بررسی مولکولی رونوشت mRNA ژن کد کننده نوروتوکسین¬ مؤثر بر کانال سدیمی موجود در سم عقرب مزوبوتوس اپئوس در منطقه جنوب غرب ایران

الموضوعات :

روژین اسدیان ¹ , عبدالحسن دولاح ²

1 - گروه زیست شناسی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران
2 - گروه زیست شناسی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران

تاريخ الإرسال : 02 الثلاثاء , صفر, 1446 تاريخ التأكيد : 28 السبت , شوال, 1446 تاريخ الإصدار : 23 الخميس , ذو الحجة, 1446

الکلمات المفتاحية: زهر عقرب, کلونینگ, نوروتوکسین کانال سدیمی, Mesobuthus eupeus,

ملخص المقالة :

زمینه و هدف: پپتیدهای موجود در زهر عقرب به دلیل ویژگی‌های سمیتی و دارویی که دارند مورد توجه محققین قرار دارند. این مطالعه با هدف بررسی مولکولی، تعیین توالی، ویژگی‌های فیلوژنتیک و کلونینگ ژن کد کننده نوروتوکسین مؤثر بر کانال سدیمی در سم عقرب Mesobuthus eupeus انجام پذیرفت.

مواد و روش‌ها: عقرب­های مورد مطالعه طی عملیات گشت شبانه از استان خوزستان، حومه شهرستان اهواز صید گردیدند.  استخراج RNA از بافت تلسون عقرب انجام شد. پس از سنتز cDNA، قطعه اولیه با استفاده از پرایمرهای دژنره تکثیر شد و توالی آن تعیین گردید. پرایمرهای اختصاصی بر اساس توالی به دست آمده طراحی شدند و تکثیر ژن مذکور مجدداً انجام پذیرفت. در ادامه، ژن تکثیر شده با استفاده از وکتور pTG19-T در باکتری Escherichia coli DH5-α کلون شد. پس از غربالگری کلنی‌های ترانسفورم شده، DNA پلاسمیدی استخراج شد و جهت توالی یابی ژن مذکور اقدام شد.

نتایج: مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد که پپتید مذکور دارای توالی‌های حفاظت شده مشابه نوروتوکسین مؤثر بر کانال سدیمی در عقرب M. eupeus است که تائید کننده ماهیت این پپتید است.

نتیجه گیری: علاوه بر تعیین توالی و ویژگی‌های مولکولی و فیلوژنتیک، در این مطالعه ژن مذکور به خوبی در باکتری E. coli DH5-α کلون شد که می‌تواند برای مطالعات داروشناسی و پزشکی آتی بر روی این توکسین مورد استفاده قرار گیرد.

المصادر:

1. Roy A, Bharadvaja N. Venom-derived bioactive compounds as potential anticancer agents: a review. International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 2021 Mar; 27:129-47.
2. Mansouri NJ, Akbarzadeh K, Jahanifard E, Vazirianzadeh B, Rafinejad J. Species diversity and abundance of scorpions in Ahvaz city, Southwest Iran. Biodiversitas Journal of Biological Diversity. 2021; 22(2).
3. Feola A, Perrone MA, Piscopo A, Casella F, Della Pietra B, Di Mizio G. Autopsy findings in case of fatal scorpion sting: a systematic review of the literature. InHealthcare 2020; 8(3): 325.
4. Daoudi K, Malosse C, Lafnoune A, Darkaoui B, Chakir S, Sabatier JM, Chamot‐Rooke J, Cadi R, Oukkache N. Mass spectrometry‐based top‐down and bottom‐up approaches for proteomic analysis of the Moroccan Buthus occitanus scorpion venom. FEBS Open Bio. 2021 Jul;11(7):1867-92.
5. Mendes LC, Viana GM, Nencioni AL, Pimenta DC, Beraldo-Neto E. Scorpion peptides and ion channels: an insightful review of mechanisms and drug development. Toxins. 2023 Mar 24;15(4):238.
6. Tobassum S, Tahir HM, Arshad M, Zahid MT, Ali S, Ahsan MM. Nature and applications of scorpion venom: an overview. Toxin Rev. 2020; 39(3):214-25.
7. Kazemi SM, Sabatier JM. Venoms of Iranian scorpions (Arachnida, Scorpiones) and their potential for drug discovery. Molecules. 2019;24(14):2670.
8. Mohammadpour Dounighi N, Eskandari R, Avadi MR, Zolfagharian H, Mir Mohammad Sadeghi A, Rezayat M. Preparation and in vitro characterization of chitosan nanoparticles containing Mesobuthus eupeus scorpion venom as an antigen delivery system. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 2012;18:44-52.
9. Bayatzadeh MA, Mirakabadi AZ, Babaei N, Doulah AH, Doosti A. Characterization, molecular modeling and phylogenetic analysis of a long mammalian neurotoxin from the venom of the Iranian scorpion Androctonus crassicauda. Biologia. 2020; 75(7):1029-41.
10. Chung CT, Niemela SL, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1989 Apr;86(7):2172-5.
11. Bayatzadeh MA, Zare Mirakabadi A, Babaei N, Doulah A, Doosti A. Expression and purification of recombinant alpha-toxin AnCra1 from the scorpion Androctonus crassicauda and its functional characterization on mammalian sodium channels. Mol Biol Rep. 2021; 48(9):6303-12.
12. Bouhaouala-Zahar B, Ducancel F, Zenouaki I, Ben Khalifa R, Borchani L, Pelhate M, Boulain JC, El Ayeb M, Ménez A, Karoui H. A recombinant insect-specific alpha-toxin of Buthus occitanus tunetanus scorpion confers protection against homologous mammal toxins. Eur. J. Biochem. 1996;238(3).
13. Jalali A, Baradaran M, Galehdari H, Ghoncheh P, Soorki MN. Analysis of Some Putative Novel Peptides from Iranian Scorpion Venom Glands, Hemiscorpius lepturus, Using cDNA Library Construction. Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products. 2023;18(1).
14. Bosmans F, Tytgat J. Voltage-gated sodium channel modulation by scorpion α-toxins. Toxicon. 2007; 49(2):142-58.
15. Quintero-Hernández V, Jiménez-Vargas JM, Gurrola GB, Valdivia HH, Possani L. Scorpion venom components that affect ion-channels function. Toxicon. 2013; 76:328-42.
16. Niya FH, Nassiri MT, Jolodar A, Roshanfekr H. Amplification and molecular identification of cDNA sequence coding for a peptide toxin from the venomous gland of the Khuzestan province scorpion Mesobuthus eupeus. 2016.
17. Baradaran M, Jalali A, Naderi-Soorki M, Jokar M, Galehdari H. First transcriptome analysis of Iranian scorpion, Mesobuthus eupeus venom gland. Iranian Journal of Pharmaceutical Research: IJPR. 2018; 17(4):1488.

