اثرات عصاره گیاه پنج انگشت بر بافت تخمدان و هورمون های جنسی موش های مدل POF

الموضوعات :

کیانا قربانی ¹ , سیده فاطمه سیادت ² , روح الله فتحی ³ , فاطمه عابدی قهی ⁴

1 - گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی
2 - گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - گروه جنین شناسی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولید مثل، پژوهشگاه رویان.
4 - گروه جنین شناسی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، پژوهشکده زیستشناسی و علوم پزشکی تولید مثل، پژوهشگاه رویان.

تاريخ الإرسال : 20 الجمعة , ذو القعدة, 1444 تاريخ التأكيد : 18 السبت , محرم, 1445 تاريخ الإصدار : 12 الإثنين , ذو القعدة, 1445

الکلمات المفتاحية: گیاه پنج انگشت, سیکلوفسفامید, نارسایی زودرس تخمدان,

ملخص المقالة :

نارسایی زودرس تخمدان (POF) به عنوان یک اختلال هتروژن که به آمنوره و نارسایی تخمدان قبل از سن 40 سال منجر می شود، شناخته شده و باعث ناباروری در زنان جوان می شود. گیاه پنج انگشت به طور سنتی برای درمان مشکلات هورمونی زنان استفاده می شود. این مطالعه جهت بررسی اولیه اثر عصاره میوه این گیاه بر عملکرد تخمدان و وزن بدن موش بعد از القای POF در موش ها انجام گردید. در این مطالعه 50 سر موش به پنج گروه 10 تایی شامل گروه کنترل، POF و سه گروه تجربی ( ایجاد مدل POF و گاواژ عصاره گیاه پنج انگشت) تقسیم شدند. بعد از تاثیر عصاره، بافت تخمدان با رنگامیزی هماتوکسیلین_ائوزین مورد مطالعه قرار گرفت و شمارش فولیکولی و بررسی سطح سرمی انجام گردید. نتایج نشان داد تعداد فولیکول ها، جسم زرد، و وزن بدن موش ها در گروه POF کاهش معناداری داشتند. همچنین سطح سرمی هورمون های FSH نیز در گروه POF افزایش و هورمون E2 کاهش معناداری نسبت به گروه کنترل داشتند (p<0.05) که نشان دهنده ایجاد درست مدل POF است. بعد از خوراندن عصاره گیاه پنج انگشت در مدل های موشی POF شده سطح سرمی هورمون ها تعدیل و افزایش در تعداد فولیکول های تخمدانی مشاهده گردید. نتایج نشان داد که داروی سیکلوفسفامید می تواند مدل POF را به خوبی در موش القا کند و عصاره گیاه پنج انگشت اثرات مثبتی بر وضعیت فولیکول ها، وزن بدن و هورمون های جنسی موش دارد.

نص كامل:



 

اثر عصاره گیاه پنج انگشت بر بافت تخمدان و هورمون های جنسی موش های مدل POF

 

کیانا قربانی¹، سیده فاطمه سیادت*²، روح الله فتحی³، فاطمه عابدی3

1) گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2) گروه زیست شناسی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3)گروه جنین شناسی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل،پژوهشکده رویان، تهران، ایران

*نویسنده مسئول:[e-mail]

 

چکیده

نارسایی زودرس تخمدان (POF) به عنوان یک اختلال هتروژن که به آمنوره و نارسایی تخمدان قبل از سن 40 سال منجر می شود، شناخته شده و باعث ناباروری در زنان جوان می شود. گیاه پنج انگشت به طور سنتی برای درمان مشکلات هورمونی زنان استفاده می شود. این مطالعه جهت بررسی اولیه اثر عصاره میوه این گیاه بر عملکرد تخمدان و وزن بدن موش بعد از القای POF در موش ها انجام گردید. در این مطالعه 50 سر موش به پنج گروه 10 تایی شامل گروه کنترل، POF و سه گروه تجربی ( ایجاد مدل POF و گاواژ عصاره گیاه پنج انگشت) تقسیم شدند. بعد از تاثیر عصاره، بافت تخمدان با رنگامیزی هماتوکسیلین_ائوزین مورد مطالعه قرار گرفت و شمارش فولیکولی و بررسی سطح سرمی انجام گردید. نتایج نشان داد تعداد فولیکول ها، جسم زرد، و وزن بدن موش ها در گروه POF کاهش معناداری داشتند. همچنین سطح سرمی هورمون های FSH نیز در گروه POF افزایش و هورمون E2 کاهش معناداری نسبت به گروه کنترل داشتند (p<0.05) که نشان دهنده ایجاد درست مدل POF است. بعد از خوراندن عصاره گیاه پنج انگشت در مدل های موشی POF شده سطح سرمی هورمون ها تعدیل و افزایش در تعداد فولیکول های تخمدانی مشاهده گردید. نتایج نشان داد که داروی سیکلوفسفامید می تواند مدل POF را به خوبی در موش القا کند و عصاره گیاه پنج انگشت اثرات مثبتی بر وضعیت فولیکول ها، وزن بدن و هورمون های جنسی موش دارد.

