شناسایی اشریشیاکلی در نمونه‌های دارویی و آب با استفاده از روش حسگر زیستی برپایه نانولوله‌های کربنی حاوی نانو ذرات طلا

شناسایی اشریشیاکلی در نمونههای دارویی و آب با استفاده از روش حسگر زیستی

الموضوعات :

فاطمه به افتاده ¹ ( دانشجو دکتری، گروه میکروبیولوژی دانشگاه علوم پایه ، دانشگاه آزاد اسلامی واحدلاهیجان، لاهیجان، ایران. )
محمد فائزی قاسمی ² ( دانشیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحدلاهیجان، لاهیجان، ایران. )
علی مجتهدی ³ ( استاد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ، تهران، ایران. )
خسرو عیسی زاده ⁴ ( استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحدلاهیجان، لاهیجان ، ایران. )
مصطفی گل شکن ⁵ ( استادیار، گروه شیمی آلی، دانشکده پیراپزشکی ، دانشگاه علوم پزشکی گیلان، رشت ، ایران. )

تاريخ الإرسال : 28 الخميس , شوال, 1444 تاريخ التأكيد : 21 الأربعاء , صفر, 1445 تاريخ الإصدار : 12 الجمعة , ربيع الثاني, 1445

الکلمات المفتاحية: حسگر زیستی, اشریشیاکلی, نانولوله‌های کربنی چندلایه, نانو ذرات طلا ,

ملخص المقالة :

سابقه و هدف: اشریشیاکلی یکی از شاخص های‌ مهم در کنترل کیفیت نمونه‌های دارویی و واقعی است. هدف از این تحقیق بررسی مقایسه‌ای تشخیص این باکتری با روش‌های متداول و استفاده از یک حسگر زیستی برپایه نانولوله‌های کربنی چندلایه بر روی الکترود شیشه‌ای کربن در نمونه‌های داروئی و واقعی مانند آب می‌باشد. مواد و روش‌ها: در این پژوهش تجربی، از روش متداول کشت(پورپلیت) و حسگر زیستی ساخته‌شده بر پایه نانولوله‌های کربنی چندلایه بر روی الکترود شیشه‌ای کربن با آرایش GC/MWCNTs/AuNPs/Ab/BSA برای تشخیص اشریشیاکلی استفاده شد. رقت‌های CFU/ml 108 × 1- 101 × 1 از باکتری اشریشیاکلی در نمونه‌های دارویی، و آب در بافر فسفات M1/0 حاوی استامینوفن mM5/0 استفاده گردید. ویژگی‌های حسگر زیستی به‌وسیله میکروسکوپ الکترونی، روش‌های الکتروشیمیایی ولتامتری چرخه‌ای و ولتامتری موجی مربعی بررسی و از باکتری‌های مداخله‌گر در بررسی عملکرد اختصاصی آن استفاده شد. یافته‌ها: نتایج تشخیص اشریشیاکلی توسط حسگر زیستی در نمونه‌های مختلف دارویی و آب ازنظر آماری در مقایسه با روش متداول کشت اختلاف معنی‌داری نشان نداد. اما حسگر زیستی طراحی‌شده برای باکتری اشریشیاکلی دارای حساسیت بالا و حداقل حد تشخیص CFU/ml02/3 باکتری اشریشیا کلی در زمان 3 دقیقه بود. نتیجه‌گیری: معمولا شاخص های میکروبی مانند اشریشیاکلی را با روش های متداول تشخیص می دهند. پایش میکروبی در ترکیبات دارویی با روش های متداول زمان بر بوده و خطر از دست رفتن محصولات دارویی را نیز به همراه دارد. اما حسگر زیستی در تشخیص این باکتری با صرف هزینه کم و بدون نیاز به غنی‌سازی در حجم کم نمونه‌ها، کارایی مناسبی دارد.

المصادر:

Mokhtari S, Tahamtan Y, Kargar M, Tadayon K, Moazamian E. Molecular typing E. coli O157: H7 isolates using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR technique and the relationship genetic and antibiotic resistance patterns. Journal of Microbial World. 2023;15(4):282-93.
2. Robatjazi SM, Hasanpour Matikolaee SM, Babaeipour VB, Rouhani Nejad H. Purification of recombinant human growth hormone produced in soluble form in Escherichia coli in lab-scale. Journal of Microbial World. 2020;12(4):343-54.
3. Ahmed A, Rushworth JV, Hirst NA, Millner PA. Biosensors for whole-cell bacterial detection. Clinical microbiology reviews. 2014;27(3):631-46.
4. Ivnitski D, Abdel-Hamid I, Atanasov P, Wilkins E. Biosensors for detection of pathogenic bacteria. Biosensors and Bioelectronics. 1999;14(7):599-624.
5. Bandari S, Arbab Soleimani N, Tajbakhsh E. The effect of probiotic lactobacilli on the attachment power and biofilm formation of Escherichia coli isolated from urinary tract infections. Journal of Microbial World. 2018;11(3):278-87.
6. Sandle T. Approaching the Selection of Rapid Microbiological Methods. Journal of Validation Technology. 2014;20(2):1-10.
7. Thostenson ET, Ren Z, Chou T-W. Advances in the science and technology of carbon nanotubes and their composites: a review. Composites science and technology. 2001;61(13):1899-912.
8. Wang J. Nanomaterial-based electrochemical biosensors. Analyst. 2005;130(4):421-6.
9. Wei B, Vajtai R, Ajayan P. Reliability and current carrying capacity of carbon nanotubes. Applied physics letters. 2001;79(8):1172-4.
10. Xia Y, Yang P, Sun Y, Wu Y, Mayers B, Gates B, et al. One‐dimensional nanostructures: synthesis, characterization, and applications. Advanced materials. 2003;15(5):353-89.
11. Liu C, Yu Z, Neff D, Zhamu A, Jang BZ. Graphene-based supercapacitor with an ultrahigh energy density. Nano letters. 2010;10(12):4863-8.
12. Pandey A, Gurbuz Y, Ozguz V, Niazi JH, Qureshi A. Graphene-interfaced electrical biosensor for label-free and sensitive detection of foodborne pathogenic E. coli O157: H7. Biosensors and Bioelectronics. 2017;91:225-31.
13. Ozkan-Ariksoysal D, Kayran YU, Yilmaz FF, Ciucu AA, David IG, David V, et al. DNA-wrapped multi-walled carbon nanotube modified electrochemical biosensor for the detection of Escherichia coli from real samples. Talanta. 2017;166:27-35.
14. Zheng L, Cai G, Wang S, Liao M, Li Y, Lin J. A microfluidic colorimetric biosensor for rapid detection of Escherichia coli O157: H7 using gold nanoparticle aggregation and smart phone imaging. Biosensors and Bioelectronics. 2019;124:143-9.
15. Meraat R, Issazadeh K, Abdolahzadeh Ziabari A, Faezi Ghasemi M. Rapid Detection of Escherichia coli by β-Galactosidase Biosensor Based on ZnO NPs and MWCNTs: A Comparative Study. Current Microbiology. 2020;77(10):2633-41.
16. Vu QK, Tran QH, Vu NP, Anh T-L, Le Dang TT, Matteo T, et al. A label-free electrochemical biosensor based on screen-printed electrodes modified with gold nanoparticles for quick detection of bacterial pathogens. Materials Today Communications. 2021;26:101726.
17. Ertaş T, Dinç B, Üstünsoy R, Eraslan H, Ergenç AF, Bektaş M. Novel electrochemical biosensor for Escherichia coli using gold-coated tungsten wires and antibody functionalized short multiwalled carbon nanotubes. Instrumentation Science & Technology. 2023:1-16.
18. Ghalandari Shamami M, Mirzaee M, Najar-peerayeh S. Frequency of papaA, papC genes and antimicrobial resistance pattern in uropathogenic Escherichia coli. Journal of Microbial World. 2016;9(1):44-52.
19. United States Pharmacopoeia 44th ed. National Formulary 39 ed. (USP 44/NF 39) (2021). In: United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 44-NF 39); United States Pharmacopeial Convention: Rockville, MD, USA,6410, 6457, 6463, 7819
20. Assari P, Rafati AA, Feizollahi A, Asadpour Joghani R. An electrochemical immunosensor for the prostate specific antigen based on the use of reduced graphene oxide decorated with gold nanoparticles. Microchimica Acta. 2019;186(7):1-9.
21. Iwunze MO. Electrooxidation of Ferrocene in Nano-emulsion. J Chem. 2020;14:37-48.
22. Bhardwaj J, Devarakonda S, Kumar S, Jang J. Development of a paper-based electrochemical immunosensor using an antibody-single walled carbon nanotubes bio-conjugate modified electrode for label-free detection of foodborne pathogens. Sensors and Actuators B: Chemical. 2017;253:115-23.
23. Gad SC. Pharmaceutical manufacturing handbook: production and processes: John Wiley & Sons; 2008.
24. Pal S, Basak S, Roy S, Roy D, Palchoudhuri S, Dastidar SG. Experimental evaluation of practical viability of Good Manufacturing Practice (GMP) in preparation of oral liquid formulations in small scale pharmaceutical industries. European Journal of Pharmacy and Medical Research. 2016;3(4):403-7.
25. Zhao Y-W, Wang H-X, Jia G-C, Li Z. Application of aptamer-based biosensor for rapid detection of pathogenic Escherichia coli. Sensors. 2018;18(8):2518.
26. Ivanov AV, Safenkova IV, Drenova NV, Zherdev AV, Dzantiev BB. Comparison of Biosensing Methods Based on Different Isothermal Amplification Strategies: A Case Study with Erwinia amylovora. Biosensors. 2022;12(12):1174.
27. Wu W, Nguyen BTT, Liu PY, Cai G, Feng S, Shi Y, et al. Single Escherichia coli bacteria detection using a chemiluminescence digital microwell array chip. Biosensors and Bioelectronics. 2022;215:114594.
28. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR journal. 2005;46(3):258-68.
29. Razmi N, Hasanzadeh M, Willander M, Nur O. Recent progress on the electrochemical biosensing of Escherichia coli O157: H7: Material and methods overview. Biosensors. 2020;10(5):54.
30. Pourmadadi M, Shayeh JS, Omidi M, Yazdian F, Alebouyeh M, Tayebi L. A glassy carbon electrode modified with reduced graphene oxide and gold nanoparticles for electrochemical aptasensing of lipopolysaccharides from Escherichia coli bacteria. Microchimica Acta. 2019;186(12):1-8.
31. Liu J, Xu Y, Liu S, Yu S, Yu Z, Low SS. Application and progress of chemometrics in voltammetric biosensing. Biosensors. 2022;12(7):494.
32. Cao Z, Li C, Yang X, Wang S, Zhang X, Zhao C, et al. Rapid Quantitative Detection of Live Escherichia coli Based on Chronoamperometry. Biosensors. 2022;12(10):845.
33. Salmani H, Azarnezhad A, Fayazi MR, Hosseini A. Pathotypic and phylogenetic study of diarrheagenic Escherichia coli and uropathogenic E. coli using multiplex polymerase chain reaction. Jundishapur journal of microbiology. 2016;9(2).
34. El-Moghazy AY, Wisuthiphaet N, Yang X, Sun G, Nitin N. Electrochemical biosensor based on genetically engineered bacteriophage T7 for rapid detection of Escherichia coli on fresh produce. Food Control. 2022;135:108811.
35. Pebdeni AB, Roshani A, Mirsadoughi E, Behzadifar S, Hosseini M. Recent advances in optical biosensors for specific detection of E. coli bacteria in food and water. Food Control. 2022:108822.
36. Pourmadadi M, Shayeh JS, Omidi M, Yazdian F, Alebouyeh M, Tayebi L. A glassy carbon electrode modified with reduced graphene oxide and gold nanoparticles for electrochemical aptasensing of lipopolysaccharides from Escherichia coli bacteria. Microchimica Acta. 2019;186:1-8.
37. Wang H, Zhao Y, Bie S, Suo T, Jia G, Liu B, et al. Development of an electrochemical biosensor for rapid and effective detection of pathogenic Escherichia coli in licorice extract. Applied Sciences. 2019;9(2):295.
38. Li T, Zhu F, Guo W, Gu H, Zhao J, Yan M, et al. Selective capture and rapid identification of E. coli O157: H7 by carbon nanotube multilayer biosensors and microfluidic chip-based LAMP. RSC advances. 2017;7(48):30446-52.
39. Simoska O, Stevenson KJ. Electrochemical sensors for rapid diagnosis of pathogens in real time. Analyst. 2019;144(22):6461-78.