نص كامل:



 

 

بررسی مولکولی رونوشت mRNA ژن کد کننده نوروتوکسین­ مؤثر بر کانال سدیمی موجود در سم عقرب مزوبوتوس اپئوس در منطقه جنوب غرب ایران

روژین اسدیان1، عبدالحسن دولاح2

 

1- دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران.

2- دانشیار، گروه زیست شناسی، واحد اهواز، دانشگاه آزاد اسلامی، اهواز، ایران. نویسنده مسئول [e-mail] 

 

 

تاریخ دریافت: 16/05/1403                                                                                     تاریخ پذیرش: 06/02/1404

چکیده

زمینه و هدف: پپتیدهای موجود در زهر عقرب به دلیل ویژگی‌های سمیتی و دارویی که دارند مورد توجه محققین قرار دارند. این مطالعه با هدف بررسی مولکولی، تعیین توالی، ویژگی‌های فیلوژنتیک و کلونینگ ژن کد کننده نوروتوکسین مؤثر بر کانال سدیمی در سم عقرب Mesobuthus eupeus انجام پذیرفت.

مواد و روش‌ها: عقرب­های مورد مطالعه طی عملیات گشت شبانه از استان خوزستان، حومه شهرستان اهواز صید گردیدند.  استخراج RNA از بافت تلسون عقرب انجام شد. پس از سنتز cDNA، قطعه اولیه با استفاده از پرایمرهای دژنره تکثیر شد و توالی آن تعیین گردید. پرایمرهای اختصاصی بر اساس توالی به دست آمده طراحی شدند و تکثیر ژن مذکور مجدداً انجام پذیرفت. در ادامه، ژن تکثیر شده با استفاده از وکتور pTG19-T در باکتری Escherichia coli DH5-α کلون شد. پس از غربالگری کلنی‌های ترانسفورم شده، DNA پلاسمیدی استخراج شد و جهت توالی یابی ژن مذکور اقدام شد.

نتایج: مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد که پپتید مذکور دارای توالی‌های حفاظت شده مشابه نوروتوکسین مؤثر بر کانال سدیمی در عقرب M. eupeus است که تائید کننده ماهیت این پپتید است.

نتیجه گیری: علاوه بر تعیین توالی و ویژگی‌های مولکولی و فیلوژنتیک، در این مطالعه ژن مذکور به خوبی در باکتری E. coli DH5-α کلون شد که می‌تواند برای مطالعات داروشناسی و پزشکی آتی بر روی این توکسین مورد استفاده قرار گیرد.

 

کلمات کلیدی: زهر عقرب، کلونینگ، نوروتوکسین کانال سدیمی، Mesobuthus eupeus

 

 

 

 

 

مقدمه

ترکیبات زیست فعال طبیعی به منظور مطالعه و اکتشاف داروهای جدید توجه بسیاری را به خود جلب کرده‌اند. در این بین، سموم طبیعی به دلیل اختصاصیت بالایی که می‌توانند برای سلول‌های هدف خود داشته باشند، از جایگاه ویژه‌ای در مطالعات داروشناسی برخوردارند. تعیین ویژگی‌های مولکولی، شیمیایی و داروشناسی سموم به منظور به کارگیری آنان در اهداف پزشکی از اهمیت بسیاری برخوردار است. سموم بیولوژیک همچون سم عقرب از دیرباز به دلیل ویژگی‌های سمیت اختصاصی که بر اجزای سلولی به ویژه اجزای غشای سیتوپلاسمی و کانال‌های یونی دارند، به عنوان ترکیبات زیست فعال مورد استفاده در پزشکی و داروسازی مورد توجه قرار گرفته‌اند (1).