کلید واژه: نارسایی زودرس تخمدان، ،گیاه پنج انگشت، تخمدان، سیکلوفسفامید.

مقدمه :

نارسایی زودرس تخمدان(POF⁴) که به عنوان یائسگی زودرس نیز شناخته می‌شود، یک بیماری شایع است که 1 تا 2 درصد از زنان زیر ۴۰ سال و 1/0 درصد زنان زیر ۳۰ سال را تحت ‌تأثیر قرار می‌دهد. ویژگی‌های POF شامل آمنوره هیپواستروژنیسم و سطوح بالای گنادوتروپین  در زنان زیر 40 سال است. علل این بیماری تا حد زیادی ناشناخته هستند. زنان مبتلا به POF علایم یائسگی مانند گرگرفتگی، عرق شبانه و خشکی واژن را تجربه می‌کنند که مشابه با یائسگی طبیعی است. بسیاری از اختلالات که سلامتی و رفاه ما را تحت‌تاثیر قرار می‌دهند، اغلب پایه ی ژنتیکی دارند[1]. علاوه بر وراثت[2, 3]، علل اتوایمیون [4]، تخریب فولیکول ها در پی عفونت، عوامل ایاتروژنیک [5]، سابقه هیستروکتومی و عوامل محیطی مانند شیوه زندگی، مصرف سیگار و ارتفاع از سایر عوامل دخیل در ایجاد POF معرفی شده اند. نارسایی زودرس تخمدان  POFیک اختلال هتروژن است که به عنوان توقف عملکرد تخمدانی، همراه با افزایش هورمون تحریک‌کننده فولیکول (FSH)و کاهش سطح استروژن (E2) در زنان زیر ۴۰ سال تعریف می‌شود. آتروفی تخمدان، کاهش ذخایر فولیکول، اختلالات سیکل قاعدگی و اختلال عملکرد تخمدان از مهم‌ترین ویژگی‌های   POF  است [6]. گیاه ویتکس⁵ یا درخت عفیف⁶ از خانواده شاه پسند یکی از مهمترین گیاهانی است که اثرات مفید آن در درمان برخی از بیماري هاي زنان گزارش شده است [7]. این گیاه بومی نواحی مرکزي آسیا بوده که امروزه پراکندگی فراوانی در نقاط جنوبی و گرم اروپا، منطقه مدیترانه، مناطق گرم ایالات متحده و نواحی دیگردارد[8]. این گیاه به طور سنتی براي درمان بی نظمی هاي قاعدگی و به طور خاص براي کمک به ایجاد سیکل طبیعی قاعدگی و همچنین بهبود باروري استفاده می شده است [9]. گیاه پنج انگشت محتوي هورمون نیست، ولی با اثر بر غده هیپوفیز، بویژه بر تنظیم ترشح هورمون LH فعالیت هورمونی نشان می دهد [10]. در مطالعات انسانی اثربخشی گیاه پنج انگشت در درمان بسیاری از بیماری های زنان همچون سندرم پیش از قاعدگی [11]، خونریزی نامنظم قائدگی، هایپرولاکتیمنی، دیسمینوره وبهبود علائم یائسگی [12] مشاهده شده و بی خطر و قابل تحمل بودن آن در نمونه انسانی در مطالعات گزارش شده است [13, 14] عقیده بر این است که فلاونئیدها و ساپونین با افزایش آزادسازی نیتریک اکساید و اندوتلیوم منوفسفات حلقوی [15, 16] باعث افزایش خون رسانی، بهبود کارکرد سیستم تناسلی، افزایش LH و افزایش تستوسترون می گردد [17]. مطالعات اندکی در زمینه تاثیر پنج انگشت بر کارکرد جنسی در زنان یائسه انجام شده است [18, 19] ، اما هنوز اثر بخشی آن در سنین باروری نامعلوم است. با توجه به کاهش هورمون های استروئیدی در زنان یائسه، شرایط جسمی متفاوتی به خاطر علائم یائسگی دارند که به کارکرد جنسی آنان تاثیر گذار است و فیتواستروژن ها با رفع این مشکلات می توانند کارکرد جنسی این گروه را بهبود ببخشند [20]. در تحقيق حاضر هدف، بررسی  پتانسیل داروی سیکلوفسفامید به عنوان داروی ایجاد کننده مدل موشی POF و اثرعصاره گیاه پنج انگشت بر روی هورمون های جنسی و بافت تخمدان موش هایی است که به طور مصنوعی دچار POF شده اند (مدل POF).