نص كامل:



 

شناسایی اشریشیاکلای در نمونه‌های دارویی و آب با استفاده از روش حسگر زیستی برپایه نانولوله‌های کربنی حاوی نانو ذرات طلا

 

چکیده

سابقه و هدف: اشریشیاکلای یکی از باکتری‌های پراهمیت و از شاخص‌های مهم در کنترل کیفیت نمونه‌های دارویی و واقعی است. هدف از این تحقیق بررسی مقایسه‌ای تشخیص این باکتری با روش‌های سنتی و استفاده از یک حسگر زیستی برپایه  نانولوله‌های کربنی چندلایه بر روی الکترود شیشه‌ای کربن در نمونه‌های داروئی و حقیقی مانند آب می‌باشد.

 مواد و روش‌ها: در این تحقیق،از روش سنتی کشت(پورپلیت) و حسگر زیستی ساخته‌شده بر پایه نانولوله‌های کربنی چندلایه بر روی الکترود شیشه‌ای کربن با آرایش  GC/MWCNTs/Au NPs/Ab/BSA برای تشخیص اشریشیا کلای استفاده شد. ازرقت‌های (CFU/ml 108 × 1- 101 × 1) باکتری اشریشیاکلای در نمونه‌های دارویی و آب در بافر فسفات M1/0 حاوی استامینوفن  mM5/0 استفاده گردید. ویژگی‌های حسگر زیستی به‌وسیله میکروسکوپ الکترونی، روش‌های الکتروشیمیایی ولتامتری چرخه‌ای و ولتامتری موجی مربعی بررسی و از باکتری‌های مداخله‌گر نیز جهت بررسی عملکرد اختصاصی آن استفاده گردید. 

یافته‌ها: در مقایسه با روش سنتی کشت ، حسگر زیستی طراحی‌شده برای باکتری اشریشیاکلای دارای حساسیت بالا و حد تشخیص CFU/ml02/3 در زمان 3 دقیقه بود. حسگر اثر سوئی برباکتری نداشته و دارای قابلیت تشخیص اختصاصی بدون داشتن تداخل با عوامل مداخله‌گر است.

نتیجه‌گیری: حسگر زیستی طراحی‌شده کارایی مناسبی در تشخیص اشریشیاکلای در نمونه‌های دارویی و نمونه حقیقی مانند آب داشت. با بهره‌گیری از این حسگر می‌توان آلودگی احتمالی خطوط تولید را به‌سرعت تشخیص داد و نسبت به رفع آلودگی در محصولات دارویی اقدام کرد. 

 

واژگان کلیدی: حسگر زیستی،  اشریشیاکلای، نانولوله‌های کربنی چندلایه، نانو ذرات طلا

 

 

 

 

Detection of Escherichia coli in pharmaceutical and water samples using a biosensor based on carbon nanotubes containing gold nanoparticles

 

 

Abstract:

Background & Objectives: Escherichia coli is one of the important bacteria and indicators in the quality control of pharmaceutical and real samples. This study compares the detection of this bacterium by traditional method and a biosensor based on Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) on glassy carbon electrodes (GCE) in pharmaceutical and real samples such as water. 

 

Materials and Methods: In this study, the traditional culture method (pour plate) and modified biosensor based on Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) on glassy carbon electrode (GCE) with the arrangement of GC/MWCNTs/Au NPs/Ab/BSA were used for the detection of E. coli. Dilutions of E. coli between (1×101–1×108 CFU/ml) were used in pharmaceutical and real samples, which were prepared in 0.1M PBS (pH 7.4) mixed with 0.5mM acetaminophen. The efficiency of the designed biosensor was investigated using SEM, Cyclic Voltammetry, and Square-Wave Voltammetry electrochemical techniques and also, interfering bacteria and uric acid.

 

 

Results: In comparison with the conventional culture method, the newly designed biosensor had sensitivity with high accuracy in 3 minutes and LOD 3.02 CFU/ml for Escherichia coli. Acetaminophen had no harmful effect on E. coli and the biosensor was specified without interfering with other factors.

 

Conclusion: Designed biosensor is very efficient for the detection of Escherichia coli in pharmaceutical and real samples. By using this biosensor, we can detect possible contamination of production lines, to prevent contamination in pharmaceutical products.  