عقرب‌ها گروهی از بندپایان متعلق به رده عنکبوتیان و راسته اسکورپیونیدا هستند. این موجودات تقریباً در همه نقاط کره زمین بجز قطب یافت می‌شوند و از توانایی بالایی جهت تطابق و بقاء در شرایط مختلف آب و هوایی برخوردارند. تقریباً همه گونه‌های عقرب‌ها شب‌زی هستند و در طول روز زیر سنگ‌ها، پوست درختان، و ... پنهان می‌شوند. سم عقرب ها یک ابزار دفاعی برای آنان است که با دفاع از خود در برابر طعمه‌ها، شکارچیان و رقبا، بقای آن‌ها را تضمین می‌کند (2). تاکنون در سطح جهان بیش از 2200 گونه عقرب مختلف شناسایی شده است که در 208 جنس و در 20 خانواده جای گرفته‌اند (3). 

عقرب ها به دلیل ویژگی‌های سمیتی زهر به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. زهر عقرب حاوی ترکیبات متنوع و ناهمگون و دارای ویژگی‌های مولکولی و بیولوژیک منحصربه‌فرد است. تخمین زده می‌شود که بیش از 100 هزار ماده مختلف در زهر عقرب‌های دنیا وجود داشته باشد. زهر عقرب دارای طیف گسترده‌ای از ترکیبات مانند آب، مخاط، پپتیدهای با وزن مولکولی کم، آنزیم‌ها، اسیدهای آمینه آزاد، آمین‌های بیوژنیک، نوکلئوتیدها، موکوپلی‌ساکاریدها، موکوپروتئین‌ها، هیستامین، سروتونین، و چندین ماده ناشناخته دیگر است (4). 

به دلیل ویژگی‌های فارماکولوژیک آن‌ها بر کانال‌های یونی و استفاده بالینی به عنوان سموم عصبی، ترکیبات موجود در زهر عقرب ها به طور گسترده مورد مطالعه قرار می‌گیرند. از بین این ترکیبات، پپتیدهای موجود در زهر عقرب از جایگاه ویژه‌ای در مطالعات سم‌شناسی برخوردارند. این سموم اگرچه بیشتر به دلیل اثرات مضرشان بر ارگانیسم‌ها شناخته شده‌اند، اما به دلیل ویژگی‌هایی همچون خواص ضد میکروبی، ضد سرطانی و سرکوب کننده سیستم ایمنی، برای توسعه داروها نیز مهم هستند (1). پپتیدهای با وزن مولکولی پایین حدود یک سوم پپتیدهای زهر عقرب را شامل می‌شوند. این ترکیبات عمدتاً به دلیل برهمکنشی که با کانال‌های یونی دارند سبب اختلال در عملکرد سلول‌های عصبی و ماهیچه‌ای می‌شوند. این پپتیدها بر اساس مکانیسم اثرگذاری‌شان به دو دسته اصلی نوروتوکسین های مؤثر بر کانال سدیمی و نوروتوکسین های مؤثر بر کانال پتاسیمی دسته‌بندی می‌شوند. کانال‌های سدیم ولتاژ دار مسئول ورود یون‌های سدیم هستند که پتانسیل عمل در سلول‌های عضلانی، عصبی و غدد درون ریز را افزایش می‌دهد. عملکرد پپتیدهای نوروتوکسیک می‌تواند بر فعالیت وابسته به ولتاژ کانال سدیم اثر گذاشته و سبب مهار یا القای بیش از حد آنان گردد (5، 6).

عقرب ها در ایران شامل 3 خانواده: Buthidae (51 گونه)، scorpionidae (3 گونه)، Hemiscorpiidae (5 گونه) می‌باشند. عقرب مزوبوتوس اپئوس (M. eupeus) متعلق به عقرب‌های خانواده بوتیده است، که بومی ایران به خصوص منطقه خوزستان است. جنس مزوبوتوس در ایران شامل 5 گونه شامل Mesubuthus eupeus (M. eupeus) ، M. gibbosus، M.vachon، M. martensii، M. tamulus است. گونه M. eupeus دارای پراکندگی گسترده‌ای در مناطق غربی ایران است (7). مطالعات سم‌شناسی معدودی بر روی پپتیدهای موجود در زهر این عقرب انجام شده است (8، 9)، اما ویژگی‌های مولکولی آنان کمتر مورد مطالعه قرار گرفته است. بر این اساس، مطالعه حاضر با هدف شناسایی مولکولی، تکثیر ژن و کلونینگ، توالی یابی و تعیین ویژگی‌های فیلوژنتیک نوروتوکسین­ مؤثر بر کانال سدیمی موجود در سم این عقرب مناطق جنوب غربی ایران انجام پذیرفت. نتایج این مطالعه علاوه بر افزایش دانسته‌ها در مورد ساختار مولکولی و ویژگی‌های فیلوژنتیک این سم، امکان دستیابی به سیستم‌های بیانی به منظور مطالعات داروشناسی و سم شناسی آتی را فراهم می‌نماید.  

مواد و روش‌ها

صید و شناسایی عقرب

عقرب­های مورد مطالعه طی عملیات گشت شبانه از استان خوزستان، حومه شهرستان اهواز صید گردیدند. عقرب ها درون جعبه‌های پلاستیکی حاوی پنبه مرطوب به آزمایشگاه انتقال و توسط کارشناسان بخش جانوران سمي موسسه تحقيقات واكسن سرم سازي رازي و بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک شناسایی شدند.

