلا به ورم پستان بالینی و تحت بالینی و تا حصول حداقل 100 نمونه مثبت ورم پستان انجام گرفت. بدین منظور نمونه شیر از گاوهایی که واجد تغییرات غیرطبیعی در شیر مانند تغییر رنگ، وجود لخته و نیز تورم، گرمی، درد و قرمزی حداقل در یکی از چهار کارتیه پستان بودند، به عنوان گاوهای مبتلا به ورم پستان بالینی و نیز گاوهایی که فاقد علایم بالینی بوده ولی با استفاده از آزمون ورمپستان کالیفرنیا (California Mastitis Test) نمونهء شیر آنها مثبت شده بود، به عنوان گاوهای مبتلا به ورم پستان تحت بالینی، اخذ شد. جهت نمونه‌برداری، ابتدا بافت پستان هر دام با آب شسته شده و سپس با حوله تمیز با دقت خشک شد، سپس سرپستانک (Teat) کارتیهها با سواپ آغشته به الکل اتیلیک 70 درصد (غدیر، ایران) بهطور کامل ضدعفونی گردید. در ادامه دوشش اولیه شیر هر کارتیه دور ریخته شد و سپس 20-15 میلی‌لیتر شیر اخذ شده و در یک لوله فالکون (Falcon Tube)استریل جمع‌آوری گردید. نمونههای شیر در کنار یخ نگهداری شده و بلافاصله تحت شرایط آسپتیک به آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز انتقال داده شد (Abed et al, 2021). نمونههای شیر بلافاصله در دستگاه سانتریفیوژ (اپندورف، آلمان) با سرعت 3000 دور دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردیده و سپس مایع رویی حاصله دور ریخته شد. در ادامه یک لوپ پر از رسوب شیر بر روی پلیتهای حاوی محیطهای بلاد آگار (های مدیا، هند) با 10 درصد خون دفیبرینه گوسفند، مانیتول سالت آگار (های مدیا، هند) و برد پارکر آگار (لیوفیلیچم، ایتالیا)، جداگانه کشت داده شده و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانهگذاری شدند. تشخیص اولیه جدایههای مربوط به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بر اساس ارزیابی خصوصیات فنوتیپی از قبیل رنگ‌آمیزی گرم، شکل باکتری، مورفولوژی کلنی‌ها، آزمونهای اکسیداز و کاتالاز و نیز خصوصیات بیولوژیکی و بیوشیمیایی انجام گرفت (Markey et al, 2013; Abed et al, 2021). جدایهها پس از تشخیص اولیه مطابق پروتکل ذکر شده، در داخل میکروتیوبهای حاوی محیط اسکیم میلک (لیوفیلیچم، ایتالیا) و در دمای 70- سلسیوس فریزر (GFL، آلمان) نگهداری شدند.
-ارزیابی ژنوتیپی جدایههای تحقیق: در ادامه و به‌منظور تشخيص قطعي هویت جدایهها، ابتدا آزمایش PCR بر اساس تکثیر ژن ترمونوکلئاز (nuc) و به کمک جفت پرایمرهای اختصاصی آن انجام گردید (Sasaki et al, 2010; El-Tawab et al, 2016). همچنین در ادامه جهت ردیابی ژن mecA در جدایهها، آزمایش PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی مربوطه و مطابق با روش توصیف شده توسط شوئنک و همکاران انجام شد (Schuenck et al., 2006). مشخصات کامل پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژنهای nuc و mecA، در جدول 1 ارائه شدهاست.
لازم به ذکر است که در این مرحله، ابتدا DNA تمام جدایههای مشکوک به استافیلوکوکوس اورئوس بودن بر مبنای یافتههای فنوتیپی، با استفاده از روش جوشاندن، استخراج گردید (Öztürk et al., 2019; Amini Kamroodi et al., 2022) و سپس مراحل اصلی واکنشهایPCR مورد نظر، مطابق اطلاعات ارائه شده در جدول 2، انجام گردید. همچنین به منظور کنترل کیفیت، همه مراحل استخراج DNA در مورد سوش استاندارد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC-33591) بهعنوان کنترل مثبت هم انجام گردید.