 

 

Keywords: Biosensor, Escherichia coli, Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs), Au nanoparticles (Au NPs)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه:

  باکتری اشریشیاکلای¹ باکتری گرم منفی بی‌هوازی اختیاری، شیمیو ارگانوتروف عامل عفونت روده‌ای، ادراری و ریوی و سیستم عصبی است (1) همچنین به‌عنوان یکی از شاخص‌های آلودگی مهم در صنایع دارویی و غذایی و حتی نمونه‌های واقعی بوده که ساکن در روده انسان و حیوانات است(2, 3). درروش سنتی برای تشخیص باکتری‌های کلی فرم مانند اشریشیاکلای مراحل متعددی از قبیل غنی‌سازی، غربال‌گری‌های بیوشیمیایی، غنی‌سازی‌های اختصاصی و گاهی آزمون‌های سرولوژیک لازم است که تا 72 ساعت زمان می‌برد(1, 4). روش‌های آزمون براساس استانداردهای دارویی اروپا و آمریکا مبتنی به روش کشت بوده و دارای خطای تبیین شده و محدودیت‌هایی از قبیل زمان حصول نتیجه و عدم تکرارپذیری و بازیافت میکروارگانیسم‌ها بوده لذا روش‌های سریع آزمون بخصوص مواردی که مبتنی برکشت نیستند راندمان بالاتری نسبت به روش‌های مرسوم دارند(5). حسگر زیستی یک ابزار تشخیصی بوده که می‌تواند با شناسایی مواد شیمیایی یا زیستی در ترکیب با یک ترکیب زیستی با یک شناساگر فیزیکوشیمیایی عمل نماید. حساسیت و اختصاصی بودن حسگر زیستی به آن این امکان را می‌دهد تا در رنج وسیعی از تشخیص در نمونه استفاده شود(3). اخیراً" ترکیبات نانو پتانسیل تشخیص حسگرها را در سطح وسیع با حجم کم نمونه فراهم آورده است(6-9).

 نانولوله‌های کربنی دارای چگالی و هدایت عالی و همچنین میزان بالای سطح هستند که در طراحی حسگرها استفاده می‌شوند(10). ازگرافن و ترکیب گرافن تک لایه بر روی ماده اولیه SiO2/Si برای تشخیص اشریشیاکلای 7 H:157O با دقتcell/ml  10-100در سال 2017 بهره گرفته شد(11). از DNA در نانولوله‌های کربنی جهت آرایش حسگر زیستی در تشخیص این باکتری در نمونه واقعی نیز استفاده شد(12). در سال 2019 یک حسگر زیستی با بهره از نانو ذرات طلا و تصاویر تلفن همراه هوشمند برای تشخیص اشریشیاکلای 7 H:157O با حد تشخیصcfu/ml 50 طراحی گردید(13).مرات و همکاران از حسگر زیستی از نانو ذرات اکسید روی بر نانولوله‌های کربنی چندلایه بر پایه بتاگالاکتوزیداز با حد تشخیص اشریشیاکلایcfu/ml 10 در مدت‌زمان 10 دقیقه استفاده کردند(14). حسگر زیستی با استفاده از نانو ذرات طلا آرایش یافته بر روی الکترودهای چاپ‌شده با صفحه کربن (SPE) در محلول فروسیانید پتاسیوم طراحی شد که دارای حد تشخیص  cfu/ml15 بوده است (15). در سال 2023 تحسین و همکارانش یک حس گر زیستی با استفاده از نانولوله‌های کربنی چندلایه جهت تشخیص اشریشیاکلای K-12 با روش بیوامپدانس طراحی کردند که دارای حد تشخیصcfu/ml 8/0 بود (16). باکتری اشریشیاکلای یکی از مهم‌ترین عوامل باکتریایی که باعث اسهال و شکم روش است و تشخیص سریع و دقیق این باکتری‌ها کمک شایانی به بررسی و کنترل عفونت خواهد کرد(17). 

در صنعت داروسازی براساس آخرین فارماکوپه آمریکا (USP44) و بریتانیا (BP2022) روش‌های کشت برای  شناسایی و تشخیص برای در مواد دارویی ذکرشده است(18). هدف از انجام این تحقیق تسریع در تشخیص و بررسی شاخص میکروبی اشریشیاکلای در محصولات دارویی و جلوگیری به هنگام از نشر آن و کم نمودن ضایعات در صنعت دارویی کشور و در نمونه واقعی مانند ادرار با استفاده از طراحی حسگر زیستی براساس ایمونوسنسور با استفاده از نانولوله‌های کربنی چندلایه شده آراسته با نانو ذرات طلا است. تشخیص این باکتری از اهداف جزئی‌تر طراحی روش‌های آزمون نوین با کارایی بالا برای نیل به نتایج با دقت و صحت بالا در تشخیص باکتری اشریشیاکلای در اشکال مختلف دارویی ماده سیتی کولین، نمونه آب اعم از آب قابل تزریق، آب خالص، آب شرب و همچنین نمونه ادرار در بحث آزمون‌های بیماران در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی است. تاکنون از حسگر زیستی با آرایش GC/MWCNTs/Au NPs/Ab/BSA در بافر فسفاتM 1/0 حاوی mM 5/0 استامینوفن به‌عنوان یک مولکول شاهد جهت عملکرد حس گرزیستی استفاده‌نشده است، همچنین از روش‌های تشخیص سریع با حسگر زیستی در زمینه مواد و محصولات دارویی استفاده‌نشده است و روش‌های رایج بسیار زمان‌بر و نیازمند فرآیندهای خنثی‌سازی بوده و انتظار تا تشخیص می‌تواند به از دست رفتن محصول و خسارات فاحشی در فرآیند تولید شود. همچنین در آزمون تشخیصی اشریشیاکلای در آب و ادرار نیز به‌واسطه این نوع حسگر تاکنون انجام‌نشده است.  

مواد و روش‌ها

مواد و شرایط کشت

محیط‌های کشت و مواد مصرفی در این تحقیق  از شرکت مرک (Merck KGaA (Darmstadt, Germany تأمین شد .آنتی‌بادی ضد اشریشیاکلای بیوتینه (ab68451) از شرکت Abcam بوستون آمریکا تهیه شد. از نانو ذرات طلاM 5/0 تهیه شده در H2SO4 برای طراحی حسگرزیستی استفاده شد. نانولوله‌های کربنی چندلایه نیز از شرکت نوترینو تهران تهیه گردید. سویه های باکتریایی اشریشیاکلای PTCC 1330 ، سالمونلا انتریکا² زیرگونه انتریکا سروتایپ تیفی موریوم  PTCC 1709، سودو موناس آئروجینوزا³ PTCC 1074، باسیلوس اسپیزینی⁴PTCC 1023 و استافیلوکوکوس اورئوس⁵ PTCC 1112 از مرکز کلکسیون میکروارگانیزم های صنعتی ایران تامین گردید. کشت اولیه ویال لیوفیلیزه اشریشیاکلای بر روی پتری دیش حاوی محیط تریپتون سویا آگار (TSA) فعال گردید و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. پس از آن کشت در محیط آبگوشت تریپتون سویا براث انجام و شمارش تعداد سلول های باکتری با تهیه رقت های باکتری اشریشیاکلای (CFU/ml 108 × 1- 101 × 1) در بافر فسفات 1/0 مولار با4/7 pH.  

آماده‌سازی حسگر برپایه نانولوله کربنی

 سطح الکترود کربن شیشه‌ای با قطر mm 2 به‌دقت با نانو ذرات 3/0 و 05/0 میکرومتر پودر آلومینا بر روی پارچه مخصوص، پوشش داده شد. برای حذف نانو ذرات جذب‌شده به‌صورت فیزیکی بر روی سطح، سر الکترود در لوله‌آزمایش حاوی استون در معرض امواج فراصوت قرار گرفت. پس این مرحله سر الکترود سه بار با آب خالص شستشو داده شد(19). برای بررسی و بهینه‌سازی الکترود با نانولوله‌های کربنی چندلایهµl 5 از سوسپانسیون همگن MWCNTs در استون با غلظت ml5 µg/5 بر سطح کربنی آن با دقت چکانده شد و جهت تشکیل یک‌لایه کاملاً یکنواخت در معرض هوا خشک شد. نانو ذرات طلا به روش کلرآمپرومتریک در پتانسیل 2/0- ولت به مدت 250 ثانیه در محلول هواگیری شده 5/0 مولار H2SO4 حاوی  mM3/0 HAuCl4 بر روی آن قرار گرفت. سپس سر الکترود با آب خالص شسته و در دمای 33 درجه سانتی گراد خشک شد(19). پس‌ازاین مرحله سر الکترود در درون محلول سترون ⁶NHS 5mM/ EDC 2mM به مدت 2 ساعت در دمای 33 درجه سانتی‌گراد به حالت غوطه‌ور قرار گرفت. پس از آن الکترود به‌آرامی با بافر فسفات M1/0 با 4/7 pH سترون شسته و در محلول آنتی‌بادی اشریشیاکلای با غلظت ml 10 µl/ 5 به حالت غوطه‌ور در دمای 33 درجه به مدت 1 ساعت قرار داده شد. در طی مراحل ظرف حاوی سر الکترود به‌طور متناوب هم زده شد تا واکنش‌پذیری تسریع گردد. پس‌ازاین مرحله نیز سر الکترود با بافرM1/0 PBS شسته شد و در دمای 33 درجه به مدت 30 دقیقه خشک گردید. میزان 5 میکرولیتر از محلول %w/v5/0BSA  به سر الکترودآرایش یافته چکانده شد و در دمای 33 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. الکترود مذکور آماده جهت آزمایش در دمای 2 تا 8 درجه نگهداری شد. مراحل کار و اصلاح الکترود در شمای 1 نشان داده‌شده است.