استخراج RNA

به منظور استخراج RNA از بافت تلسون عقرب از کیت تجاري EZ-10 Spin Column Animal Total RNA Mini-Preps Kit شرکت Bio Basic Canada و بر اساس دستورالعمل سازنده کیت استفاده شد. به طور خلاصه، mg 50 از بافت تلسون عقرب را در نیتروژن مایع کاملاً پودر کرده و درون میکروتیوب ریخته و در 350 میکرو لیتر بافر لیز کننده، لیز شد. نیمی از بافت لیز شده به محلول اتانل 96% در یک میکروتیوب منتقل شده و سپس از ستون جداسازی کننده RNA عبور داده شد. در نهایت RNA استخراج شده در RNase free water جمع آوری و در دمای منفی 70 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. جهت بررسی کمیت و کیفیت RNA استخراجی از دستگاه نانودراپ E-POCK انگلستان استفاده شد.

طراحی پرایمر دژنره، ساخت cDNA و تکثیر اولیه قطعات

با توجه به عدم وجود داده‌های توالی ژنی نوروتوکسین مذکور در گونه‌های عقرب ایرانی، طراحی پرایمر بر اساس توالی‌های مربوط به پروتئین‌های نوروتوکسين‌هاي مشابه شناسایی شده در عقرب‌های اين خانواده انجام شد. برای طراحی پرایمر از توالی های موجود در بانک پروتئین و بانک ژنی و نرم‌افزارهای بیوانفورماتیک استفاده شد. بر مبنای اسیدهای آمینه N-terminal و C-terminal پپتید، پرایمر دژنره اختصاصی به ترتیب به‌عنوان پرایمر forward و پرایمر reverse و با استفاده از نرم‌افزارهای Primer3 و oligo7 طراحی شد.

ساخت cDNA و واکنش PCR با استفاده از کیت تجاری One-Step AMV RT-PCR Kit شرکتBio Basic Canada و مطابق دستورالعمل سازنده کیت انجام پذیرفت. سنتز cDNA در دمای 42 درجه سانتی‌گراد و به مدت 30 دقیقه با استفاده از پرایمر Oligo dT انجام شد. در ادامه، تکثیر قطعات بر اساس پروتوکول دمایی شامل واسرشت اولیه به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد و سپس 30 چرخه تکثیر انجام شد. چرخه‌های تکثیر شامل واسرشت سازی در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در 49 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و پلیمریزاسیون به مدت 30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد بود. پس از تکثیر اولیه قطعات، به منظور اطمینان از تکثیر صحیح و جداسازی قطعات تکثیر شده از الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد استفاده شد. در ادامه ژن تکثیر یافته با استفاده از كيت تجاری PCR Clean Up for DNA Sequencing  شرکت Bio Basic Inc.  و مطابق دستورالعمل شركت سازنده خالص‌سازی شد.

تعیین توالی ژن تکثیر شده

به منظور تعیین توالی نوکلئوتیدی محصول خالص‌شده جهت توالی یابی به شرکت Bio Basic Inc. کشور کانادا ارسال شد. در این فرایند بر مبنای پرایمرهای مستقیم و معکوس طراحی شده، توالی یابی دوطرفه (Bidirectional) به روش سنگر انجام گردید. در ادامه با توجه به توالی به دست آمده، پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر دقیق ژن سم انجام پذیرفت. توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 نمایش داده شده است.

 

 

جدول 1- پرایمر اصلی و پرایمر دژنره

پرایمر دژنره	پرایمر اختصاصی
F: GCNMGNGAYGCNTAYATHG	F: GCTCGTGATGCTTATATTG
R: NCKRTGRCAYTTNCCNGG	R: GCGATGGCATTTTCCTGG

 

 

کلونینگ ژن

برای کلونینگ ژن سم مورد مطالعه از وكتور pTG19-T محصول شركت Vivantis استفاده شد. كلون سازی ژن در پلاسمید pTG19-T  انجام شد. سپس انتقال ژن به باكتري پذیرا شده E. coli سوش DH5α با روش ترانسفورماسيون يك مرحله­اي Chung و همكاران (10) انجام شد. به منظور تائید کلونینگ، باکتری‌های کلون شده بر روی محیط کشت LB agar حاوی 100 ميكروگرم آمپی‌سیلین در هر میلی‌لیتر، 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside X-Gal (20 mg/ml) و IPTG 100mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ، منتقل شدند. در ادامه به كمك ميله شیشه‌ای L شكل در تمام نقاط پليت پخش شده و 16 ساعت در دماي 37 درجه سانتی‌گراد انكوبه شدند. پس از رشد باکتری‌ها، کلنی‌های به رنگ سفید، که نمایانگر باکتری‌های ترانسفورم شده هستند، انتخاب شدند و در محيط LB جامد آمپی‌سیلین دار به صورت خطي كشت داده شدند.

استخراج پلاسمید

باكتري DH5-α ترانسفورم حاوی وکتور در محيط LB مايع حاوي آنتی‌بیوتیک به صورت شبانه در 37 درجه سانتی‌گراد با شيك متوسطrpm200 كشت داده شد. سپس استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی و با استفاده از کیت تجاری  Bio Basic Inc.و بر اساس دستورالعمل سازنده کیت انجام پذیرفت. در ادامه، استخراج پلاسمیدها با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز تائید شد. سپس پلاسیمدهای استخراج شده خالص‌سازی شدند و برای توالی یابی به شرکت Bio Basic Inc. کشور کانادا ارسال شدند.