جدول 1- مشخصات توالی پرایمرهای مورد استفاده در تحقیق حاضر
ژن هدف توالی پرایمرها (5′→3′) اندازه محصول (bp) |
Sasaki et al., 2010 280 F: TCGCTTGCTATGATTGTGG nuc |
Schuenck et al., 2006 307 F: TAGAAATGACTGAACGTCCG mecA |
برای انجام واکنشهای PCR مورد نظر(جدول 2)، در هر میکروتیوب، مقدار 1 میکرولیتر از هرکدام از پرایمرهای اختصاصی پیشرو و معکوس (شرکت پیشگام، ایران) مربوط به ژنهای هدف (جدول 1)، 5/12 میکرولیتر از مستر میکس آماده (شرکت امپلیکون، دانمارک) و 4 میکرولیتر از DNA استخراجی هرجدایه اضافه شد و سپس با آب مقطر استریل به حجم 25 میکرولیتر رسانده شد. در ادامه میکروتیوبها در دستگاه ترموسایکلر (اپندورف، آلمان) قرار داده شدند.
| |||||
ژن | سیکلها | دما (ºC) | زمان | تعداد سیکلها | |
nuc | سیکل اول | واسرشتهسازی اولیه | 94 | 5 دقیقه | 1 |
سیکل دوم | واسرشتهسازی | 94 | 30 ثانیه | 30 | |
اتصال | 55 | 30 ثانیه | |||
تکثیر | 72 | 30 ثانیه | |||
سیکل سوم | تکثیر نهایی | 72 | 10 دقیقه | 1 | |
mecA | سیکل اول | واسرشتهسازی اولیه | 95 | 10 دقیقه | 1 |
سیکل دوم | واسرشتهسازی | 94 | 30 ثانیه | 30 | |
اتصال | 56 | 30 ثانیه | |||
تکثیر | 72 | 30 ثانیه | |||
سیکل سوم | تکثیر نهایی | 72 | 5 دقیقه | 1 | |
پس از اتمام واکنشهای PCR، جهت مشاهده باندهای تولید شده در اثر تکثیر هر یک از ژنهای مورد نظر تحقیق، با استفاده از مقدار 8 میکرولیتر از هر یک از محصولات حاصله و ژل آگاروز (سیناکلون، ایران)، به همراه 2 میکرولیتر رنگ ایمن (Safe Stain) (سیناکلون، ایران) عمل الکتروفورز (پایاپژوهش، ایران) انجام شد و در نهایت هم از باندهای حاصله با استفاده از اشعه UV دستگاه ایلومیناتور (یوویتک، انگلستان)، عکس‌برداری گردید.
- ارزیابی فنوتیپی مقاومت به متیسیلین و تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای تحقیق: در پژوهش حاضر با استفاده از روش انتشار دیسک در آگار، تعیین فنوتیپی مقاومت به متیسیلین و سنجش حساسیت آنتیبیوتیکی جدایهها هم انجام گرفت. بدین منظور از کشت 24-18 ساعته هر یک از جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس که در بخش ژنوتیپی تحقیق و بر اساس ارزیابی تکثیر ژن nuc تأییدشده بودند ، سوسپانسیونی مطابق با کدورت 5/0 استاندارد مک فارلند (McFarland) تهیه کرده و با استفاده از سواپ استریل در سطح محیط مولر هینتون آگار(مرک، آلمان)، به‌صورت پخش کردن یکنواخت، کشت داده شد. سپس دیسک‌های استاندارد (پادتن طب، ایران) آنتیبیوتیکهای پنیسیلین (U/disk 10)، داکسی سیلین (µg/disk 30)، سفوکسیتین (µg/disk 30)، تری متوپریم سولفامتوکسازول (µg/disk 25) و کلیندامایسین (µg/disk 2) بر روی محیط مذکور با رعایت فاصله استاندارد قرار دادهشد. در ادامه همه محیطهای کشت مذکور، به مدت 24-18 ساعت در دمای 35 درجه سلسیوس، گرمخانهگذاری شدند. سپس، قطر منطقه عدم رشد ایجاد شده در اطراف هر یک از دیسک‌ها را با خط کش مدرج دقیق اندازه‌گیری کرده و نتایج قرائت شده با استفاده از جدول استاندارد به‌صورت حساس، نیمه حساس و مقاوم گزارش گردید. لازم به ذکر است که سنجش مقاومت فنوتیپی نسبت به متیسیلین هم مطابق روش فوق و با استفاده از دیسک سفوکسیتین (µg/disk30)، انجام شد (CLSI, 2021).
یافته‌ها
در قسمت فنوتیپی تحقیق حاضر، تعداد 46 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس (33/15 درصد) از 300 نمونه شیر اخذ شده، شناسایی شد. از طرف دیگر از تعداد 46 جدایهء واجد خصوصیات اولیه استافیلوکوکوس اورئوس در مرحله تشخیص فنوتیپی پژوهش، تعداد 31 جدایه در واکنش زنجیرهای پلیمراز، براساس ردیابی ژن nuc، بهعنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد تأیید قرار گرفت (شکل 1).