شمای 1: مراحل اصلاح سر الکترود با استفاده از نانولوله‌های کربنی چندلایه

 اندازه‌گیری بخش الکتروشیمیایی آزمایش توسط سه الکترود کار، الکترود شمارش گر و الکترود مرجع که در ظرف حاوی رقت‌های متعدد از اشریشیاکلای(CFU/ml 108 × 1- 101 × 1) که به بافر فسفاتM 1/0 حاویmM 5/0 استامینوفن استریل حاوی رقت مشخص از هر نمونه انجام شد. به‌واسطه روش ولتامتری موج مربعی⁷ (SWV) در رنج پتانسیل 0 تا 3/1 ولت در نرخ اسکن حدود mVs-1 100 اسکن انجام شد.

  جهت آزمون ماده اولیه داروی سیتی کولین مونوسدیم غلظت  mg/ml125 از ماده در بافر فسفاتM 1/0 حاوی mM 5/0 استامینوفن استریل به‌عنوان محلول اصلی تهیه گردید. غلظت نمونه خوراکی (mg/ml 100) و نمونه آمپول با رقت 1:10 بود. رقت های متعدد اشریشیاکلای با تعداد باکتری (CFU/ml 108 × 1- 101 × 1) استفاده شد. اسکن توسط روش SWV ا انجام و در روش سنتی شمارش  به روش پورپلیت از هر نمونه در هر رقت به صورت مجزا در دو پلیت انجام شد.  آب خالص، آب جهت تزریق و آب شرب تحت عنوان نمونه‌های واقعی مورد بررسی قرار گرفتند. 2 میلی‌لیتر از هریک از نمونه‌ها به 98 میلی‌لیتر از بافر فسفاتM 1/0 حاویmM 5/0 استامینوفن اضافه گردید، سپس از غلظت‌های متعدد اشریشیاکلای (CFU/ml 108 × 1- 101 × 1) به این محلول تلقیح گردید.

بررسی اختصاصی بودن تکرارپذیری و پایداری حسگرزیستی  

 از سویه‌های سالمونلا انتریکا زیرگونه انتریکا سروتایپ تیفی موریوم  PTCC 1709، سودو موناس آئروجینوزا PTCC 1074، باسیلوس اسپیزینیPTCC 1023 و استافیلوکوکوس اورئوس PTCC 1112 برای تشخیص عمل کردن اختصاصی الکترود طراحی‌شده استفاده شد، بدین ترتیب که هر سویه با رقتCFU/ml 105 × 1 آماده شد و سپس با روش SWV اسکن آن در حضور باکتری مرجع اشریشیاکلای انجام گردید. جهت تکرارپذیری و تجدید پذیری از 4 سری نتایج از غلظتCFU/ml  107 باکتری در حضور نمونه آمپول سیتی کولین در محدوده اسکن E1=0 تا E2=1.3  با سرعت روبش mV.s−1100 با تکنیک ولتامتری مربعی استفاده گردید. به منظور پایداری الکترود طراحی‌شده در زمان‌های صفر، 7 روز، 14 روز، 21 روز و 28 روز جهت اندازه‌گیری میزان تعداد باکتری در رقت  CFU/ml100 از باکتری در سرعت اسکن mV.s−1100 باکتری از تکنیک ولتامتری موجی مربعی و محدوده اسکن E1=0 تا E2=0.8 استفاده گردید.

تجزیه و تحلیل آماری

 به منظور تجزیه و تحلیل آماری از نرم‌افزار SPSS/PC  نسخه 26 استفاده شد. 

 یافته‌ها 

 نتایج نشان داد حضور مولکول استامینوفن در تشخیص باکتری اشریشیاکلای در دو روش تأثیر منفی نداشت. در حضور جمعیت‌های مختلف از باکتری اشریشیاکلای میزان اختلاف جریان توسط این ملکول دچار تغییراتی می‌شود که کمک شایانی در تخمین جمعیت باکتریایی دارد. نتایج حاصل از نمونه شربت سیتی کولین البرز دارو در جدول 1 نشان داده شده است که در مقایسه با نمونه خارجی دارای بیشترین تفاوت در غلظت CFU/ml106 به میزان 13/0 بود که در محدوده مجاز و بالای عدد 05/0 بوده و از نظرآماری معنی دار نمی باشد. نتایج بررسی محصولات تزریقی سه شرکت داروسازی مینو در تهران و البرز دارو و کاسپین تأمین رشت نیز دارای نتایج مشابه در هر دو روش بودند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 جدول 1- نتایج مقایسه‌ای مربوط به شربت سیتی کولین البرز دارو

نتایج مربوط به نمونه های شربت سیتی کولین شرکت البرزدارو
نتایج تست های قراردادی بدون استامینوفن			نتایج تست های قراردادی با استامینوفن			نتایج تشخیصی از حسگر زیستی			غلظت اشریشیاکلای (CFU/ml) در نمونه	لگاریتم غلظت باکتری تلقیح شده
سری 3	سری 2	سری 1	سری 3	سری 2	سری 1	سری 3	سری 2	سری 1
0	0	0	0	0	0	2/0	0	0	0	0
5/0	5/0	1	5/0	5/0	2	8/0	5/0	0	5/0	0
2	6	5/4	3	5	5/3	9/3	5	9/3	1	1
5/10	5/18	5/23	5/11	18	26	1/36	20	5/26	10	2
154	165	200	160	166	210	8/158	170	2/209	100	3
1350	1510	1570	1345	1520	1600	8/1389	1541	1595	1000	4
14500	15500	16600	15000	16000	16650	7/15473	16126	7/16576	10000	5
143000	168000	164200	143500	168000	165500	5/145038	178318	165881	100000	6
1510000	1580000	1650000	1610000	1650000	1670000	6/1614856	1665677	8/1729968	1000000	7
15300000	16500000	16200000	15450000	17000000	16300000	3/15399265	17074833	6/16159689	10000000	8

 

 نتایج بررسی در ماده اولیه سیتی کولین مونوسدیم ساخت شرکت Bajaj Healthcare  از کشور هند نیز مشابه و نزدیک به هم بود. در نمونه‌های آب بیشترین اختلاف در نتایج شمارش روش حسگر زیستی با روش مرسوم جهت آب قابل تزریق در غلظت CFU/ml105 به میزان 666/0 بوده و برای آب شرب در جمعیت باکتریایی CFU/ml 103 به میزان 395/0 بوده است که اختلاف از نظر آماری معنی‌دار نمی‌باشد( جدول 2). در رقت‌  CFU/ml107 × 1 در تفاوت به میزان 451/0 دیده شد. نتایج حاصل در آب قابل تزریق و ماده اولیه سیتی کولین به میزان1 بود و کمترین مقدار تفاوت را برای آب خالص درپایین ترین غلظت نشان داد که حدود 079/0 بوده که هیچ کدام شاخص و کمتر از 05/0 نبودند و این به معنی عدم وجود تفاوت بین داده‌های حاصل از حسگر زیستی با روش قراردادی است.

 

 

 

 

جدول2- نتایج مقایسه‌ای مربوط به آب شرب

نتایج مربوط به نمونه های آب شرب
نتایج تست های قراردادی بدون استامینوفن			نتایج تست های قراردادی با استامینوفن			نتایج تشخیصی از حسگر زیستی			غلظت اشریشیاکلای (CFU/ml) در نمونه	لگاریتم غلظت باکتری تلقیح شده
سری 3	سری 2	سری 1	سری 3	سری 2	سری 1	سری 3	سری 2	سری 1
0	0	0	0	0	0	2/0	0	0	0	0
5/0	0	5/0	5/0	0	5/0	4/0	2/0	3/0	5/0	0
7	4	4	7	6	5/3	1/5	6/4	6/3	1	1
33	24	30	34	23	5/28	1/36	2/18	4/30	10	2
250	208	325	260	224	330	8/338	232	8/338	100	3
2650	2420	2200	2700	2590	2350	5/2913	2/2673	7/2452	1000	4
32000	22600	25000	33000	23200	25600	33002	2/22990	4/25934	10000	5
245000	218000	222000	244000	218000	225000	3/260417	6/21923	3/234862	100000	6
3010000	2120000	2450000	3100000	2132000	2360000	6/3106167	2/2201422	7/2358346	1000000	7
21600000	21000000	19900000	21650000	21200000	2100000	21728089	1/21357256	3/20920601	10000000	8

 

 

ساختار و خصوصیات شکلی از الکترود برهنه کربن شیشه‌ای در مقایسه با الکترود تغییریافته به‌واسطه میکروسکوپ SEM  بررسی و درصد میزان عناصر موجود در GCE/MWCNTs/Au NPs در شکل A تا E آمده است.