آنالیزهای بیوانفورماتیک

پس از دست‌یابی به توالی‌های نوکلئوتیدی و اسید آمینه‌ای مربوط به ژن و پپتید سم، نسبت به آنالیز بیوانفورماتیک توالی‌ها اقدام گردید. در ابتدا آنالیز توالی اسید آمینه‌ای پپتید شامل بررسی‌های اولیه مربوط به ساختار خطی پپتید و بررسی توالی نوکلئوتیدی انجام شد. از نرم‌افزار DNASIS Max 3.0 برای بررسی Trimming و translation Frames و نرم‌افزار Bio Edit برای بررسی همردیف سازی Clustal W و local & global alignment مربوط به توالی اسید آمینه‌ای استفاده شد. همچنین از نرم‌افزار Snap Gene 3.2 به منظور آنالیز سازه ژنی وکتور، بررسی صحت کلون سازی ژن، بررسی نقشه ژنی و نوع دایرکشن های سازه ژنی استفاده گردید. برای بررسی همردیف سازیClustal / Muscle و رسم درخت فیلوژنتیک Neighbor-Joining method برای توالی اسید آمینه‌ای نیز از نرم‌افزار MEGA 10 استفاده شد. نرم‌افزارهای آنلاین BLASTP/BLASTN algorithm (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)، Basic Local Alignment Search Tool (uniprot.org/blast) و Swiss Modeler هم برای پیش‌بینی ساختار سوم و همردیف سازی بر اساس فرمت PDB مورد استفاده قرار گرفتند. پس از دست یابی به توالی های نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای مربوط به ژن و پپتید سم  ,این توالی ها در سیستم BLAST سایت NCBI قرار گرفته شد تا توالی خودمان را با توالی ژن های موجود در بانک ژن مقایسه شود. بعد از آن برمبنای بیشترین میزان شباهت بین توالی ما و توالی های دیگر ,توالی های مشابه از بانک ژن استخراج شدند و با هم همردیفی شدند و بعد از آن بر مبنای این همردیفی ماتریکس شباهت و تفاوت ها شناسایی شد و بعد از آن بر مبنای این همردیف سازی آمینو اسید ها ,درخت فیلوژنتیک رسم شد و با کمک این درخت میزان شباهت و نزدیکی بین توالی آمینواسیدی سم ما با سایر سموم موجود در بانک ژن در دنیا مقایسه شد.تمام مراحل همردیفی بر مبنای بانک های پروتیینی است که در سایت مرجع Uniprot است . در واقع بر مبنای , BLAST همردیفی ها در  Uniprot  بر مبنای بانک پروتیینی  انجام شد. و بعد با استفاده از الگوریتم های Clustal W موجود در نرم افزار Bio Edit همردیفی ها انجام شد و با استفاده از نرم افزار MEGA10 درخت فیلوژنتیک رسم شد.

نتایج

باکتری‌های کلون شده

پس از تکثیر ژن نوروتوکسین کانال سدیمی، قطعات مذکور در پلاسمید pTG19-T وارد شده و در DH5-α  E. coli ترانسفورم شدند. پس از كشت باکتری‌های ترانسفورم شده، کلنی‌های آبي و سفید تشکیل شدند. كلنـي‎‌های فاقـد پلاسميد نوتركيب بـه دليل سنتز بتاگالاكتوزيداز و تجزيه gal-X و توليد Indolyl به رنـگ آبـي ديـده می‌شوند. كلنـي‌های سفید هم نشانگر سلول های حـاوي پلاسـميد نوتركيب هستند (شکل 1). در ادامه کلنی‌های سفید به منظور حصول اطمینان از کلونینگ در محیط LB agar حاوی پنی‌سیلین رشد یافتند. در نهایت صحت کلونینگ با استفاده از استخراج پلاسمید و الکتروفورز ژل آگاروز تائید شد (شکل 2).

تعيين توالي ژن سم كلون شده

توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی ژن سم کلون شده در جدول 2 نمایش داده شده است.

 

 

 

 

شکل 1- کلنی‌های باکتری‌های رشد یافته به منظور غربالگری سلول‌های کلون شده: کلنی‌های سفید حـاوي پلاسـميد نوتركيب حامل ژن پروتئین سم MeENa می‌باشند

 

شکل 2- تصویر باندهای الکتروفورز مربوط به پلاسمید خالی pTG19-T و پلاسمید حاوی ژن پروتئین سم pTG19/MeENa و ژن پروتئین سم MeENa 

 

جدول2- توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی سم کلون شده

>MeENa	نام ژن
GCTCGTGATGCTTATATTGCCAAGCCCCATAACTGTG TATACGAATGTTTGGATCCATTTAGTAGTTATTGCAA CGATTTATGTACCAAGAACGGTGCTAAGAGTGGCTA TTGCCAAATTTTGGGTAAATATGGAAATGGTTGCTGG TGCATAGATTTGCCCGATAATGTACCGATTAGAATACC AGGAAAATGCCATCGC	توالی نوکلئوتیدی
ARDAYIAKPHNCVYECLDPFSSYCNDLCTKNGAKSGYCQIL GKYGNGCWCIDLPDNVPIRIPGKCHR	توالی آمینواسیدی
AlaArgAspAlaTyrIleAlaLysProHisAsnCysValTyrGluCysLeuAsp ProPheSerSerTyrCysAsnAspLeuCysThrLysAsnGlyAlaLysSerGly TyrCysGlnIleLeuGlyLysTyrGlyAsnGlyCysTrpCysIleAspLeuProAsp AsnValProIleArgIleProGlyLysCysHisArg	توالی آمینواسیدی

 

 