شکل1- نتیجه الکتروفورز ژل آگاروز مربوط به محصولات PCR انجامشده برای تکثیر ژن nuc: چاهک M) سایز مارکر 100جفت بازی (سینا کلون، ایران)، چاهک 7) نمونه کنترل مثبت حاوی باندی به اندازه 280 جفت باز، چاهک 5) کنترل منفی، چاهک‌های 1، 2 و 4) جدایههای واجد ژن nuc، چاهک 3) جدایه منفی فاقد ژن (جدایهای که واجد ژن nuc نبوده و به عنوان استافیلوکوکوس آرئوس تایید نشد).
همچنین نتایج تحقیق حاضر نشان داد که از مجموع 31 جدایهء تایید شده به عنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، فقط 2 جدایه (45/6 درصد) واجد ژن mecA بودند (شکل 2).
شکل 2- نتیجه الکتروفورز ژل آگاروز مربوط به محصول PCR انجامشده برای تکثیر ژنmecA : چاهک M) سایز مارکر 100جفت بازی (سیناکلون، ایران)، چاهک 1) نمونه کنترل مثبت حاوی باندی به اندازه 307 جفت باز، چاهک 2) کنترل منفی، چاهک‌های 3 و 4) جدایههای واجد ژن mecA.
از 31 جدایهء تاییدشده به عنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس هم، همگی (100 درصد) نسبت به آنتی‌بیوتیک پنیسیلین حساس بودند. همچنین 1جدایه (22/3 درصد) نسبت به آنتیبیوتیکهای کلیندامایسین و 2 جدایه (45/6 درصد) نسبت به تری متوپریم- سولفامتوکسازول و داکسی سیلین مقاوم بودند. ضمناً جدایه 2 (45/6 درصد) هم نسبت به داکسی سیلین و 1 جدایه (22/3 درصد) نیز نسبت به کلیندامایسین حساسیت نسبی داشتند (نمودار 1).
همچنین هیچ‌یک از جدايهها در برابر سفوکستین مقاوم نبوده و حساسیت نشان دادند. لازم به ذکر است که در تحقیق حاضر مطابق توضیح در قسمت مواد و روشها، برای سنجش مقاومت فنوتیپی نسبت به متیسیلین از دیسک استاندارد آنتی‌بیوتیک سفوکسیتین استفاده کردیم (نمودار 1).
نمودار 1- نتایج بررسی الگوی حساسیت و مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای مورد مطالعه
بحث و نتیجه‌گیری
در طی پژوهش حاضر، که به‌صورت مقطعی از گاوهای مشکوک به ورم پستان بالینی و تحتبالینی فارمهای صنعتی گاو شیری شهرستان‌های بهبهان، قلعه تل، اهواز، باغ ملک و موارد ارجاعی به بیمارستان دانشکده دامپزشکی اهواز انجام گرفت، از تعداد 300 نمونه شیر، تعداد 46 جدایه (33/15 درصد)، استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از کشت در محیطهای اختصاصی ذکرشده در مطالعه حاضر و بر اساس ارزیابی خصوصیات فنوتیپی و بیوشیمیایی تشخیص اولیه داده شد، که از 46 جدایه واجد خصوصیات اولیه استافیلوکوکوس اورئوس 31 جدایه (33/10 درصد) در واکنش زنجیرهای پلیمراز، براساس ردیابی ژن nuc، بهعنوان باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد تأیید قرار گرفت (شکل 1). از طرف دیگر در مطالعه حاضر از تعداد 31 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس تایید نهائیشده، فقط در 2 جدایه (45/6 درصد) با روش PCR، حضور ژن mecA (ژن مقاومت به متیسیلین) مشاهدهگردید (شکل 2)، این در حالی است که در آزمون فنوتیپی، 2 جدایه مذکور، حساس به سفوکسیتین بودند (نمودار1). عدم همخوانی نتایج آزمونهای فنوتیپی و ژنوتیپی در تحقیق حاضر، با نتایج حاصله از مطالعه خویی و همکاران در سال 2014 (Khoei et al., 2014) و یافتههای امینی کمرودی و همکاران در سال 1401 (Amini Kamroodi et al., 2022) مشابهت دارد. در این ارتباط به نظر میرسد که عدم تطابق مذکور می‌تواند به علت وجود سویههای هتروژنوس و یا نگهداری و فریزکردن طولانی مدت جدایهها باشد که باعث شده باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، توان بیان ژن mecA را در شرایط آزمایشگاهی از دست بدهد (Amini Kamroodi et al., 2022)، که این امر می‌تواند بهعنوان یک مسئله در شناسایی دقیق سویههای MRSA و یک چالش مطرح باشد (Amini Kamroodi et al., 2022).