مواد و‌روش ها:

این مطالعه به صورت تجربی و بر روی 50 سر موش بالغ ماده نژاد NMRI  (سن 8 تا 10 هفته و با میانگین وزنی 5± 25 گرم) در 5 گروه 10 تایی انجام گردید. موش ها در آزمایشگاه بخش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم و تحقیقات با شرایط نگهداری مناسب ( 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و دمای 20 تا 25 درجه سانتی گراد) نگهداری شدند. سیکل جنسی موش ها با تهیه اسمیر واژنی تعیین شده و موش هایی که سیکل منظمی داشتند برای کار انتخاب شدند. موش ها به پنج گروه تقسیم شدند. گروه کنترل، تحت هیچ درمانی قرار نگرفتند و فقط آب و غذا دریافت کردند. گروه POF ، به مدت 12 روز داروی شیمی درمانی سیکوفسفامید ( 100 میلی گرم/کیلوگرم)  به صورت تزریقی دریافت کردند و سه گروه تجربی. که ابتدا با تزریق سیکلوفسفامید مدل POF  در آنها القا شد، سپس سه دوز از عصاره گیاه پنج انگشت ( 100، 300 و 500 میلی گرم/ کیلوگرم) به آنها خورانده (گاواژ) شد.

تهیه عصاره گیاهی:

 برای تهیه عصاره گیاه از میوه خشک شده گیاه پنج انگشت استفاده شد.  میوه آسیاب شده داخل مخزنی ریخته و سپس حلال هیدروالکلی 80 % اتانولی را به شکلی که روی پودر را کاملا بپوشاند ریخته شد و به مدت 72 ساعت به طور مرتب میکس شد و سپس مخلوط گیاه و عصاره را صاف و عصاره به دست آمده برای استفاده مجدداً فیلتر شد واین کار یک بار دیگر نیز بر روی پودر خیس شده گیاه انجام شد. عصاره جمع آوری و توسط دستگاه روتاری بخش اعظم حلال آن تبخیر شد و مابقی عصاره درون ظرفی ریخته و زیر هود و محیطی عاری از میکروب قرار داده شد تا حلال کاملا تبخیر شود و عصاره خشک شده باقی بماند.

ایجاد مدل موشی POF :

برای ایجاد مدل POF به مدت 12 روز دوز 100 میلی گرم بر کیلوگرم از داروی سیکلوفسفامید (CTX) به موش ها تزریق گردید. برای اطمینان از تشکیل مدل POF چرخه استروس آن ها بررسی شد و همچنین خون گیری از قلب انجام شد و ارزیابی هورمون انجام گردید [21]. بعد از تایید انجام شدن مدل POF، موش های گروه تجربی به سه گروه تقسیم شدند و به گروه اول دوز 100 میلی گرم/کیلوگرم  و به گروه دوم  دوز300 میلی گرم/کیلوگرم  و به گروه سوم دوز 500 میلی گرم/کیلوگرم از عصاره گیاه پنج انگشت خورانده شد. 

خونگیری از قلب:

 خون گیری از قلب طبق روش آسپیره کردن از ناحیه قفسه سینه انجام شد. با استفاده از سانتریفیوژ جداسازی سرم صورت گرفت و برای ارزیابی های هورمونی در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری  شدند.

 

 

تهیه نمونه اسمیر از واژن موش:

 قبل از تزریق داروی شیمی درمانی اسمیر واژن از حیوانات گرفته شد. به این ترتیب که به کمک سر سمپلر استریل، 50 میکرولیتر نرمال سالین 9/0 % به داخل واژن موش ها به آرامی تزریق و بعد از سه بار پیپتاژ، نمونه ها روی لام قرار داده شد و لامل روی آن ها قرار گرفت و در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. چرخه استروس در موش ها 4 تا 5 روز به طول می انجامد و شامل 4 مرحله پرواستروس، استروس، مت استروس، دی استروس هستند. چرخه تولید مثلی هر موش به صورت روزانه قبل و بعد از تزریق مورد بررسی قرار گرفت.

ارزیابی های بافت شناسی :

برای بررسی بافتی، تخمدان ها در همه گروهها، در محلول فرمالدئید 4% تثبیت شدند و طی فرآیند بافت شناسی، تحت آبگیری قرارگرفته و به وسیله پارافین مایع قالب گیری شدند. سپس قالب های بافت تخمدان با ضخامت 5 میکرومتر برش زده و روی لام قرار داده شد. قطعات بافت تخمدان با روش هماتوکسلین ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شده و ساختار و تعداد فولیکول ها زیر میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتند. برای جلوگیری از شمارش فولیکول بیش از یک بار، مشاهده هسته تخمک در هر فولیکول به عنوان شاخص شمارش در نظر گرفته شد. برای بررسی مورفولوژی فولیکول ها از بزرگنمایی 40 و 100 ، همچنین برای شمارش فولیکول ها از بزرگنمایی 40 استفاده شد. فولیکول هایی سالم در نظر گرفته شدند که دارای سلول های گرانولوزای فعال ورنگ پذیری طبیعی بودند و به صورت فشرده درکنار هم قرارگرفته و به تخمک با سیتوپلاسم شفاف، اتصال داشتند و به ندرت سلولهای گرانولوزای جداشده با هسته پیکنوتیک در آنها دیده میشد. فولیکول هایی مرده در نظر گرفته شدند که سیتوپلاسم تخمک تیره و چروکیده شده و سلول های گرانولوزای آنها دارای هسته های پیکنوتیک بودند. فولیکول های تخمدان بدین ترتیب طبقه بندی شدند: فولیکول بدوی که تخمک در آن فاقد زوناپلوسیدا و توسط یک لایه سلول های پهن سنگفرشی احاطه شده بود فولیکول پرایمری، تخمک به وسیله یک لایه از سلولهای گرانولوزای مکعبی شکل احاطه شده بود. در فولیکول پرآنترال، تخمک ها به وسیله دو یا چندلایه از سلول های گرانولوزا احاطه شده بودند و درمورد فولیکول آنترال تخمک ها به وسیله دو لایه یا بیشتر از سلول های گرانولوزا همراه با حفره آنتروم احاطه شده بودند .