 

 

شکل 1: سطح کربن شیشه‌ای برهنه(A), سطح کربن شیشه‌ای آراسته با نانولوله‌های کربنی چندلایه (B), سطح کربن شیشه‌ای آراسته با نانولوله‌های کربنی و نانو ذرات طلا (C), نقشه کلی از نانو ذرات طلا آراسته‌شده بر روی سطح نانولوله‌های کربنی چندلایه روی الکترود کربن شیشه‌ای(D), تصویر EDX از GCE/MWCNTs/Au NPs (E)

 

 

 

 

 

 در حسگر زیستی سطح الکترود کربن شیشه‌ای دارای پیک‌های اکسیداسیون و احیا بود که پس از قرارگیری نانولوله‌های کربنی چندلایه دچار تغییرات و با اضافه شدن نانو ذرات طلا این میزان افزایش داشت ، اما اضافه شدن آنتی‌بادی و سرم آلبومین تا حدی روند کاهشی را نشان داد بود. در شکلA تا D  نتایج اسکن با سه روش ولتامتری چرخه ای  (CV) ⁸, ولتامتری موجی مربعی (SWV) و ولتامتری پالس تفاضلی(DPV) ⁹ و امپدانس در همه مراحل قابل‌رؤیت است. همچنین میزان سطح مؤثر الکترود نیز براساس آرایش طراحی‌شده (GC/MWCNTs/Au NPs/Ab/BSA) از محلول5mM K3Fe (CN)6 در محلول  M1/0 KCl با روش ولتامتری چرخه‌ای (CV) در محدوده اسکن E1=-0.2 تا E2=0.8 با سرعت اسکن‌های مختلف (25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 و mv.S-1200) با دستگاه پتانسیواستات گالوانواستات منحنی گرفته و با فرمول 1 محاسبه شد که از میزان cm2 0314/0 به میزان cm2 0539/0 افزایش یافت.

(1)                                    

  در این فرمول ip میزان جریان ماکزیمم برحسب آمپر و n تعداد الکترون‌های جابه‌جاشده در پروسه احیا که معمولاً برابر با عدد 1 است و A میزان سطح الکترود برحسب cm2 که عدد موردمحاسبه است. D میزان ضریب انتشار برحسب cm2/s میزان (6-10×6/7) و C غلظت K3Fe (CN)6 برحسب mol/cm3 میزان (6-10× 5) و ν میزان سرعت اسکن V/s است (20).

 

شکل 2: نتایج ولتامتری موجی مربعی برای هر مرحله از اصلاح حسگر زیستی(A), نتایج ولتامتری پالس تفاضلی در هر مرحله از اصلاح (B), ولتامتری چرخه‌ای برای هر مرحله از اصلاح الکترود (C), طیف‌های امپدانس از اصلاح سطح حسگر زیستی (D)

  رسم منحنی کالیبراسیون از سر الکترود اصلاح‌شده دارای کارایی مناسب جهت سنجش میزان باکتری اشریشیاکلای در محلول بافر فسفات  M1/0 با 4/7 pH حاوی mM 5/0 استامینوفن حاوی غلظت‌های 0 تاCFU/ml  107 از باکتری اشریشیاکلای در ولتاژ mV.s−1100 در محدوده اسکن E1=0 تا E2=0.8  انجام و طول بیشینه میزان دماغه جریان در آن‌ها اندازه گرفته شد. رسم نمودار براساس لگاریتم غلظت نسبی باکتری نسبت به طول بیشینه میزان دماغه جریان و اندازه‌گیری شیب‌خط و همچنین ضریب رگرسیون انجام  شد که در شکل 3 قابل‌مشاهده است. براساس نتیجه موجود معادله خط کالیبراسیون براساس معادله 2 است:

Ip(µA)= 0.6688 Log E. coli population (CFU/ml) + 28.408 (R2=0.9938)                              (2)

 

 

 

شکل 3: SWV الکترود اصلاح‌شده با ترکیب نانولوله کربنی چندلایه در غلظت‌های مختلف باکتری اشریشیاکلای (0-107) در سرعت اسکن mV.s−1100 و محدوده اسکن E1=0 تا E2=0.8

 

  نتایج اسکن الکترود طراحی‌شده در سرعت mV. s−1 100  در محدوده E1=0 تا E2=0.8 از روش ولتامتری موجی مربعی در بافر فسفات M1/0 حاوی mM5/0 استامینوفن از رقت‌هایCFU/ml  105 باکتری‌های مداخله‌گر شامل سویه‌های سالمونلا انتریکا ، سودوموناس آئروجینوزا، باسیلوس اسپیزینی و  استافیلوکوکوس اورئوس  در مقایسه با گراف اولیه فاقد باکتری و در حضور باکتری اشریشیاکلای انجام و مورد مقایسه قرار گرفت و از معادله 3 درصد تداخل تعیین گردید.

 DI = (A-C)/(B-C) ×100%                       (3)         

  در این فرمول DI درجه تداخل بوده و A نیز میزان اختلاف دماغه بیشینه جریان (ΔI) باکتری مداخله‌گر و B میزان بیشینه دماغه جریان باکتری اشریشیاکلای و C نیز مربوط به بیشینه جریان در بافر بدون باکتری (Blank) می‌باشد. میزان DI نشانگر میزان تداخل باکتری‌های مداخله‌گر و اختصاصی بودن الکترود جهت تشخیص باکتری اشریشیاکلای می‌باشد. این میزان برای چهار باکتری مداخله‌گر به ترتیب باسیلوس اسپیزینی میزان % 68/49- و برای سالمونلا میزان % 66/34- و برای سودوموناس آئروژینوزا % 69/48- و در مورد استافیلوکوکوس اورئوس میزان % 67/38- بود این در حالی است که میزان DI برای باکتری اشریشیاکلای میزان % 79/98 مشاهده شد. این نتایج حاکی از میزان اختصاصی بودن الکترود طراحی‌شده است. حد تشخیص (LOD) الکترود طراحی‌شده برای اشریشیا کلای که میزان آن 02/3 به دست آمد.

 

 

بحث

اولین واساسی‌ترین مرحله در کنترل باکتری‌ها تشخیص مؤثر و سریع آنها در نمونه بدون نیاز به فرآیند آماده‌سازی است. بعضی از مراحل آماده‌سازی شامل عصاره گیری، جداسازی، غنی‌سازی و شمارش است. حسگرهای زیستی به دلیل انعطاف‌پذیری زیاد در طراحی، سبکی ساختار، ارزان بودن بسیار مورداستفاده و مقبول هستند(21). مطابق قوانین عملیات بهینه تولید (GMP) محصولات دارویی و همچنین استانداردهای سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) لازم است شرایط کلیه خطوط تولید دارویی اعم از آب، مواد مصرفی و پایش های کامل فضاهای تولیدی و کارکنان به‌طور کامل موردبررسی و معتبر سازی قرار گیرد. به این ترتیب آزمایشگاه میکروبیولوژی هر شرکت دارویی موظف است کلیه آزمون‌های مربوط به این موارد را در دستور کار خود قرار دهد (22). تائیدات در قوانین GMP در این امر بخصوص جهت فرموله کردن و تولید محصولات خوراکی و شرایط آن‌ها جهت آلودگی با باکتری‌های موجود در هوا و آب و همچنین رنج قابل‌قبول آلودگی (کمتر از  CFU/ml100) ناشی از شمارش میکروارگانیسم‌ها در آن‌ها و دارا بودن پتانسیل بالای آلودگی شدت و اهمیت بیشتری پیدا می‌کند(23).        در حال حاضر سه روش اصلی جهت تشخیص باکتری اشریشیاکلای وجود دارد: روش شمارش در محیط‌های کشت( سنتی)، روش‌های تشخیص مولکولی زیستی، روش‌های تشخیصی ایمونولوژیک. روش سنتی کشت یک روش بر پایه مشاهده شکل شناسی کلنی و تغییر رنگ و واکنش‌های بیوشیمیایی در محیط خاص بعد از جداسازی و کشت باکتری است، که به روش شمارش در پلیت و بیشترین آمار احتمال شمارش تقسیم می‌شود. روش شمارش دارای رنج تعداد 15 تا CFU 150 است در حالیکه MPN برای شمارش کلی فرم‌ها در نمونه‌ها با تعداد کم مناسب است. روش کشت سنتی به‌شدت محدود به گذشت زمان طولانی برای تشخیص است(72 تا 120 ساعت).