در مطالعهای که توسط هوایی و همکاران در سال 2014 در اصفهان انجام شده، از تعداد 450 نمونه شیر جمع‌آوری‌شده نیز، 54 جدایه (12 درصد) از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس شناسائی شدهاست (Havaei et al., 2014). همچنین در همخوانی نسبی با یافتههای تحقیق حاضر، در مطالعه ابراهیمی و اخوان طاهری در سال 2009 در شهرکرد هم 8 باکتری (8/16 درصد) بهعنوان استافیلوکوکوس اورئوس از تعداد 98 نمونه شیر جدا شدهاست (Ebrahimi and Akhavan Taheri, 2009). منطبق با نتایج پژوهش حاضر در مطالعه ناظر و سرمدی در شیراز نیز در تعداد 1352 نمونه شیر مربوط به موارد ورم پستان، 118 جدایه (73/8 درصد) استافیلوکوکوس اورئوس شناسائی شدهاست (Nazer and Sarmadi, 2005). همچنین بوساتو و همکاران مطالعهای را در سال 2000 بر روی 1907 گاو شیری مبتلا به ورم پستان در کشور سوئیس انجام داده و میزان جداسازی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از نمونههای فوق را نزدیک به نتایج تحقیق حاضر، 7/11درصد گزارش کردهاند (Busato et al., 2000). البته از طرفی هم نتایج فراوانی جداسازی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در پژوهش حاضر با برخی از نتایج مطالعات مشابه انجامشده در ایران و خارج مطابقت نداشت. به‌عنوان‌مثال درمطالعهای که توسط عابد و همکاران در سال 2021 انجام شده، فراوانی شیوع باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان عامل ورم پستان، 9/44 درصد گزارش شدهاست (Abed et al., 2021). همچنین در مطالعهء قربانپور و همکاران در اهواز، از تعداد 100 نمونه شیر مربوط به ورم پستان گاوی، 25 جدایه (25 درصد) به روش مولکولی، به عنوان استافیلوکوکوس اورئوس، تأیید شدهاست (Ghorbanpour et al., 2007). در مطالعهء آبرا و همکاران در سال 2010 در اتیوپی هم از تعداد 30 نمونه شیر مربوط به ورم پستان بالینی، 10 جدایه (3/33 درصد) و از تعداد 110 نمونه شیر مربوط به ورم پستان تحت بالینی، 49 جدایه (5/44 درصد) بهعنوان استافیلوکوکوس اورئوس، شناسائی شدهاست (Abera et al., 2010). از طرف دیگر در مطالعهء فوئکتز و همکاران، 117 نمونهء شیر مرتبط با عفونت تحتبالینی ورم پستان در استرالیا بررسی شده و فقط تعداد 7 جدایه (99/5 درصد) به عنوان استافیلوکوکوس اورئوس شناسائی شدهاست (Phuektes et al., 2001). همچنین طبق گزارش اطیابی و همکاران در سال 2005، شیوع استافیلوکوکوس اورئوس در موارد ورم پستان گاوی در ایران پایینتر بودهاست، بهطوری که از تعداد 2904 نمونه شیر جمع‌آوری‌شده، تنها 84 جدایهء استافیلوکوکوس اورئوس (89/2 درصد) شناسائی شدهاست (Atyabi et al., 2005). بهنظر میرسد که عدم تشابه نتایج پژوهش‌های ذکر شده، با یافتههای تحقیق حاضر، ممکن است ناشی از تفاوت‌های مدیریتی، سطح رعایت بهداشت و سیستم‌های شیردوشی باشد (Amini Kamroodi et al., 2022). اما همانطور که قبلا اشاره شد، از 31 جدایه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تائیدشدهء فنوتیپی و ژنوتیپی، در 2 جدایه (45/6 درصد) با روش PCR حضور ژن mecA به تأیید رسید. در همخوانی با یافته مذکور، یافتههای امینی کمرودی و همکاران در سال 2022 (Amini Kamroodi et al., 2022)، سنگری فر و همکاران در سال 2016 (Sangarifar et al., 2016) و سردنیک و همکاران در سال 2019 (Srednik et al., 2019) مطابقت دارد، همچنین یافته مذکور با نتایج بعضی از مطالعات انجامشده در ایران و خارج ایران مطابقت ندارد. بهعنوان مثال در مطالعه هوایی و همکاران در سال 2014 که در شهر اهواز انجام شده، از تعداد 54 استافیلوکوکوساورئوس جداشده از شیر گاوهای مبتلا به ورم پستان، با روش انتشار دیسک در آگار، تعداد 10 (52/18 درصد) ایزوله مقاوم به متیسیلین شناسایی شد (Havaei et al., 2014). همچنین در مطالعهای که توسط عابد و همکاران در سال 2021 انجام شده، فراوانی ژن mecA در جدایههای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس 60 درصد گزارش شدهاست (Abed et al., 2021). در مطالعه تورکیلماز و همکاران نیز در ترکیه در سال 2010، از تعداد 93 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس عامل ورم پستان گاوی، 16جدایه (2/17درصد) به عنوان سویه‌ء MRSA شناسایی شدهاست (Turkyilmaz et al., 2010). همچنین در مطالعهای دیگر که توسط شریواستاوا و همکاران در سال 2017 انجام شده، از تعداد 85 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس به‌دست‌آمده از ورم پستان گاوی، در 14 جدایه(47/16 درصد)، ژن mecA شناسایی گردیده‌است (Shrivastava et al., 2017). به نظر میرسد که علت عدم همخوانیهای مشاهده شده، می‌تواند به دلیل تفاوت در میزان جامعه‌ء آماری و منطقه‌ء نمونه‌گیری و استفاده از روش‌های مدیریتی مناسب در گاوداری‌های مناطق مورد مطالعه حاضر باشد (Amini Kamroodi et al., 2022).