اندازه گیری هورمون استرادیول  و FSH :

پس از اتمام تزریق و تیمار، حیوانات بیهوش شده و خونگیری از قلب به منظور تهیه سرم و اندازه گیری هورمون های استرادیول و FSH انجام شد. خون را داخل لوله آزمایش ریخته و مدت 20 دقیقه داخل دستگاه سانتریفیوژ قرار داده و سپس سرم جدا شده را به میکروتیوپ انتقال داده و آن را داخل فریزر با دمای -80 درجه سانتی گراد تا زمان بررسی هورمونی قرار داده شد. اندازه گیری هورمونی بر اساس روش های معمول آزمایشگاهی یعنی با استفاده از روش⁷ RIA انجام گرفت. 

آنالیز آماری:

محاسبات آماری برای بررسی اختلاف معنی دار بین گروه های تجربی و کنترل با استفاده از آزمون(ANOVA) و به دنبال آن آزمون تکمیلی Tukey انجام گرفت. مرز استنتاج آماری نتایج P≤0.05 در نظر گرفته شد. نمودارها بر اساس اظلاعات حاصله با استفاده از نرم افزار Excel رسم گردید.

یافته ها:

یافته های بررسی تغییرات وزن موش قبل و بعد از تزریق داروهای شیمی درمانی:   

وزن موش های گروه POF نسبت به گروه کنترل کاهش معناداری داشته است و گاواژ گیاه پنج انگشت در دوز های (100،300،500 میلی گرم/کیلوگرم) به موش های تجربی باعث افزایش وزن نسبت به گروه POF  شده است هرچند که این افزایش وزن نسبت به گروه کنترل کمتر است (P≤0/05) (نمودار1).

 

بررسی چرخه استروس :

چرخه استروس موش ها قبل و بعد از تزریق سیکلوفسفامید بررسی شد. قبل از تزریق چرخه استروس کامل و منظم و هر چهار مرحله مشاهده شد. بعد از تزریق، چرخه استروس نامنظم مشاهده شد و مرحله استروس و پرواستروس طولانی تر شدند.

ارزیابی بافت تخمدان :

فولیکول های زنده و مرده در مراحل مختلف رشد و نمو هر گروه آزمایشی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از شمارش فولیکول ها حاکی از کاهش معنی دار (P≤0/05) ذخیره کل فولیکول ها در تمام گروه های آزمایشی نسبت به گروه کنترل بود، بدین ترتیب که تعداد فولیکول بدوی، فولیکول ثانویه، فولیکول آنترال و فولیکول گرآف، در گروه POF کاهش معنادار(P≤0/05) نسبت به گروه کنترل داشت و درصد فولیکولهای آترتیک افزایش داشتند. تمام دوزهای استفاده شده گیاه پنج انگشت باعث افزایش تعداد فولیکول ها نسبت به گروه POF شده  است اما در دوز 500 میلی گرم/کیلوگرم، تعداد فولیکول های زنده و سالم نسبت به دوزهای 100و300 میلی گرم/کیلوگرم افزایش معنی داری نسبت به گروه POF داشتند، همچنین در این دوز درصد فولیکولهای آترتیک کاهش معناداری نسبت به گروه POF داشتند (شکل1)(نمودار2).

 

ارزیابی هورمون های استرادیول و FSH :

 نتایج حاصل از ارزیابی هورمون استرادیول در گروه POF نسبت به گروه کنترل کاهش معنادار داشته و دوز300 و100 از گیاه میزان E2 سرم تفاوتی با گروه POF نکرده است اما دوز500 از گیاه پنج انگشت افزایش میزان E2 سرم را نسبت به گروه POF را مشاهده می کنیم (P≤0/05). همچنین میزان هورمون FSH در گروه POF نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار داشته و در دوز 100 از گیاه میزان FSH سرم تفاوتی با گروه POF نداشت اما با گاواژ دوز 300 و 500 از گیاه پنج انگشت، در میزان FSH سرم نسبت به گروه POF کاهش معنی داری (P≤0/05) مشاهده شد (نمودار3).