 در مقایسه با روش سنتی کشت، روش واکنش زنجیره پلی مرازی به‌طور وسیع برای تشخیص اشریشیاکلای استفاده‌شده است (24). اگرچه PCR زمان تشخیص را بسیار تقلیل می‌دهد اما مراحل مختلف آن از دناتوراسیون تا طویل سازی نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی خاص دارد و همچنین آنزیم‌های PCR حساس به ممانعت حاصل از ترکیبات پیچیده هستند(25). اگرچه تعیین ترادف DNA  در آن اطلاعات قابل‌توجهی را جهت شناسایی باکتری‌های بیماری‌زا فراهم می‌کند اما روش پرهزینه با چالش‌های بسیار و نیازمند کارشناسان مجرب جهت انجام است. در مقایسه با تعیین ترادف DNA روش PCR کمی در زمان واقعی حساسیت و اختصاصی بودن بیشتر (کمتر از  CFU/ml10) دارد و در حدود چند ساعت قابل انجام است. به‌هرحال در کنار این نکات آنزیم DNA پلی مراز حساس به بسترهای آلوده‌کننده و ممانعت کننده در نمونه‌های اولیه است. نکته مورد اهمیت این است که این روش‌های مولکولی قابلیت تشخیص متفاوت باکتری زنده از مرده و یا ترادف DNA که هیچ اثر سوئی در بیماری انسان ندارند را دارا نمی‌باشند، به این دلیل این روش‌ها به‌عنوان یک ریسک در جهت سنجش آلودگی اشریشیاکلای بوده و به‌نوعی جزو هزینه‌های غیرضروری شمرده می‌شوند(26).

 روش ارزیابی ایمونولوژیکی با اتصال آنزیم (ELISA) یک روش برای تشخیص اشریشیاکلای است که بر پایه توانمندی واکنش اتصال ایمونولوژیکی بین یک آنتی‌ژن و یک آنتی‌بادی است. اختصاصی بودن و حساسیت روش الایزا بسیار بالاست و می‌تواند میزان اشریشیاکلای در آب و غذا در رنج وسیعی تشخیص داد. اما کمبودهای این روش را نمی‌توان نادیده گرفت به‌طور مثال کیت‌های آماده‌شده الایزا را نمی‌توان به مدت طولانی نگهداری کرد. این روش کارایی بالایی در سنجش میزان پروتئین دارد و بعضی نمونه‌ها با وزن مولکولی کوچک فعالیت ایمونولوژیکی ندارند نیاز به جفت شدن با پروتئین‌های بزرگ مولکول برای تشخیص دارند(24).

 همچنین رویکردهای نشانه‌گذاری ایمونولوژیکی جهت تعیین اشریشیاکلای با استفاده از فلوئورسین، آنزیم یا نانو ذرات اتصال یافته به آنتی‌بادی‌ها جهت اتصال به آنتی‌ژن‌های هدف خاص روی سطح باکتری و تشخیص آن به‌واسطه میکروسکوپ فلوئورسنت، دوربین تلفن همراه و یا خوانش صفحات است. از اهداف نشاندارکردن ایمونولوژیک جهت اتصال به اشریشیاکلای در سطح حسگرهای زیستی اندازه گیری تغییرات به‌وسیله امپدانس و یا رزونانس‌های سطحی پلاسمون است(26) در این تحقیق به دلیل هزینه بالا، حساسیت بالای معرف‌ها و تجهیزات پیچیده و ناتوانی در تشخیص باکتری مرده از زنده برای استفاده عملیاتی موردتوجه قرار نگرفت. استفاده از فن‌آوری پخش نفوذ سطحی رامان (SERS) بود که بسیار سریع اما حساس به آنتی‌بیوتیک بود و در کمتر از 2 ساعت شناسایی باکتری را انجام می‌داد که دارای راندمان پایین و هزینه بالا و نیازمند وسایل جنبی و ریسک آلودگی بالا به دلیل باز بودن نمونه است(26). استفاده از آنتی‌بادی کمک شایانی به اختصاصی بودن حسگرهای زیستی می‌کند، آنتی‌بادی منو کلونال در مقایسه با آنتی‌بادی پلی کلونال می‌تواند آنتی‌ژن اپی توب های خاصی را شناسایی کند(27) به دلیل خصوصیات و الزامات آزمون‌ها در فارماکوپه آمریکا و اروپا مونوکلونال آنتی بادی جهت کار دارای محدودیت‌های تشخیص بوده و از نوع پلی کلونال در تحقیق استفاده گردید. ضمنا" ساختار برهمکنش این آنتی‌بادی به‌کل سلول اشریشیاکلای است و قابلیت اتصال به سلول‌های مرده یا توالی نوکلئوتیدی نامرتبط نداشته و این امر کمک شایانی در سنجش صحیح میزان و حضور یا عدم حضور باکتری اشریشیاکلای در نمونه دارد که دقیقا" از نکات مهم و ارزشمند در تشخیص است و از مردود نمودن نمونه به‌طور کاذب جلوگیری می‌نماید.  با توجه به استفاده از روش آمپرومتریک و بهره گیری از فرآیند اکسیداسیون و احیا در تشخیص باکتری اشریشیاکلای لازم بود که از یک مولکول شاهد در ترکیب بافر فسفات با 4/7 pH  استفاده گردد. 

در مطالعه توسط پورمددی و همکاران در سال 2019 روش آپتامری با استفاده از الکترود کربن شیشه‌ای و اکسید گرافن احیاشده و نانو ذرات طلا ساخته شد که در آن از نمک  [Fe (CN)6] -3/−4¹⁰ جهت آزمایش استفاده شد که خود به دلیل ترکیب سیانید دارای سمیت برای باکتری‌ها بوده و باعث حصول نتایج نادرست یا محدودیت در بازه تشخیص در نمونه‌ها خواهد بود(28). در مقایسه با دیگر مطالعات انجام‌شده حضور مولکول استامینوفن در طراحی شرایط تشخیص حسگر زیستی است که خود شاخص بسیار مناسبی برای اندازه‌گیری تغییر میزان ارتفاع بیشینه جریان در ولتاژ 4/0 ولت بود که این امر دارای نوآوری در طراحی حسگرهای زیستی است. استفاده از مولکول شاهد استامینوفن برای اولین بار در طراحی روش‌های تشخیصی کمک شایانی به تشخیص و تعیین میزان آلودگی باکتری اشریشیاکلای در نمونه‌ها داشت از طرفی این مولکول فاقد اثر ممانعت کننده بر باکتری بود است. در تحلیل مقایسه‌ای داده‌های حاصل از حسگر زیستی با آزمون‌های مرسوم آزمایشگاهی در حضور استامینوفن و همچنین عدم حضور آن شمارش تعداد کلنی‌های باکتری در بافر فسفات در مقایسه با بافر فسفات حاوی مولکول استامینوفن تغییر چشمگیری نداشت و حضور استامینوفن مزاحمتی برای رشد یا عدم رشد باکتری در نمونه موردبررسی ندارد. همچنین رقت سازی و اندازه‌گیری تغییرات جریان در بافر فسفات با pH مناسب باعث حداقل نمودن آسیب به میکروارگانیسم‌ها بالأخص در رقت‌های پایین بود که این امر نقطه مثبتی در حصول نتایج با درستی بالا و منطبق بر نتایج روش‌های مرسوم موجود است.  

 در مقایسه با مطالعات قبل هریک از روش‌های سنجش آمپرومتریک جهت بررسی در تحقیق فوق از روش SWV به‌عنوان روش اصلی سنجش میزان باکتری اشریشیاکلای استفاده شد علت این امر سرعت و دقت و حساسیت بالای این روش در مقایسه با روش‌های ولتامتری چرخه‌ای، ولتامتری پالس تفاضلی، ولتامتری پالس طبیعی و غیره بوده و دارای پیک تیزتری در سنجش است(29). در مطالعه توسط Vu و همکاران در سال 2021 یک حسگر زیستی الکتروشیمیایی از نوع فاقد نشانگر با استفاده از نانو ذرات طلا برای تشخیص سریع میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا طراحی شد که جهت تشخیص اشریشیاکلای از روش ولتامتری چرخه‌ای و اسپکتروفوتومتری امپدانس الکتروشیمیایی در محلول K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] ¹¹ با غلظت mM 5 اضافه‌شده به M 1/0 KCl استفاده کرد که دارای حد تشخیص حدود CFU/ml 15 در مدت‌زمان 30 دقیقه بود، که در مقایسه با حسگر طراحی‌شده در این تحقیق دارای قدرت تشخیص پایین‌تری بوده است(15).