البته با وجود اینکه در مطالعه حاضر هیچ‌یک از جدایه ها در آزمایش فنوتیپی مقاوم به متیسیلین گزارش نگردید (نمودار1) ، در ارزیابی الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی جدایهها، مشخص شد که از تعداد 31 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس، همه آنها (100 درصد) نسبت به آنتی‌بیوتیک پنیسیلین حساس بودند (نمودار1) . در مطالعات انجامشده توسط یوسیف و همکاران در سال 2019 در شهر مشهد روی 111 نمونه 56 درصد (Youssif et al., 2019)، توسط آکو وهمکاران در سال 2016 در شهر تهران روی 45 نمونه 87 درصد (Akkou et al., 2016)، توسط پور تقی و همکاران در سال 2016 در شهر تهران روی 444 نمونه 100درصد (Pourtaghi et al., 2016)، توسط صاحب خطیری و همکاران در سال 2016 در شهر البرز روی 444 نمونه 50 درصد (Sahebekhtiari et al., 2016) نمونههای استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از ورم پستان تحت بالینی مقاوم به پنیسیلین گزارش گردید که میزان مقاومت گزارششده در پژوهش حاضر کمتر از میزان گزارششده در این پژوهش‌ها است. این امر ممکن است به علت استفاده وسیع از پماد داخل پستانی در گاوداریها، استفاده از دوز های پایینتر از مقدار لازم و یا عدم کامل کردن دوره‌ی درمان باشد (Amini Kamroodi et al., 2022). اما در مطالعه حاضر مشخص گردید که میزان مقاومت نسبت به تری متوپریم- سولفامتوکسازول (45/6 درصد)، کمتر از مقدار گزارششده در پژوهش امینی کمرودی و همکاران (23 درصد)، میباشد (Amini Kamroodi et al., 2022). همچنین در مطالعه یوسفی و همکاران 50 درصد جدایهها استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به کلیندامایسین و 75 درصد جدایهها استافیلوکوکوس اورئوس، نسبت به داکسی سیلین مقاوم بودند (Youssif et al., 2021). همچنین در تحقیق هوایی و همکاران از 54 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس، 29/46 درصد آنها نسبت به کلیندامایسین مقاوم بودند (Havaei et al., 2014). در مطالعه صالحی و همکاران در آذربایجان شرقی نیز که بر روی 39 جدایهء باکتری استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از شیر گاوهای مبتلابه ورم پستان انجام شده، فراوانی مقاومـت آنتیبیوتیکی نسـبت بـه آنتیبیوتیکهای پنیسیلین 91 درصد، کليندامايســين 87 درصــد و سفوکســيتين 51 درصــد گزارش شدهاست (Salehi et al., 2021). همچنین در مطالعه شکوهی و همکاران که در شهر ماکو انجام شده، میزان مقاومت آنتیبیوتیکی جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به پنیسیلین 33/88 درصد و نسبت به کوتریموکسازول 35 درصد بودهاست (Shokohi et al., 2018). این در حالی است که در پژوهش حاضر (22/3 درصد) جدایهها نسبت به کلیندامایسین و (45/6 درصد) جدایهها هم نسبت به داکسیسیلین مقاومت داشتند (نمودار1). به نظر میرسد که بالا بودن مقاومت آنتیبیوتیکی در پژوهش‌های مذکور، می‌تواند به علت استفاده بیش از حد و طولانی مدت از آنتیبیوتیکهای مورد آزمایش، عدم انجام آزمایش سنجش حساسیت آنتیبیوتیکی و حضور طولانی مدت دام آلودههای در گله باشد (Amini Kamroodi et al., 2022).