 

 

AF

 

F

F

 

AF

 

CL

 

F

 

 

F

AF

 

AFAF

 

F

 

 

AF

 

CL

 

F

CL

 

 

شکل1: ارزیابی مورفولوژیکی بافت تخدان با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، الف) گروه کنترل، ب) گروه اول: تزریق دوز 100 میلی گرم/کیلوگرم سیکلوفسفامید به مدت 12 روز و القاء مدل POF، پ) گروه دوم: موش های POF شده و درمان شده با دوز 100 میلی گرم/ کیلوگرم گیاه پنج انگشت، ت) موش های POF شده و درمان شده با دوز 300 میلی گرم/ کیلوگرم گیاه پنج انگشت، ث) موش های POF شده و درمان شده با دوز 500 میلی گرم/ کیلوگرم گیاه پنج انگشت. فولیکول(F)، فولیکول تحلیل یافته (AF)، جسم زرد(CL).

 

 

 

 

نمودار1: مقایسه میانگین تغییرات وزن بدن  موش

حروف نامتشابه نشانگر اختلاف معنی دار است

 

 

 

a

c

 

 

 

 

 

نمودار2: تاثیر داروی سیکلوفسفامید و گیاه پنج انگشت روی مراحل مختلف رشد فولیکول ها. انواع فولیکول ها در تمام گروه ها شمارش شدند و به گروه های مختلف فولیکول بدوی، پرایمری، پرآنترال ، آنترال، جسم زرد طبقه بندی شدند. گروه 1: دوز 100 میلی گرم/گیلوگرم از گیاه پنج انگشت. گروه2: دوز300 میلی گرم/گیلوگرم از گیاه پنج انگشت. گروه 3: دوز 500 میلی گرم/گیلوگرم از گیاه پنج انگشت. گروه 4: تزریق 100 میلی گرم/گیلوگرم سیکلوفسفامید. گروه5: گروه کنترل. حروف  نامتشابه بالای ستونها  اختلاف معنی دار  (P≤0/05) بین گروهها را نشان می دهند.

 

 

 

 

نمودار3: نتایج تاثیر داروی سیکلوفسفامید (بعد از دوازده روز تزریق)  وگیاه پنج انگشت بر ترشح هورمون های استرادیول و FSH در گروهها. حروف نامتشابه بالای ستون ها اختلاف معنی دار  (P≤0/05) بین گروهها را نشان می دهند.

 

 

بحث:

پیشرفت‌های زیادی در زمینه درمان سرطان صورت ‌گرفته است در حالی که ظهور عوامل شیمی‌درمانی امید به زندگی بیمارانی که با سرطان سر و کار دارند را افزایش داده‌است [22]. از سوی دیگر، آسیب ناشی از شیمی‌درمانی به تخمدان نگرانی‌های زیادی را ایجاد کرده‌است زیرا اثرات جانبی پرتو درمانی یا شیمی‌درمانی بر روی سلول‌های تخمدان عموما غیرقابل‌برگشت هستند[23]. بعضی از درمان های موجود برای بیماران مبتلا به سرطان، مثل شیمی درمانی می تواند ذخیره تخمدانی را از بین ببرد، بنابراین منجر به نارسایی تخمدان و ناباروری می شود[24].  زمانی که سلول های تخمدانی در معرض سیکلوفسفامید قرار می گیرند، آپوپتوزیز به عنوان یکی از مکانیسم های دخیل در از دست دادن فولیکول در نظر گرفته می شود[25]. مطالعات پیشنهاد می‌کنند که سیکلوفسفامید قادر به القای آپوپتوز از طریق تولید بیش از حد ROS و ایجاد استرس اکسیداتیو در سلول‌های تخمدان است و آن‌ها را تحریک می‌کند تا تحت مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول قرار بگیرند[24]. سیکلوفسفامید موجب نابودي فولیکول هاي مقدماتی شده و به علت کاهش ذخیره فولیکولی، تأثیر منفی روي سیستم تولید مثلی داشته وموجب ناباروري و یائسگی زودرس در جنس ماده می شود، می شود[26]. . تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده است که اثر سیکلوفسفامید در جنس ماده و توان باروري آن به زمان ومرحله رشد فولیکول ها بستگی دارد و با توجه به اینکه مدت زمان رشد و تکامل یک فولیکول در موش سوري حدوداً سه هفته طول می کشد، فولیکول هایی که در مرحله پیش حفره ایی و یا حفره ایی در معرض سیکلوفسفامید واقع می شوند، چگونگی تحلیل رفتن آنها متفاوت می باشد[27]. نتایج دن سانگ  و همکارانش در سال 2016 نشان داد  که تعداد فولیکولهای ثانویه در گروه درمانی CTX به طور معنی داری کاهش یافته است ، اما از نظر تعداد فولیکول ها در سایر مراحل بین گروه CTX و گروه کنترل تفاوت معنی داری مشاهده نشده است[6] مطالعات چن و همکارانش در سال 2016 نشان داد که، تخمدان ها بیشتر از اووسیت های تخریب شده و تعداد فولیکول های کاهش یافته، به ویژه فولیکول های اولیه در تخمدان های تحت درمان با CTX تشکیل شده بودند[28]. نارسایی تخمدان با اندازه گیری سطح هورمون در خون تشخیص داده می شود و از لحاظ بیوشیمیایی با سطح پایین استروژن و سطح بالای FSH  مشخص می شود[29] این هورمون ها شاخص های اولیه و مهم برای تشخیص نارسایی زودرس تخمدان هستند[30]. البته سطح و میزان هورمون در خون بسیار حائز اهمیت بوده، همچنین نوع و غلظت داروی شیمی درمانی مورد استفاده نیز در میزان شدت اختلال موثر است. گیاه پنج انگشت  (Vitex agnus castus) از خانواده شاه پسند یکی از مهمترین گیاهانی است که اثرات مفید آن در درمان برخی از بیماري هاي زنان گزارش شده است[7]. اسيد لينولئيک جدا شده از عصاره ميوه اين گياه مي تواند به گيرنده هاي استروژن متصل و عملکرد شبيه به استروژن ايجاد کند از سوي ديگر به گيرنده هاي دوپاميني متصل و سطح پرولاکتين را کاهش مي دهد[31, 32]. گیاه پنج انگشت سبب افزایش تعداد فولیكول های پری آنتررال، آنترال و جسم زرد، کاهش تعداد فولیكول های کیستي، کاهش ضخامت تونیكا آلبوژینای تخمدان، کاهش ضخامت لایه تكا و افزایش ضخامت لایه گرانولروزا در فولیكول های آنترال مي شود[33]. عصاره گیاه پنج انگشت در کاهش علائم سندروم پیش قاعدگي موثر است[34] و از سقط جنین جلوگیری مي کند و دارای اثرات مهمي در دوران مختلف بارداری بر تكامل جنین در حیواناتي نظیرموش (افزایش وزن و رشد) می باشد[35]. در این مطالعه برای اولین بار تاثیر گیاه پنج انگشت بر بافت تخمدان و میزان هورمون ها در مدلهای موشی POf بررسی شد و نتایج ما نشان داد که این گیاه سطح هورمون های سرم را تغییر می دهد.          تا کنون مطالعه ای که تاثیر این گیاه را بر بیماری POF بررسی کند انجام نشده است. البته اثر این گیاه بر PCOS [36]  مورد بررسی قرار گرفته است و نشان می دهد که در گروه PCOS  در مقایسه با گروه کنترل، FSH، سطح پروژسترون و استرادیول کاهش یافته، در حالی که سطح تستوسترون و LH به طور قابل توجهی افزایش یافته است. درمان با گیاه پنج انگشت در گروه PCOS، منجر به افزایش سطح پروژسترون، استروژن و FSH و کاهش سطح تستوسترون و LH شده است. در سندروم تخمدان پلی کیستیک ترشح هورمون های جنسی دچار اختلال شده است که باعث عدم تخمک گذاری و اختلال در باروری می شود و درمان با گیاه پنج انگشت در این سندروم باعث تعادل هورمون های جنسی و بهبود در بارداری شده است[37]. مطالعات ما نشان داد که درمان با CTX سطح هورمون های سرم را تغییر می دهد. سطح سرمی هورمون FSH افزایش و هورمون E2 در گروه درمانی CTX در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافته است. در تایید مطالعات انجام گرفته در این تحقیق که بر روي تخمدان موش هاي کوچک آزمایشگاهی ماده بالغ انجام شد مشاهده گردید که انواع فولیکول ها در موش هایی که تحت شیمی درمانی با سیکلوفسفامید بدون مکمل آنتی اکسیدانتی قرار گرفته بودند کاهش چشمگیري نشان دادند. تاثیر سیکلوفسفامید بر روي انواع فولیکول هاي تخمدانی بالا بوده و تا حد زیادي تعداد این فولیکول ها را کاهش داد. همچنین سیکلوفسفامید بر میزان تخمک گذاري و تشکیل جسم زرد اثر گذاشته و باعث کاهش معنی دار آن در مقایسه با گروه کنترل شد و سبب افزایش تعداد فولیکول هاي آترتیک در مراحل مختلف رشد نسبت به گروه کنترل گردید p<0/05)). برای تایید آشفتگی و بی نظمی چرخه جنسی موش، اسمیر واژینال تهیه شد و مشاهده شد هنگام تزریق سیکلوفسفامید چرخه استروس موش کاملا نامنظم و آشفته می شود. مطالعات ما نشان داد که عصاره گیاه پنج انگشت در دوز 500 میلی گرم/کیلوگرم باعث بهبود فولیکول ها و تخمدان های تحت درمان با سیکلوفسفامید می شود و همچنین سطح سرمی هورمون FSH افزایش و E2  هنگام استفاده از گیاه پنج انگشت (500 میلی گرم/کیلوگرم) کاهش می یابد و به گروه کنترل نزدیک می شود. وزن موش نیز هنگام آزمایش به طور مرتب اندازه گیری شد و نتیجه نشان داد که هنگام تزریق سیکلوفسفامید وزن بدن موش ها کاهش می یابد و در درمان با عصاره گیاه پنج انگشت (500 میلی گرم/کیلوگرم) وزن موش ها بهبود پیدا می کند و به گروه کنترل نزدیک تر می شود. 

