سنتز نانوذرات اکسید مس به روش شیمیایی و بررسی خواص ضد میکروبی آنها

محورهای موضوعی : میکروبیولوژی

اسما شمسایی ¹ , مینا رمضانی ^{2 *} , رامین محمدی آلوچه ³

1 - کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 - دانشیار گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - استادیار گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

تاریخ دریافت : 1402/09/08 تاریخ انتشار : 1403/10/19

کلید واژه: نانوذرات اکسید مس, استرپتوکوکوس اینیایی , اشرشیا کلی, فوزاریوم سولانی,

چکیده مقاله :

مقدمه: اکسید مس، یکی از مهمترین اکسیدهای فلزی واسطه است که دارای خصوصیات منحصر به فردی در مصارف فناورانه مختلفی نظیر ابر رساناها، به عنوان یک عامل ضد میکروبی بر علیه گونه های باکتریایی متعددی استفاده شده است. در تحقیق حاضر نانوذرات اکسید مس ، با استفاده از روش های شیمیایی تولید و فعالیت ضد میکروبی آن مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها: نانوذرات اکسید مس به روش مایکروویو سنتز شد و آنالیزهای XRD ، EDX ، SEM ، FTIR ، UV-vis جهت بررسی خصوصیات فیزیکی وشیمیایی انجام شد. ارزیابی تأثیرات ضدمیکروبی و ضدقارچی نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری های پاتوژن گرم مثبت استرپتوکوکوس اینیایی و گرم منفی اشرشیا کلی و قارچ فوزاریوم سولانی با کمک آزمون-های MIC و MBC و چاهک‌گذاری بررسی گردید. نتایج: نتایج نشان داد در غلظت های 20میلی گرم در میلی لیتر از نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری استرپتوکوکوس اینیایی ممانعت از رشد ثبت شد. همچنین این ممانعت از رشد برای اشرشیا کلی در غلظت 4 میلی گرم در میلی لیتر از نانوذرات مشاهده شد. همچنین قارچ فوزاریوم، در غلظت‌های بالاتر از 50 میلی گرم بر میلی لیتر نانواکسید مس، حساسیت به نسبت بیشتری نشان می‌دهد به طوری که در غلظت 100 میلی گرم بر میلی لیتر، قطر هاله عدم رشد 18 میلی متر بود. بحث و نتیجه گیری: می‌توان نانوذرات اکسید مس را به عنوان یک عامل قوی ضدمیکروبی معرفی نمود.

چکیده انگلیسی:

Introduction: Copper oxide is one of the most important metal oxides that has unique properties in various technological applications, such as superconductors, and has been used as an antimicrobial agent against numerous bacterial species. In the present study, CuO Nps was synthesized using chemical methods and its antimicrobial activity was investigated. Materials and Methods: Copper oxide nanoparticles were synthesized using the microwave method, and XRD, EDX, SEM, FTIR, and UV-vis analyses were performed to investigate the physical and chemical properties. The antimicrobial and antifungal effects of copper oxide nanoparticles on pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Fusarium solani were evaluated using MIC and MBC tests and well diffusion assay. Results: The results showed that at a concentration of 20 mg/mL, copper oxide nanoparticles inhibited the growth of Staphylococcus aureus. Similarly, growth inhibition of Escherichia coli was observed at a concentration of 4 mg/mL of nanoparticles. Furthermore, Fusarium solani exhibited increased sensitivity to copper oxide nanoparticles at concentrations higher than 50 mg/mL, with a growth inhibition zone diameter of 18 mm at a concentration of 100 mg/mL. Discussion and Conclusion: Copper oxide nanoparticles can be introduced as a strong antimicrobial agent.

متن کامل:



nthesis of copper oxide nanoparticles by chemical method and investigation of their antimicrobial properties

 

Abstract

Introduction: Copper oxide is one of the most important metal oxides that has unique properties in various technological applications, such as superconductors, and has been used as an antimicrobial agent against numerous bacterial species. In the present study, CuO Nps was synthesized using chemical methods and its antimicrobial activity was investigated.

Materials and Methods: Copper oxide nanoparticles were synthesized using the microwave method, and XRD, EDX, SEM, FTIR, and UV-vis analyses were performed to investigate the physical and chemical properties. The antimicrobial and antifungal effects of copper oxide nanoparticles on pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Fusarium solani were evaluated using MIC and MBC tests and well diffusion assay.

Results: The results showed that at a concentration of 20 mg/mL, copper oxide nanoparticles inhibited the growth of Staphylococcus aureus. Similarly, growth inhibition of Escherichia coli was observed at a concentration of 4 mg/mL of nanoparticles. Furthermore, Fusarium solani exhibited increased sensitivity to copper oxide nanoparticles at concentrations higher than 50 mg/mL, with a growth inhibition zone diameter of 18 mm at a concentration of 100 mg/mL.

Discussion and Conclusion: Copper oxide nanoparticles can be introduced as a strong antimicrobial agent.