 در مقایسه حسگرهای زیستی دیگر طراحی‌شده, نمونه طراحی‌شده دارای رنج تشخیص باکتری وسیع‌تری ( 0 تا  CFU/ml107) می‌باشد. برای نمونه Cao و همکاران در سال 2022 حسگر زیستی برای تشخیص باکتری اشریشیاکلای به روش مستقیم با استفاده الکترود کربن شیشه‌ای طراحی نمودند که رنج تشخیصی بسته‌تر( 104 تا  CFU/ml108) داشتند(30). ازآنجاکه در اغلب محصولات دارویی خوراکی از مواد نگهدارندهِ اعم از متیل پارابن و پروپیل پارابن استفاده می‌شود و جهت انجام آزمایش شمارش میکروبی و بررسی حضور باکتری اشریشیاکلای به روش مرسوم فارماکوپه های معتبر نیاز به فرآیند خنثی‌سازی اثر ممانعت کننده این مواد قبل از انجام آزمایش است که این خود مستلزم صرف هزینه‌های بیشتر و اعتبارسنجی روش خنثی‌سازی مورداستفاده دارد. در مقایسه با این امر استفاده از این حسگر زیستی بدون نیاز به این مرحله توانسته است کمک قابل‌توجهی به کم نمودن هزینه‌ها و کم نمودن زمان تشخیص داشته باشد. دمورد قابل‌ذکر دیگر مورد تأیید بودن نتایج در مقایسه برندهای محصولات دارویی تولیدی اعم از آمپول‌های شرکت‌های البرزدارو, کاسپین تأمین و مینو و شربت‌های برند خارجی و البرز دارو است. این مسئله نشانگر این است که تفاوت فرموله شدن در محصولات تأثیر سوئی بر نتایج آزمایش با روش استفاده از حسگر زیستی نداشته و این روش قابلیت انجام برای کلیه محصولات دارویی سیتی کولین را دارا است.

 از دیگر معضلات تشخیص درروش های مرسوم عدم امکان شناسایی کلیه باکتری‌ها اعم از قابل انواع کشت و غیرقابل کشت در نمونه می‌باشد (5, 17) که این خطا به‌واسطه استفاده از حسگر زیستی رفع شده است. همچنین مشکلاتی از قبیل تنظیم pH، شرایط، دمای کشت و کیفیت محیط کشت مصرفی ازنظر قابلیت عوامل قابل‌توجهی در انجام آزمایش‌ها سترون بودن، شمارش و بررسی میکروارگانیسم بیماری‌زای اشریشیاکلای به روش مرسوم است لذا استفاده از حسگر زیستی طراحی‌شده با آرایش GC/MWCNTs/Au NPs/PAb/BSA محدودیت‌های فوق‌الذکر را نداشته و توانایی بالایی در تشخیص این باکتری داشته است. از موارد فراوان دیگر این است که درروش تشخیصی طراحی‌شده فعلی نیاز به غنی‌سازی قبل از تشخیص وجود ندارد درحالی‌که در بسیاری از حسگرهای زیستی مانند نمونه طراحی‌شده توسط  El.Moghazy و همکارن در سال 2022  از ترکیبات نانولوله کربنی در طراحی استفاده شد که جهت تشخیص اشریشیاکلای نیاز به حداقل یک ساعت غنی‌سازی قبلی داشت (31) و همچنین درروش مرسوم نیز نیاز به غنی‌سازی در محیط مک کانکی براث می‌باشد.

 اغلب حسگرهای زیستی طراحی‌شده برای اشریشیاکلای در تشخیص در نمونه‌های غذایی و آب (32, 33) ویا نمونه‌های واقعی مانند ادرار یاسرم بیماران (34) طراحی‌شده‌اند. از مطالعات پیشین دیگر در این زمینه می‌توان به حسگر طراحی‌شده توسطWang  و همکاران اشاره نمود که یک حسگر بیوشیمیایی بر پایه آپتامر بوده و امکان تشخیص سریع باکتری اشریشیاکلای با رنج حدودی102× 5 تا CFU/ml 107× 5 در عصاره لیکوریس (شیرین‌بیان) با حد تشخیص حدود CFU/ml 80 را داشته است(35). همچنین حسگر زیستی دیگری با استفاده از نانولوله‌های کربنی و یک سیستم بر پایه ریزتراشه با سیستم LAMP  طراحی شد که دارای حد تشخیص CFU/ml 1 بود که از فواید این حسگر اختصاصی بودن، هزینه کم، تکثیر پذیری و تکرارپذیری بالابود از طرفی دیگر این حسگر زیستی قابلیت تشخیص  اشریشیاکلای سروتیپ 7 H:157O را در نمونه‌های غذایی داشته است (36). Simoska  و همکاران در سال 2019 نیز یک حسگر ایمونولوژیکی الکتروشیمیایی ساختند که از احیای نمک‌های فروسیانید پتاسیوم با ظرفیت 3 و 4 با روش امپدانس (EIS) جهت تشخیص باکتری اشریشیاکلای استفاده می‌کرد. حسگر طراحی‌شده آن‌ها هیچ‌گونه پاسخ خاصی به باکتری‌های استافیلوکوکوس آلبوس، استافیلو کوکوس اورئوس، لاکتوباسیلوس کازئی و شیگلا فلکسنری  نداشت. حد تشخیص آن نیز حدود CFU/ml 100 در رنج102× 3 تا CFU/ml 108× 3  بوده است (37). 

 از جنبه‌های دیگر نوآوری در این تحقیق طراحی منحصربه‌فرد آرایش GCE/ MWCNTs/ Au NPs/PAb E. coli/ BSA است که برای اولین بار به تشخیص و بررسی میزان باکتری اشرشیاکلای در نمونه‌های دارویی اعم از مواد اولیه، شربت ، آمپول سیتی کولین و نمونه‌های واقعی آب اعم از آب خالص، آب قابل تزریق و آب شرب کمک قابل‌توجهی نماید. از نکات قابل‌ذکر حجم پایین نمونه و زمان کمتر و عدم نیاز به پروسه کشت جهت انجام آزمایش، هزینه آزمون کمتر و تعداد نمونه کمتر که به‌عنوان معضلی در بحث نمونه‌های گران‌قیمت و یا با حجم تولید کم مطرح است می‌باشد.

 در مباحث پایش در صنعت دارو می‌توان با بررسی آلودگی مواد اولیه و آب قبل از فرآیند ساخت محصول و همچنین آلودگی محصول قبل از فرآیند پرکردن به‌واسطه انجام آزمایش‌های سریع تشخیصی و اطلاع از میزان بار میکروبی نمونه از انتشار بسیاری از آلودگی‌ها و هدر رفت هزینه‌های بیشتر جلوگیری نمود. طراحی حسگرهای زیستی ازاین‌دست درزمینه آزمایش‌های پایش میکروبی آب و شاخص بودن باکتری اشریشیاکلای در این مورد و همچنین بررسی پروسه تمیزکاری تانک‌های تهیه در صنعت دارو می‌توان کمک قابل‌توجهی در کم نمودن نشر آلودگی‌ها و رفع آن ایفا نماید. باتوجه‌به زمان‌بر بودن آزمایش‌ها کنترل میکروبی این اقلام (در حدود 5 تا 7 روز) امکان آزمون‌های میکروبی آنلاین برای این موارد با روش‌های مرسوم وجود نداشته و روش‌های نوین و سریع حسگر زیستی طراحی‌شده مکمل بسیار مناسب در حل این مشکل است. با استفاده از این حسگر زیستی می‌توان در کمتر از 3 دقیقه بررسی ماده موردنظر را انجام و برای تائید اولیه آن برای فرآیند ساخت بهره برد.

نتیجه‌گیری

از حسگر طراحی‌شده می‌توان جهت آزمون‌های مربوط به پایش های محیطی از قبیل پایش هوا و سطوح اتاق‌ها ، بررسی آلودگی در صنایع غذایی و آزمایش‌ها تشخیصی بیمارستانی بعد از انجام مراحل معتبر سازی استفاده کرد. به‌طورمعمول کارایی حسگر زیستی با اسکن متعدد در رقت‌های متعدد باکتری اشریشیاکلای کم می‌شود لذا پیشنهاد می‌گردد برای آزمایش از حسگرهای تازه ساخته‌شده در بررسی آزمون استفاده گردد تا نتایج با خطای پایین‌تر باشد. همچنین ازآنجاکه این حسگر زیستی جهت  نمونه دارویی مورد آزمایش قرار گرفت، از این حسگر می توان جهت بررسی باکتری اشریشیاکلای  در سایر محصولات دارویی با در نظر گرفتن فرآیند معتبر سازی استفاده کرد.

ملاحظات اخلاقی

نویسندگان این مقاله پژوهشی تمامی نکات اخلاقی شامل عدم سرقت ادبی، انتشار دوگانه، تحریف داده‌ها و داده سازی را در این مقاله رعایت کرده‌اند.

 تشکر و قدردانی

 امکانات پژوهشی این تحقیق توسط مجموعه شرکت داروسازی البرز دارو واقع در شهر قزوین فراهم آمد بدینوسیله از این مجموعه تقدیر می‌شود.