 

 

 

نتیجه گیری:

یافته های این پژوهش حاکی از آن است که داروی سیکلوفسفامید به خوبی مدل موشی POF را القا می کند و در بالاترین دوز گیاه پنج انگشت تعدیل هورمونهای جنسی و افزایش تعداد فولیکولها و افزایش وزن موشها مشاهده می گردد. به نظر می رسد بررسی های مولکولی و هورمونی بیشتر و همچنین بیان ژن بهتر می تواند اثرات این گیاه را در درمان POF نشان دهد.

تقدیر و تشکر:

 

از آزمایشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات و همچنین از سرکار خانم فاطمه عابدی به پاس همراهی شان در این طرح تشکر و قدردانی می شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Effect of Chaste tree fruit extract on ovarian tissue and sex hormones of POF model mice

Abstract

Premature ovarian failure (POF) is known as a heterogeneous disorder that leads to amenorrhea and ovarian failure before the age of 40 and causes infertility in young women. Herbal Medicines is traditionally used to treat hormonal problems in women. This study was conducted to investigate the effect of Chaste tree fruit hydro alcoholic extract on ovarian function and body weight of mice after POF induction in mice. In this study, 50 mice were divided into five groups (n=10) including the vitex group, POF and three experimental groups (creating POF model and gavage of vitex extract). After the effect of the extract, the ovarian tissue was studied with hematoxylin-eosin staining, and follicular count and serum level were checked. The results showed that the number of follicles, corpus luteum, and body weight of mice in the POF group were significantly reduced. Also, the serum level of FSH hormones increased in the POF group and the E2 hormone decreased significantly compared to the control group (p<0.05), which indicates the correct creation of POF models. After gavage of extract in POF mouse models, the serum level of hormones was adjusted and the number of ovarian follicles increased. The results of the study showed that vitex extract in the highest tested dose has positive effects on the number of follicles, body weight and sex hormones of mice in premature ovarian failure syndrome.

 

Keywords: cyclophosphamide, herbal medicines, ovary, premature ovarian failure.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع:

 

        

1(        Shelling, A.N., Premature ovarian failure. Reproduction, 2010. 140(5): p. 633.

2(        Qin, Y., et al., NOBOX homeobox mutation causes premature ovarian failure. The American Journal of Human Genetics, 2007. 81(3): p. 576-581.

3(        Krauss, C.M., et al., Familial premature ovarian failure due to an interstitial deletion of the long arm of the X chromosome. New England Journal of Medicine, 1987. 317(3): p. 125-131.

4)        Altuntas, C.Z., J.M. Johnson, and V.K. Tuohy, Autoimmune targeted disruption of the pituitary-ovarian axis causes premature ovarian failure. The Journal of Immunology, 2006. 177(3): p. 1988-1996.

5)        Vegetti, W., et al., Premature ovarian failure. Molecular and Cellular Endocrinology, 2000. 161(1-2): p. 53-57.

6)        Song, D., et al., Human umbilical cord mesenchymal stem cells therapy in cyclophosphamide-induced premature ovarian failure rat model. BioMed Research International, 2016. 2016.

7)        Russo, M. and G.C. Galletti. Medicinal properties and chemical composition of Vitex agnus-castus L.: a review. in International Symposium on Medicinal and Aromatic Plants 426. 1995.

8)        Sørensen, J.M. and S.T. Katsiotis, Parameters influencing the yield and composition of the essential oil from Cretan Vitex agnus-castus fruits. Planta medica, 2000. 66(03): p. 245-250.

9)        Wuttke, W., et al., Chaste tree (Vitex agnus-castus)–pharmacology and clinical indications. Phytomedicine, 2003. 10(4): p. 348-357.

10)        Gerhard, I., et al., Gorkow. C., 1998. Mastodynon (R) bei weiblicher Sterilitat. Randomisierte, plazebokontrollierte, klinische Doppel-blindstudie. Forsch Komplementarmed: p. 5,272-278.

11)        Abdnejad, R. and M. Simbar, A review on herbal medicines effective of premenstrual syndrome in Iran. The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility, 2016. 19(11): p. 18-30.

12)        Sadeghi, T., A. Azimi, and M. Loripoor, Comparing the effect of black Cohosh versus Vitagnus on the impovement of menopause symptoms. The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility, 2019. 21(12): p. 1-10.

13)        Rani, A. and A. Sharma, The genus Vitex: a review. Pharmacogn rev 7: 188–198. 2013.