با توجه به اینکه در طی مطالعهء حاضر مشاهده شد که استافیلوکوکوس اورئوسهای جداشده از دام‌های مبتلا به ورم پستان، نسبت به آنتیبیوتیکهای غیر بتا لاکتام مقاومت نشان دادهاند (نمودار 1) (اگرچه درصد مقاومت گزارششده بالا نبود)، این امر اهمیت استفاده‌ء محتاطانه از آنتی‌بیوتیک‌ها را در گاوداریها را مشخص می‌نماید. اگرچه تحقیق بر روی جدایههای MRSA حاوی ژن mecA در استان خوزستان بسیار کم انجام شده، اما مشخص شد که خوشبختانه این سویهها در منطقه خوزستان، شیوع بالایی ندارد. هرچند که لازم است پژوهش‌های بیشتری در این مورد انجام شود و البته حضور همین میزان کم از باکتریهای مذکور، زنگ خطری در خصوص اشاعه بیشتر سویههای مذکور در جمعیت دامی و متعاقب آن انتقال به جمعیت انسانی میباشد، لذا به نظر میرسد که کنترل و پایش مقامتهای آنتیبیوتیکی و استفاده از نتایج این‌چنین مطالعاتی به ما کمک میکند تا با روش‌های مناسب‌تری از انتشار سویههای مقاوم پیشگیری شود.
سپاسگزاری
پژوهش حاضر با کمک معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به انجام رسیده و منابع مالی آن در قالب بودجه پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز تأمین‌شده است. بدینوسیله نگارندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز تشکر می‌نمایند.
تعارض منافع
نويسندگان مقاله اعلام می‌دارند که هیچ‌گونه تعارض منافعی ندارند.
منابع
· Abed, A.H., Menshawy, A.M., Zeinhom, M.M., Hossain, D., Khalifa, E., Wareth, G., et al. (2021). Subclinical mastitis in selected bovine dairy herds in North Upper Egypt: Assessment of prevalence, causative bacterial pathogens, antimicrobial resistance and virulence-associated genes. Microorganisms, 9(6): 11-75.
· Abera, M., Demie, B., Aragaw, K., Regassa, F. and Regassa, A. (2010). Isolation and identification of Staphylococcus aureus from bovine mastitic milk and their drug resistance patterns in Adama town, Ethiopia. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health, 2(3): 29-34.
· Aires-de-Sousa, M., Correia, B. and de Lencastre, H. (2008). Changing patterns in frequency of recovery of five methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Portuguese hospitals: surveillance over a 16-year period. Journal of Clinical Microbiology, 46(9): 2912-2917.
· Aklilu, E. and Chia, H.Y. (2020). First mec C and mec A positive livestock-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus (mecC MRSA/LA-MRSA) from dairy cattle in Malaysia. Microorganisms, 8(2): 1-47.
· Amini Kamroodi, M., HashemiTabar, G., Askari Badouei, M., Khoramian, B. and Kalateh Rahmani, H. (2022). Investigation of the presence of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) carrying different mec types in isolates causing bovine sub-clinical mastitis. New Findings in Veterinary Microbiology, 5(1): 1-12. [In Persian]
· Ba, X., Harrison, E.M., Edwards, G.F., Holden, M.T., Larsen, A.R., Petersen, A., et al. (2014). Novel mutations in penicillin-binding protein genes in clinical Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistant on susceptibility testing but lack the mec gene. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 6(9): 594-597.
· Busato, A., Trachsel, P., Schällibaum, M. and Blum, J.W. (2000). Udder health and risk factors for subclinical mastitis in organic dairy farms in Switzerland. Preventive Veterinary Medicine, 44(3-4): 205-220.
· Carfora, V., Giacinti, G., Sagrafoli, D., Marri, N., Giangolini, G., Alba, P., et al. (2016). Methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in dairy sheep and in-contact humans: An intra-farm study. Journal of Dairy Science, 9(9): 4251-4258.
· Chandran, A., AA, M. H., Varghese, S. and Sheeja, K. M. (2008). Prevalence of multiple drug resistant Escherichia coli serotypes in a tropical estuary, India. Microbes and Environments, 23(2): 153-158.