آنالیزهای بیوانفورماتیک

بر اساس نتایج، همولوژی بسیار بالای این توالی با توالی پپتیدهای سمی برای پستانداران به‌عنوان نوروتوکسین و نیز همولوژی بالای آن با سموم مؤثر بر کانال‌های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ در همردیف سازی مولکولی توالی اسید آمینه‌ای مشاهده گردید. شکل 3 آنالیزهای بیوانفورماتیک توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی تکثیر شده را نمایش می‌دهد. شباهت و نزدیکی بالای 90 درصد میان توالی ژن MeENa و توکسین های آلفای MeuNaTxalpha-13 و MeuNaTxalpha-5 و MeuNaTxalpha-4 از عقرب M. eupeus (Lesser Asian scorpion) (Buthus eupeus) دیده شد. این یافته نشان‌دهنده آلفا توکسین بودن سم شناسایی شده در این مطالعه و نیز شباهت بالا به سموم متصل شونده به کانال‌های سدیمی وابسته به ولتاژ می‌باشد (شکل 4).

شکل 5 همردیف سازی قطعه ژنی MeENa با توالی پپتیدهای موجود در بانک PDB بر مبنای الگوریتم‌های نرم‌افزار BioEdit را نمایش می‌دهد. این همردیف سازی بر مبنای توالی‌های محافظت‌شده Cys ونیز توالی‌های محافظت‌شده انتهاهای N و C زنجیره پپتیدی سموم مورد بررسی می‌باشد. در ادامه بر مبنای ماتریکس شباهت ارائه شده در نرم‌افزار BioEdit 7 و نیز MEGA 10 میزان همولوژی ژن MeENa با سایر توالی‌های بانک‌های ژنی تعیین شد (شکل 6). بر مبنای ماتریکس ارائه شده، ژن MeENa دارای همولوژی بسیار زیادی با توالی نوروتوکسین های مؤثر بر کانال‌های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ می‌باشد. همچنین مشاهده شد که این ژن دارای 93 درصد همولوژی با نوروتوکسین  MeuNaTxalpha-13 (G4WFQ2) از عقرب M. eupeus (Lesser Asian scorpion) (Buthus eupeus) جداسازی و شناسایی شده در کشور چین می‌باشد.

 

 

 

 

شکل 3. آنالیز فیلوژنتیک و همردیف سازی توالی پپتید سم شناسایی شده در بانک‌های پروتئینی

 

 

شکل 4. آنالیز سم MeuNaTxalpha-13 در Uniprot

 

آنالیز فیلوژنتیک مولکولی پپتید MeENa

شکل 7 درخت فیلوژنیک پپتید سم MeENa را نمایش می‌دهد. نزدیکی فیلوژنتیک و وابستگی تکاملی میان پپتید سم MeENa از عقرب M. eupeus ایرانی شناسایی شده در این مطالعه با سم MeuNaTxalpha-13 (G4WFQ2) و MeuNaTxalpha-5 (P86405) و MeuNaTxalpha-4 (P86404) از عقرب M. eupeus چین مشاهده شد. همه توکسین های این کلاستر در درخت فیلوژنتیک دارای همولوژی بسیار بالایی به عنوان سموم آلفای مؤثر بر کانال‌های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ هستند.

 

 

 

 

شکل 5- همردیف سازی بر مبنای الگوریتم BioEdit، پپتید MeENa در کنار 23 پپتید سمی استخراجی از Blast بانک پروتئین Uniprot

 

 

شکل 6- ماتریکس شباهت ارائه شده در نرم‌افزار BioEdit 7، میزان همولوژی ژن MeENa با سایر توالی‌های بانک‌های ژنی

 

بحث

تعیین روابط تکاملی و ویژگی‌های فیلوژنتیکی توکسین های موجود در سم عقرب می‌تواند بستر اطلاعات مناسبی جهت تعیین تنوع عملکردی و ویژگی های فارماکولوژیک های عقرب‌های مناطق فراهم آورده و برای توسعه داروهای درمانی جدید می‌تواند کمک کننده باشد (11). با توجه به اینکه ویژگی‌های مولکولی، توالی رونوشت و توالی پپتیدی نوروتوکسین کانال سدیمی عقرب مزوبوتوس اپئوس تاکنون بررسی نشده بود، در این مطالعه برای اولین بار، رونوشت mRNA ژن نوروتوکسین مذکور با استفاده از پرایمرهای دژنره تکثیر شد. سپس با طراحی پرایمرهای اختصاصی، رونوشت ژن مذکور به طور کامل و دقیق تکثیر و تعیین توالی گردید. در این مطالعه نشان داده شد که ژن نوروتوکسین سم عقرب در باکتری ایکلای DH5-α قابل کلونینگ و تکثیر می‌باشد. چنین سیستم‌هایی پیش از این به منظور بیان توکسین های پپتیدی عقرب استفاده شده است (12، 13). در مطالعه‌ای مشابه، Eskandari و همکاران  (8) یک نوروتوکسین جدید BMK از زهر عقرب M. eupeus کلون سازی و بیان کردند. آنان همچنین، ویژگی‌های ایمنی‌زایی سم مذکور را نشان دادند. بر این اساس، وکتورهای کلونینگ و بیان ژن‌های نوروتوکسین سم عقرب می‌تواند ابزاری ایده آل جهت تولید این پپتیدها به منظور مطالعات داروشناسی و سم شناسی آنان باشد. در این مطالعه مشاهده شد که نوروتوکسین زهر این عقرب دارای ویژگی‌های مشابه نوروتوکسین های مؤثر بر کانال‌های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ بود و دارای 93 درصد همولوژی با نوروتوکسین  MeuNaTxalpha-13 (G4WFQ2) از عقرب M. eupeus (Lesser Asian scorpion) جداسازی و شناسایی شده در کشور چین بود.

