جداسازی و کلون سازی ژن آنزیم کوتیناز باکتری ترموبیفیدا فوسکا
الموضوعات :الهه پورفخرایی 1 , مهرداد بهمنش 2 , مجید عرفانی مقدم 3
1 - گروه بیوفیزیک، دانشگاه تربیت مدرس
2 - گروه ژنتیک، دانشگاه تربیت مدرس
3 - گروه بیوفیزیک، دانشگاه تربیت مدرس
الکلمات المفتاحية: کلون سازی, ترموبیفیدا فوسکا, کوتیناز,
ملخص المقالة :
سابقه و هدف: آنزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها است و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. هدف از این پژوهش، جداسازی و کلون سازی ژن آنزیم کوتیناز از باکتری ترموبیفیدا فوسکا (Thermobifida fusca) بود. مواد و روش‌ها: نمونه برداری از خاک های جنگلی شمال ایران صورت گرفت. با استفاده از محیط کشت اختصاصی و شرایط محیطی مناسب (10 pH= و دمای 60 درجه سانتیگراد) جداسازی باکتری بومی ترموفیل ترموبیفیدیا فوسکا انجام شد. پس از طراحی پرایمر ، ژن کوتیناز (cut1) از باکتری یاد شده جدا گردید. سپس در وکتور pBluescript sk کلون و به سویه DH5α اشریشیا کلی انتقال داده شد. به منظور تایید کلون سازی، هضم آنزیمی انجام ونمونه ها برای تعیین توالی ارسال گردید. یافته‌ها: در این تحقیق برای یافتن آنزیم کوتیناز با ویژگی‌های مطلوب تر، جداسازی و کلونینگ ژن آنزیم کوتیناز از باکتری ترموفیل بومی ترموبیفیدا فوسکا انجام شد. کلون سازی به کمک روش هضم آنزیمی و تعیین توالی مورد تایید قرار گرفت. با توجه به نتایج BLAST بیشترین شباهت با 98% همانندی با آنزیم کوتیناز cut1 و 96% شباهت باآنزیم کوتیناز cut-1.KW3 در باکتری ترموبیفیدا فوسکا مشاهده گردید. نتیجه گیری: با استفاده از آنزیم کوتیناز کلون شده در این تحقیق و با توجه به طیف وسیع عملکردی آن در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می‌تواند در رفع آلودگی‌های زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند.
1. Carvalho CML, Aires-Barros MR, Cabral1 JMS. Cutinase structure, function and biocatalytic applications. Electron J Biotechnol. 1998; 1(3): 160-173.
2. Heredia A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim Biophys Acta. 2003; 1620(1-3): 1-7.
3. Degani O, Salman H, Gepstein S, Dosoretz CG. Synthesis and characterization of a new cutinase substrate, 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. J Biotechnol. 2006; 121(3): 346-350.
4. Xia Y, Yu K, Navarre D, Seebold K, Kachroo A, Kachroo P. The glabra1 mutation affects cuticle formation and plant responses to microbes. Plant Physiol. 2010; 154(2): 833-846.
5. Liu Z, Gosser Y, Baker PJ, Ravee Y, Lu Z, Alemu G, Li H, Butterfoss GL, Kong XP, Gross R, Montclare JK. Structural and functional studies of Aspergillus oryzae cutinase: Enhanced thermostability and hydrolytic activity of synthetic ester and polyester degradation. J Am Chem Soc. 2009; 131(43): 15711-15716.
6. Billig S, Oeser T, Birkemeyer C, Zimmermann W, Hydrolysis of cyclic poly (ethyle terephthalate) trimers by a carboxylesterase from Thermobifida fusca KW3. Appl Microbiol Biotechnol. 2010; 87(5): 1753-1764.
7. Chen S, Su L, Billig S, Zimmermann W, Chen J, Wu J. Biochemical characterization of the cutinases from Thermobifida fusca. J Mol Catal B Enzym. 2010; 63(3-4): 121-127.
8. Gonçalves AP, Cabral JM, Aires-Barros MR. Immobilization of a recombinant cutinase by entrapment and by covalent binding. Kinetic and stability studies. Appl Biochem Biotechnol. 1996; 60(3): 217-28.
9. Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E. The Prokaryotes. Third Edition. USA: Springer Science-Business Media, Inc. 2006.
10. Zhang Z, Wang Y, Ruan J. Reclassification of Thermomonospora and Microtetraspora. Int J Syst Evol Microbiol. 1998; 48(2): 411-422
11. Wei R, Oeser T, Zimmermann W. Cloning, expression and mutagenesis of cutinases isolated from Thermobifida fusca KW3 and their applications for polyethylene terephthalate hydrolysis. Submitted to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE. 2010.