· Cikman, A., Aydin, M., Gulhan, B., Karakecili, F., Kurtoglu, M.G., Yuksekkaya, S., et al. (2019). Absence of the mecC gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from various clinical samples: The first multi-centered study in Turkey. Journal of Infection and Public Health, 12(4): 528-533.
· CLSI, C.L.S.I. (2021). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Approved Twenty-: Document M100-S28. Wayne, PA, USA: CLSI, 2021.
· Cockcroft, P.D. and Holmes, M.A. (2004). Evidence‐based veterinary medicine 1. Why is it important and what skills are needed? In Practice, 26(1): 28-33.
· Dastmalchi Saei, H. and Panahi, M. (2020). Genotyping and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolates from dairy ruminants: Differences in the distribution of clonal types between cattle and small ruminants. Archives of Microbiology, 202(1): 115-125.
· Devriese, L.A. and Hommez, J. (1975). Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in dairy herds. Research in Veterinary Science, 19(1): 23-27.
· Dweba, C.C., Zishiri, O.T. and El Zowalaty, M.E. (2019). Isolation and molecular identification of virulence, antimicrobial and heavy metal resistance genes in livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pathogens, 8(2): 79-81.
· Ebrahimi, A. and Akhavan Taheri, M. (2009). Characteristics of staphylococci isolated from clinical and subclinical mastitis cows in Shahrekord, Iran. Iranian Journal of Veterinary Research, 10(3): 273-277. [In Persian]
· El-Tawab, A., Ashraf, A., El Hofy, A.I., Amaar, A.M., Sleim, M.A.E.H. and Salem, H.S. (2016). Molecular characterization for some virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus isolated from dairy cattle's subclinical mastitis in EL-Sharkia Governorate. Benha Veterinary Medical Journal, 30(1): 219-230.
· García-Álvarez, L., Holden, M.T., Lindsay, H., Brown, D.F., Webb, C.R., Curran, M.D., et al. (2011). Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. The Lancet Infectious Diseases, 11(8): 595-603.
· Gilbert, F. B., Cunha, P., Jensen, K., Glass, E. J., Foucras, G., Robert-Granié, C., et al. (2013). Differential response of bovine mammary epithelial cells to Staphylococcus aureus or Escherichia coli agonists of the innate immune system. Veterinary Research, 44(1): 1-23.
· Gomes, F. and Henriques, M. (2016). Control of bovine mastitis: old and recent therapeutic approaches. Current Microbiology, 72(4): 377-382.
· Havaei, S.A., Nasr Esfahani, B., Hoseini, N. and Assadbeigi, B. (2014). Investigation of Antibiotic Resistance Pattern and Detection of Methicillin-Resistant Strains (MRSA) in Staphylococcus Aureus Isolates Associated with Bovine Mastitis Journal of Isfahan Medical School, 32(298): 1319-1329. [In Persian]
· Hiramatsu, K., Cui, L.Z., Kuroda, M. and Ito, T. (2001). The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Trends in Microbiology, 9(10): 486-493. [In Persian]
· Hiramatsu, K., Katayama, Y., Matsuo, M., Sasaki, T., Morimoto, Y., Sekiguchi, A., et al. (2014). Multi-drug-resistant Staphylococcus aureus and future chemotherapy. Journal of Infection and Chemotherapy 20(10): 593-601.
· Identification of bacteria isolated from dairy goats with subclinical mastitis and investigation of methicillin and vancomycin resistant Staphylococcus aureus strains. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 66(2): 191-196.
· Kerro Dego, O. and Vidlund, J. (2024). Staphylococcal mastitis in dairy cows. Frontiers in Veterinary Science. https://doi.org/10.3389/fvets.2024.1356259.
· Khoei F., Mobaiyen, H., Nahaei, M.R. and Sedeghi Mohammadi, S. (2014). Antibiotic resistance pat-tern and Frequency of mecA gene in Staphylococcusaureus isolated from shohada hospital, Tabriz. Journal of Medical Microbiology and Infectious Diseases, 2(3): 105-8. [In Persian]
· Li, T., Lu, H., Wang, X., Gao, Q., Dai, Y., Shang, J. and Li, M. (2017). Molecular characteristics of Staphylococcus aureus causing bovine mastitis between 2014 and 2015. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7: 127.
· Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A. and Maguire, D. (2013). Clinical Veterinary Microbiology. E-Book: Clinical Veterinary Microbiology E-Book. Elsevier Health Sciences, 7(2): 105-120.
· Maskell, D.J. and Holmes, M.A. (2011). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine population in the UK and Denmark: a descriptive study. The Lancet Infectious Diseases, 11(8): 595-603.