 

 

شکل 7- درخت فیلوژنتیک سم پپتید MeENa. آنالیز نزدیکی فیلوژنتیک بین MeENa و 23 توالی پپتیدی دیگر از بانک پروتئینی شامل توالی‌های سدیم کانال توکسین ها و سموم خانواده بوتیده. سم MeENa با علامت ● در درخت مشخص است.

 

 

کانال‌های سدیم ولتاژ دار(VGSCs) پروتئین‌های غشایی انتگرال بزرگی هستند که برای شروع و انتشار پتانسیل عمل در سلول‌های تحریک‌پذیر حیاتی هستند. بنابراین، سموم کانال سدیم عقرب (NaTxs) که فعالیت VGSCs را تغییر می‌دهند، مهم‌ترین نوع سموم عقرب از نظر پزشکی هستند. از نظر فیزیولوژیکی سموم کانال‌های سدیمی به دو گروه آلفا سموم (α-NaTxs) و بتا توکسین ها (β-NaTxs) تقسیم می‌شوند. α-NaTxs به محل گیرنده 3 VGSCs متصل می‌شوند و از غیرفعال شدن کانال جلوگیری می‌کنند (14)، در حالی که β-NaTxs به محل گیرنده 4 متصل می‌شوند و پتانسیل آستانه مورد نیاز برای فعال کردن کانال را به ولتاژهای منفی‌تر تغییر می‌دهند. 

این سموم حاوی 58-76 باقیمانده اسید آمینه هستند و توسط 4 پل دی سولفیدی از طریق 8 باقی‌مانده سیستئین به هم متصل شده‌اند (15). در این مطالعه نیز مشاهده شد که نوروتوکسین زهر M. eupeus دارای 8 رزیدو سیستئین است که احتمالاً در نشکیل 4 پل دی سولفیدی نقش دارد و از این جهت مشابه گزارش‌های پیشین است.  این پیوندهای دی سولفید در تشکیل ساختار سوم پروتئین دخالت دارد. از سویی این یافته با نتایج حسنی نیا و همکاران متفاوت است. آنان گزارش کردند که سموم عقرب‌های منطقه خوزستان دارای 3 پیوند دی سولفید هستند که با یافته‌های این مطالعه متفاوت است (16). همچنین، مشاهده شد که پپتید مذکور دارای 67 رزیدو اسید آمینه است. گزارش‌های پیشین بر روی توکسین های کانال سدیم شناسایی شده در این عقرب نشان دادند که سموم این عقرب دارای 52 تا 87 اسید آمینه هستند که با نتایج این مطالعه منطبق است (17). در مطالعه‌ای دیگر، Bayatzadeh و همکاران (2019) به بررسی مدل سازی مولکولی و فیلوژنتیک توکسین جدا شده از A. crassicauda پرداختند. آنان توانستند سم پپتیدی با تعداد 64 رزیدو آمینو اسیدی و وزن مولکولی 23/7255 دالتون را جداسازی کنند و با بررسی های مولکولی نشان دهند که این سم قابلیت اتصال به کانال های سدیم وابسته به ولتاژ را دارد. آنان همچنین بیان کردند که پپتید خالص سازی شده احتمالا یک توکسین مرتبط با کانال سدیمی است (9).

نتیجه‌گیری

در این مطالعه ژن نوروتوکسین کانال سدیمی زهر عقرب M. eupeus برای اولین بار با استفاده از پرایمرهای دژنره و اختصاصی تکثیر شد و با استفاده از وکتور pTG19-T در باکتری E. coli DH5-α کلون شد و در نهایت توالی دقیق رونوشت mRNA و پپتید مربوطه تعیین گردید. مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد که این پپتید دارای ویژگی‌های حفاظت شده مشابه سایر پپتیدهای نوروتوکسیک کانال سدیمی بوده و دارای 8 سیستئین است که احتمالاً در تشکیل 4 پیوند دی سولفید نقش دارد. نتایج این مطالعه با تعیین توالی ژن پپتید مذکور و دستیابی به سیستم کلونینگ و بیان امکان مطالعات بیشتر در زمینه داروشناسی و پزشکی مرتبط با این سم را فراهم می‌کند.

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر برگرفته از پايان نامه مقطع كارشناسي ارشد، مصوب معاونت پژوهش و فن آوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز می باشد. بدين وسيله، نويسندگان از این معاونت تشکر و قدردانی به عمل می آورند.

تعارض منافع

نویسندگان مقاله، تعارض در منافع ندارند.

 

 

فهرست منابع

 

1.       Roy A, Bharadvaja N. Venom-derived bioactive compounds as potential anticancer agents: a review. International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 2021 Mar; 27:129-47.

2.        Mansouri NJ, Akbarzadeh K, Jahanifard E, Vazirianzadeh B, Rafinejad J. Species diversity and abundance of scorpions in Ahvaz city, Southwest Iran. Biodiversitas Journal of Biological Diversity. 2021; 22(2).

3.        Feola A, Perrone MA, Piscopo A, Casella F, Della Pietra B, Di Mizio G. Autopsy findings in case of fatal scorpion sting: a systematic review of the literature. InHealthcare 2020; 8(3): 325.