تعارض منافع

وجود ندارد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع:

1.       Gavriep. Escherichia coli 2023 [Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli.

2.       Ahmed A, Rushworth JV, Hirst NA, Millner PA. Biosensors for whole-cell bacterial detection. Clinical microbiology reviews. 2014;27(3):631-46.

3.       Ivnitski D, Abdel-Hamid I, Atanasov P, Wilkins E. Biosensors for detection of pathogenic bacteria. Biosensors and Bioelectronics. 1999;14(7):599-624.

4.       Bhardwaj T. A review on immobilization techniques of biosensors. International Journal of Engineering Research. 2014;3(5).

5.       Sandle T. Approaching the Selection of Rapid Microbiological Methods. Journal of Validation Technology. 2014;20(2):1-10.

6.       Thostenson ET, Ren Z, Chou T-W. Advances in the science and technology of carbon nanotubes and their composites: a review. Composites science and technology. 2001;61(13):1899-912.

7.       Wang J. Nanomaterial-based electrochemical biosensors. Analyst. 2005;130(4):421-6.

8.       Wei B, Vajtai R, Ajayan P. Reliability and current carrying capacity of carbon nanotubes. Applied physics letters. 2001;79(8):1172-4.

9.       Xia Y, Yang P, Sun Y, Wu Y, Mayers B, Gates B, et al. One‐dimensional nanostructures: synthesis, characterization, and applications. Advanced materials. 2003;15(5):353-89.

10.       Liu C, Yu Z, Neff D, Zhamu A, Jang BZ. Graphene-based supercapacitor with an ultrahigh energy density. Nano letters. 2010;10(12):4863-8.

11.       Pandey A, Gurbuz Y, Ozguz V, Niazi JH, Qureshi A. Graphene-interfaced electrical biosensor for label-free and sensitive detection of foodborne pathogenic E. coli O157: H7. Biosensors and Bioelectronics. 2017;91:225-31.

12.       Ozkan-Ariksoysal D, Kayran YU, Yilmaz FF, Ciucu AA, David IG, David V, et al. DNA-wrapped multi-walled carbon nanotube modified electrochemical biosensor for the detection of Escherichia coli from real samples. Talanta. 2017;166:27-35.

13.       Zheng L, Cai G, Wang S, Liao M, Li Y, Lin J. A microfluidic colorimetric biosensor for rapid detection of Escherichia coli O157: H7 using gold nanoparticle aggregation and smart phone imaging. Biosensors and Bioelectronics. 2019;124:143-9.

14.       Meraat R, Issazadeh K, Abdolahzadeh Ziabari A, Faezi Ghasemi M. Rapid Detection of Escherichia coli by β-Galactosidase Biosensor Based on ZnO NPs and MWCNTs: A Comparative Study. Current Microbiology. 2020;77(10):2633-41.

15.       Vu QK, Tran QH, Vu NP, Anh T-L, Le Dang TT, Matteo T, et al. A label-free electrochemical biosensor based on screen-printed electrodes modified with gold nanoparticles for quick detection of bacterial pathogens. Materials Today Communications. 2021;26:101726.

16.       Ertaş T, Dinç B, Üstünsoy R, Eraslan H, Ergenç AF, Bektaş M. Novel electrochemical biosensor for Escherichia coli using gold-coated tungsten wires and antibody functionalized short multiwalled carbon nanotubes. Instrumentation Science & Technology. 2023:1-16.

17.       Salmani H, Azarnezhad A, Fayazi MR, Hosseini A. Pathotypic and phylogenetic study of diarrheagenic Escherichia coli and uropathogenic E. coli using multiplex polymerase chain reaction. Jundishapur journal of microbiology. 2016;9(2).

18.       Convention USP. USP 44 NF 39: United States Pharmacopeia [and] National Formulary. Reissue. Supplement 2. a: United States Pharmacopeial Convention; 2021. <61>,<2>,<1111>,<6>,<231> p.

19.       Assari P, Rafati AA, Feizollahi A, Asadpour Joghani R. An electrochemical immunosensor for the prostate specific antigen based on the use of reduced graphene oxide decorated with gold nanoparticles. Microchimica Acta. 2019;186(7):1-9.

20.       Iwunze MO. Electrooxidation of Ferrocene in Nano-emulsion. J Chem. 2020;14:37-48.

21.       Bhardwaj J, Devarakonda S, Kumar S, Jang J. Development of a paper-based electrochemical immunosensor using an antibody-single walled carbon nanotubes bio-conjugate modified electrode for label-free detection of foodborne pathogens. Sensors and Actuators B: Chemical. 2017;253:115-23.

22.       Gad SC. Pharmaceutical manufacturing handbook: production and processes: John Wiley & Sons; 2008.

23.       Pal S, Basak S, Roy S, Roy D, Palchoudhuri S, Dastidar SG. Experimental evaluation of practical viability of Good Manufacturing Practice (GMP) in preparation of oral liquid formulations in small scale pharmaceutical industries. European Journal of Pharmacy and Medical Research. 2016;3(4):403-7.

24.       Zhao Y-W, Wang H-X, Jia G-C, Li Z. Application of aptamer-based biosensor for rapid detection of pathogenic Escherichia coli. Sensors. 2018;18(8):2518.

25.       Ivanov AV, Safenkova IV, Drenova NV, Zherdev AV, Dzantiev BB. Comparison of Biosensing Methods Based on Different Isothermal Amplification Strategies: A Case Study with Erwinia amylovora. Biosensors. 2022;12(12):1174.

26.       Wu W, Nguyen BTT, Liu PY, Cai G, Feng S, Shi Y, et al. Single Escherichia coli bacteria detection using a chemiluminescence digital microwell array chip. Biosensors and Bioelectronics. 2022;215:114594.

27.       Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR journal. 2005;46(3):258-68.

28.       Pourmadadi M, Shayeh JS, Omidi M, Yazdian F, Alebouyeh M, Tayebi L. A glassy carbon electrode modified with reduced graphene oxide and gold nanoparticles for electrochemical aptasensing of lipopolysaccharides from Escherichia coli bacteria. Microchimica Acta. 2019;186(12):1-8.

29.       Liu J, Xu Y, Liu S, Yu S, Yu Z, Low SS. Application and progress of chemometrics in voltammetric biosensing. Biosensors. 2022;12(7):494.

30.       Cao Z, Li C, Yang X, Wang S, Zhang X, Zhao C, et al. Rapid Quantitative Detection of Live Escherichia coli Based on Chronoamperometry. Biosensors. 2022;12(10):845.

31.       El-Moghazy AY, Wisuthiphaet N, Yang X, Sun G, Nitin N. Electrochemical biosensor based on genetically engineered bacteriophage T7 for rapid detection of Escherichia coli on fresh produce. Food Control. 2022;135:108811.

32.       Razmi N, Hasanzadeh M, Willander M, Nur O. Recent progress on the electrochemical biosensing of Escherichia coli O157: H7: Material and methods overview. Biosensors. 2020;10(5):54.

33.       Pebdeni AB, Roshani A, Mirsadoughi E, Behzadifar S, Hosseini M. Recent advances in optical biosensors for specific detection of E. coli bacteria in food and water. Food Control. 2022:108822.

34.       Pourmadadi M, Shayeh JS, Omidi M, Yazdian F, Alebouyeh M, Tayebi L. A glassy carbon electrode modified with reduced graphene oxide and gold nanoparticles for electrochemical aptasensing of lipopolysaccharides from Escherichia coli bacteria. Microchimica Acta. 2019;186:1-8.

35.       Wang H, Zhao Y, Bie S, Suo T, Jia G, Liu B, et al. Development of an electrochemical biosensor for rapid and effective detection of pathogenic Escherichia coli in licorice extract. Applied Sciences. 2019;9(2):295.

36.       Li T, Zhu F, Guo W, Gu H, Zhao J, Yan M, et al. Selective capture and rapid identification of E. coli O157: H7 by carbon nanotube multilayer biosensors and microfluidic chip-based LAMP. RSC advances. 2017;7(48):30446-52.

37.       Simoska O, Stevenson KJ. Electrochemical sensors for rapid diagnosis of pathogens in real time. Analyst. 2019;144(22):6461-78.

 

---

[1]  Escherichia coli

[2]  Salmonella enterica

[3]  Pseudomonas aeruginosa  

[4]  Bacillus spizizenii

[5]  Staphylococcus aureus

[6]  N-hydroxy succinimide/ 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride

[7]  Square-Wave Voltametric

[8]  Cyclic voltammetry

[9]  Differential pulse voltammetry

 

[10]  Iron (III) ferrocyanide

 

[11]  Potassium ferricyanide (III)/Potassium hexacyanoferrate (II)

---