· Nazer, A.H.K. and Sarmadi, R. (2005). Prevalence of clinical and subclinical mastitis, antibiotic resistance and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) in Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from cases of bovine mastitis. Journal of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, 60(3): 247-252.
· Öztürk, D., Türütoğlu, H., Pehlivanoğlu, F. and Yapicier, Ö.Ş. (2019). Identification of bacteria isolated from dairy goats with subclinical mastitis and investigation of methicillin and vancomycin resistant Staphylococcus aureus strains. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 66(2): 191-196.
· Phuektes, P., Mansell, P.D. and Browning, G.F. (2001). Multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and streptococcal causes of bovine mastitis. Journal of Dairy Science, 84(5): 1140-1148.
· Pourtaghi, H., Azizi, A.G. and Sodagari, H.R. (2016). Antimicrobial resistance patterns of Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical mastitis in Alborz province, Iran. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 19(2): 169-174.
· Sahebekhtiari, N., Nochi, Z., Eslampour, M., Dabiri, H., Bolfion, M., Taherikalani, M., et al. (2011). Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from raw milk of bovine subclinical mastitis in Tehran and Mashhad. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 58(2): 113-121. [In Persian]
· Salehi, S., Anzabi, Y. and Ali, K.A. (2021). Antibiotic resistance pattern and presence of biofilm producing ica operon virulence genes in coagulase positive Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in East Azerbaijan Province. Journal of Veterinary Clinical Pathology, 15(59): fa253-fa269.
· Sangarifar, S., Ghajavand, H., Johari, B. and Yari, A. (2017). Frequency of clf-A, mec-A, and mec-C Genes in Staphylococcus aureus strains isolated from nosocomial infections and cow’s milk. Anatomical Sciences Journal, 14(2): 91-96.
· Sasaki, T., Tsubakishita, S., Tanaka, Y., Sakusabe, A., Ohtsuka, M., Hirotaki, S., et al. (2010). Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococci. Journal of Clinical Microbiology, 48(3): 765-776.
· Schuenck, R.P., Lourenco, M.C., Iório, N.L., Ferreira, A.L., Nouér, S.A. and Santos, K.R. (2006). Improved and rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus nasal carriage using selective broth and multiplex PCR. Research in Microbiology, 157(10): 971-975.
· Shokohi, M., Ahmadizadeh, C. and Kaveh, A. (2018). Evaluation of bacterial causes of subclinical mastitis in dairy cattle of Negine Sabze Makoo agro-industrial and animal husbandry complex. Veterinary Clinical Pathology, 11(4): 379-396. [In Persian]
· Shome, B.R., Das Mitra, S., Bhuvana, M., Krithiga, N., Velu, D., Shome, R., et al. (2011). Multiplex PCR assay for species identification of bovine mastitis pathogens. Journal of Applied Microbiology, 111(6): 1349-1356.
· Shrivastava N, Sharma V, Nayak A, Shrivastava AB, Sarkhel BC, Shukla PC, et al. (2017). Prevalence and Characterization of Methicillin-Re-sistant Staphylococcus aureus (MRSA) Mastitis in Dairy Cattle in Jabalpur, Madhya Pradesh. Journal of Animal Research, 7(1): 77-78.
· Srednik, M.E., Crespi, E., Testorelli, M.F., Puigdevall, T., Pereyra, A.M.D., et al. (2019). First isolation of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus from bovine mastitis in Argentina. Veterinary and Animal Science, 7: 100043.
· Thammavongsa, V., Kim, H.K., Missiakas, D. and Schneewind, O. (2015). Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature reviews. Microbiology, 13(9): 529-543.
· Türkyılmaz, S., Tekbıyık, S., Oryasin, E. and Bozdogan, B. (2010). Molecular epidemiology and antimicrobial resistance mechanisms of methicillin‐resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk. Zoonoses and Public Health, 57(3): 197-203.
· VanRijen, M.M., Bosch, T., Verkade, E.J., Schouls, L., Kluytmans, J.A. and CAM Study Group. (2014). Livestock-associated MRSA carriage in patients without direct contact with livestock. PLoS One 9, e100294.
· Vasudevan, P., Nair, M.K.M., Annamalai, T. and Venkitanarayanan, K.S. (2003). Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Veterinary Microbiology, 92(1-2): 179-185.
· Yarabbi, H., Mortazavi, A., Mehraban, M. and Sepehri, N. (2014). Effect of somatic cells on the physico-chemical and microbial properties of raw milk in different seasons. International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 4(3): 289-298. [In Persian]
· Youssif, N.H., Hafiz, N.M., Halawa, M.A. and Aziz, H.M. (2021). Genes conferring antimicrobial resistance in cattle with subclinical mastitis. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 24(1): 55-56.