14)        van Die, M.D., et al., Vitex agnus-castus extracts for female reproductive disorders: a systematic review of clinical trials. Planta medica, 2013. 79(07): p. 562-575.

15)        Heuzé-Joubert, I., et al., Effect of vasodilators, including nitric oxide, on the release of cGMP and cAMP in the isolated perfused rat kidney. European journal of pharmacology, 1992. 220(2-3): p. 161-171.

16)        Durand, S., et al., Exogenous nitric oxide inhibits sympathetically mediated vasoconstriction in human skin. The Journal of physiology, 2005. 562(2): p. 629-634.

17)        Yosefzadeh, S., et al., The effect of date palm pollen capsule on orgasm and sexual satisfaction in menopausal women: a double-blind controlled clinical trial. The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility, 2017. 20(10): p. 43-51.

18)        Mirzaiinajmabdi, K., Effect of Vitex agnus-castus on sexual function in menopausal women. J Women's Health Care, 2016. 5(4).

19)        Lucks, B.C., J. Sørensen, and L. Veal, Vitex agnus-castus essential oil and menopausal balance: a self-care survey. Complementary Therapies in Nursing and Midwifery, 2002. 8(3): p. 148-154.

20)        Dalil Heirati, S.F., et al., Effect of Vitex agnus-castus plant on sexual function in women of reproductive age. The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility, 2020. 23(4): p. 62-74.

21)        Abedy Ghehi, F., et al., Germ cells Markers Expression in Mouse Premature Ovarian Failure Model. Pathobiology Research, 2019. 22(3): p. 149-157.

22)        Emadi, A., R.J. Jones, and R.A. Brodsky, Cyclophosphamide and cancer: golden anniversary. Nature reviews Clinical oncology, 2009. 6(11): p. 638-647.

23)        Delkhosh, A., et al., Upregulation of FSHR and PCNA by administration of coenzyme Q10 on cyclophosphamide‐induced premature ovarian failure in a mouse model. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 2019. 33(11): p. e22398.

24)        Jeelani, R., et al., Cyclophosphamide and acrolein induced oxidative stress leading to deterioration of metaphase II mouse oocyte quality. Free Radical Biology and Medicine, 2017. 110: p. 11-18.

25)        Meng, Y., et al., Sphingosine-1-phosphate suppresses cyclophosphamide induced follicle apoptosis in human fetal ovarian xenografts in nude mice☆. Fertility and sterility, 2014. 102(3): p. 871-877. e3.

26)        Apperley, J. and N. Reddy, Mechanism and management of treatment-related gonadal failure in recipients of high dose chemoradiotherapy. Blood reviews, 1995. 9(2): p. 93-116.

27)        Meier, B., et al., Pharmacological activities of Vitex agnus-castus extracts in vitro. Phytomedicine, 2000. 7(5): p. 373-381.

28)        Chen, X.-Y., et al., Follicle loss and apoptosis in cyclophosphamide-treated mice: what’s the matter? International journal of molecular sciences, 2016. 17(6): p. 836.

29)        Luo, Q., et al., Role of SDF-1/CXCR4 and cytokines in the development of ovary injury in chemotherapy drug induced premature ovarian failure mice. Life Sciences, 2017. 179: p. 103-109.

30)        Bhartiya, D. and J. Singh, FSH–FSHR3–stem cells in ovary surface epithelium: basis for adult ovarian biology, failure, aging, and cancer. Reproduction, 2015. 149(1): p. R35-R48.

31)        Hardy, M.L., Herbs of special interest to women. Journal of the American Pharmaceutical Association (1996), 2000. 40(2): p. 234-242.

32)        Liu, J., et al., Isolation of linoleic acid as an estrogenic compound from the fruits of Vitex agnus-castus L.(chaste-berry). Phytomedicine, 2004. 11(1): p. 18-23.

33)        Jelodar, G. and E. Karami, Effect of hydroalcoholic extract of vitex agnus-castus fruit on ovarian histology in rat with induced Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). Journal of BABOL University of Medical Sciences, 2013. 15(3): p. 96-102.

34)        Zamani, M., N. Neghab, and S. Torabian, Therapeutic effect of Vitex agnus castus in patients with premenstrual syndrome. 2012.

35)        AZARNIA, M., et al., Effects of vitex agnus castus on mice fetus development. 2007.

36)        Feyzollahi, Z., et al., Effect of Vitex agnus-castus ethanolic extract on hypothalamic KISS-1 gene expression in a rat model of polycystic ovary syndrome. Avicenna journal of phytomedicine, 2021. 11(3): p. 292.

37)        Jelodar, G., S. Masoomi, and F. Rahmanifar, Hydroalcoholic extract of flaxseed improves polycystic ovary syndrome in a rat model. Iranian journal of basic medical sciences, 2018. 21(6): p. 645.

 

---

[1]  

 

[2]  

 

[3]  

 

[4]  Premature ovarian failure

[5]  Vitex agnus castus  

[6]  Chaste tree

[7]  Radio Imuno assay

---