4.        Daoudi K, Malosse C, Lafnoune A, Darkaoui B, Chakir S, Sabatier JM, Chamot‐Rooke J, Cadi R, Oukkache N. Mass spectrometry‐based top‐down and bottom‐up approaches for proteomic analysis of the Moroccan Buthus occitanus scorpion venom. FEBS Open Bio. 2021 Jul;11(7):1867-92.

5.        Mendes LC, Viana GM, Nencioni AL, Pimenta DC, Beraldo-Neto E. Scorpion peptides and ion channels: an insightful review of mechanisms and drug development. Toxins. 2023 Mar 24;15(4):238.

6.       Tobassum S, Tahir HM, Arshad M, Zahid MT, Ali S, Ahsan MM. Nature and applications of scorpion venom: an overview. Toxin Rev. 2020; 39(3):214-25.

7.       Kazemi SM, Sabatier JM. Venoms of Iranian scorpions (Arachnida, Scorpiones) and their potential for drug discovery. Molecules. 2019;24(14):2670.

8.       Mohammadpour Dounighi N, Eskandari R, Avadi MR, Zolfagharian H, Mir Mohammad Sadeghi A, Rezayat M. Preparation and in vitro characterization of chitosan nanoparticles containing Mesobuthus eupeus scorpion venom as an antigen delivery system. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 2012;18:44-52.

9.       Bayatzadeh MA, Mirakabadi AZ, Babaei N, Doulah AH, Doosti A. Characterization, molecular modeling and phylogenetic analysis of a long mammalian neurotoxin from the venom of the Iranian scorpion Androctonus crassicauda. Biologia. 2020; 75(7):1029-41.

10.       Chung CT, Niemela SL, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1989 Apr;86(7):2172-5.

11.       Bayatzadeh MA, Zare Mirakabadi A, Babaei N, Doulah A, Doosti A. Expression and purification of recombinant alpha-toxin AnCra1 from the scorpion Androctonus crassicauda and its functional characterization on mammalian sodium channels. Mol Biol Rep. 2021; 48(9):6303-12.

12.       Bouhaouala-Zahar B, Ducancel F, Zenouaki I, Ben Khalifa R, Borchani L, Pelhate M, Boulain JC, El Ayeb M, Ménez A, Karoui H. A recombinant insect-specific alpha-toxin of Buthus occitanus tunetanus scorpion confers protection against homologous mammal toxins. Eur. J. Biochem. 1996;238(3).

13.       Jalali A, Baradaran M, Galehdari H, Ghoncheh P, Soorki MN. Analysis of Some Putative Novel Peptides from Iranian Scorpion Venom Glands, Hemiscorpius lepturus, Using cDNA Library Construction. Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products. 2023;18(1).

14.       Bosmans F, Tytgat J. Voltage-gated sodium channel modulation by scorpion α-toxins. Toxicon. 2007; 49(2):142-58.

15.       Quintero-Hernández V, Jiménez-Vargas JM, Gurrola GB, Valdivia HH, Possani L. Scorpion venom components that affect ion-channels function. Toxicon. 2013; 76:328-42.

16.       Niya FH, Nassiri MT, Jolodar A, Roshanfekr H. Amplification and molecular identification of cDNA sequence coding for a peptide toxin from the venomous gland of the Khuzestan province scorpion Mesobuthus eupeus. 2016.

17.       Baradaran M, Jalali A, Naderi-Soorki M, Jokar M, Galehdari H. First transcriptome analysis of Iranian scorpion, Mesobuthus eupeus venom gland. Iranian Journal of Pharmaceutical Research: IJPR. 2018; 17(4):1488.

 

 

 

 

 

 

 

Molecular investigation of the mRNA transcript of the neurotoxin encoding the sodium channel in the venom of the scorpion Mesobutus apeus in the southwestern region of Iran

Rojin Asadian1, Abdolhassan Doulah2

 

1- MSc, Department of Biology, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran.

2- Associate Professor, Department of Biology, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran. Corresponding Author: [e-mail] 

 

. 

 Received:2024.08.06                                                                                    Accepted: 2025.04.26

 

Abstract

 Background & Aim: Peptides in scorpion venom are of interest to researchers due to their toxic and medicinal properties. This study was carried out with the aim of molecular investigation, sequencing, phylogenetic characterization and cloning of the gene encoding the neurotoxin effective on the sodium channel in the venom of the scorpion Mesobutus eupeus.

Materials & Methods: The studied scorpions were caught during a night patrol operation from Khuzestan province, Ahvaz city. RNA samples were extracted from scorpion telson tissue. After cDNA synthesis, the initial fragment was amplified using degenerated primers and the amplicon was sequenced. Next, specific primers were designed based on the obtained sequence and the amplification of the gene was done. The amplified gene was cloned using the pTG19-T vector in the competent Escherichia coli DH5-α host bacterium. After screening the transformed colonies, plasmid DNA was extracted and the gene was sequenced.

Results: Bioinformatic studies showed that the peptide has conserved sequences similar to the peptide neurotoxin effective on the sodium channel in the scorpion M. eupeus, which confirms the nature of this peptide.

Conclusions: In addition to determining the sequence and molecular and phylogenetic characteristics, in this study the mentioned peptide gene was cloned in E. coli DH5-α, which can be used for future pharmacological and medical studies on this toxin.

 

Keywords: Scorpion venom, Cloning, Sodium channel neurotoxin, Mesobuthus eupeus.