Keywords: Copper oxide nanoparticles, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Fusarium solani

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

سنتز نانوذرات اکسید مس به روش شیمیایی و بررسی خواص ضد میکروبی آنها

 

چکیده

مقدمه: اکسید مس، یكی از مهمترین اکسیدهاي فلزي واسطه است که داراي خصوصیات منحصر به فردي در مصارف فناورانه مختلفی نظیر ابر رساناها، به عنوان یك عامل ضد میكروبی بر علیه گونه هاي باکتریایی متعددي استفاده شده است. در تحقیق حاضر نانوذرات اکسید مس ، با استفاده از روش های شیمیایی تولید و فعالیت ضد میكروبی آن مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها:  نانوذرات اکسید مس به روش مایکروویو سنتز شد و آنالیزهای XRD ، EDX ، SEM ، FTIR ، UV-vis جهت بررسی خصوصیات فیزیکی وشیمیایی انجام شد. ارزیابی تأثیرات ضدمیکروبی و ضدقارچی غلظتهای مختلف نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری های پاتوژن گرم مثبت استرپتوکوکوس اینیایی و گرم منفی اشرشیا کلی و قارچ فوزاریوم سولانی با کمک آزمون­های MIC و MBC و چاهک­گذاری بررسی گردید.

نتایج: نتایج نشان داد در غلظت های 20 میلی گرم در میلی لیتر از نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری استرپتوکوکوس اینیایی ممانعت از رشد ثبت شد. همچنین این ممانعت از رشد برای اشرشیا کلی در غلظت 4 میلی گرم در میلی لیتر از نانوذرات مشاهده شد. همچنین قارچ فوزاریوم، در غلظت­های بالاتر از 50 میلی گرم بر میلی لیتر نانواکسید مس، حساسیت به نسبت بیشتری نشان می­دهد به طوری که در غلظت 100 میلی گرم بر میلی لیتر، قطر هاله عدم رشد 18 میلی متر بود.

بحث و نتیجه گیری: می­توان نانوذرات اکسید مس را به عنوان یک عامل قوی ضدمیکروبی معرفی نمود.

کلمات کلیدی: نانوذرات اکسید مس، استرپتوکوکوس اینیایی ، اشرشیا کلی، فوزاریوم سولانی 

مقدمه

نانوذرات اکسید مس (CuO Nps)، در میان سایر نانومواد اکسید، توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده به عنوان یک عامل ضد میکروبی ایمن، ساده و مؤثر برای استفاده انسانی مورد تایید، و از قرن نوزدهم به‌شدت مورد استفاده قرار گرفته‌است(1.2.3). با توجه به چالش مقاومت دارویی، فعالیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس آنها را به عنوان کاندیدای قوی برای استفاده به عنوان عوامل درمانی تبدیل کرده است(4).  مکانیسم های زیستی متفاوتی برای نانوذرات بر علیه میکروارگانیسم ها پیشنهاد شده است که سه مکانیسم پذیرفته تر می باشد. 1: تجمع و انحلال نانوذرات در غشای باکتری باعث تغییر نفوذپذیری آن می‌شود و متعاقباً آزادسازی لیپوپلی‌ساکاریدها، پروتئین‌های غشایی و بیومولکول‌های داخل سلولی و اتلاف نیروی محرکه پروتون در غشای پلاسمایی. 2: تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)و آسیب به ساختار سلولی. 3: جذب یون‌های فلزی مشتق‌شده از نوکلئو پروتئین ها و به دنبال آن کاهش تولید ATP درون سلولی و اختلال در همانندسازی  DNA. در این راستا، روز به روز چندین استراتژی سنتز نانوذرات بهبود یافته در حال توسعه است که شامل فرآیندهای فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی است (5.6.7.8).

بیماری‌های باکتریایی ماهی یکی از جدی‌ترین مشکلاتی است که صنعت ماهی با آن مواجه است، زیرا شیوع آن‌ها منجر به خسارات اقتصادی بالایی می‌شود، بنابراین کنترل آن‌ها از اولویت جهانی برخوردار است. سوء استفاده از آنتی بیوتیک ها در کنترل بیماری های باکتریایی ماهی منجر به ایجاد مقاومت در باکتری ها می شود که در برابر اکثر آنتی بیوتیک های رایج مقاومت می کنند و یک خطر برای سلامت عمومی محسوب می شوند(10). استرپتوکوکوس ها از جمله مهمترین پاتوژن های ماهی محسوب می شوند و در این میان استرپتوکوکوس اینیایی (Streptococcus iniae) به عنوان یکی از عوامل مهم بروز استرپتوکوکوزیس در گونه های متعددی از ماهیان آب شیرین و دریایی، گونه های پرورشی و جمعیت های وحشی به حساب می آید(9). تلفات حاصله از این باکتری با علائم متنوع بالینی تا ۸۰ درصد نیز می رسد. بیماری به هر دو صورت انفرادی و همه گیری در ماهیان اتفاق می افتد(10).

اشرشیاکلی (Escherichia coli یا E. coli) زیر گونه O157H7 یک عامل بیماریزای مهم غذایی است که باعث اسهال خونی و گاهی سندرم همولیتیک اورمیک (HUS) می شود(11). این پاتوژن انسانی مشترک انسان و دام می تواند در غذا و محیط های مربوط به غذا باقی بماند و متعاقبا بیوفیلم تولید کند. O157H7 از طریق مصرف غذاهای آلوده مانند گوشت گاو و لبنیات، سبزیجات و میوه ها منتقل می شود (11).

بیماری های عفونی در آبزیان، می تواند توسط برخی عوامل قارچی نیز ایجاد گردد. قارچ ها در بهداشت آبزیان از اهمیت ویژه ای برخوردار بوده و به عنوان عاملی اساسی در تعیین وضعیت بهداشتی مزارع پرورش ماهی مدنظر می باشند (12).

برخی از گونه های قارچی مانند  فوزاریوم سولانی (Fusarium solani) نیز به عنوان عوامل موثر در فوزاریوزیس، مطرح می باشند(12). این قارچ ها عمدتاً از دسته قارچ های ناقص هستند و گونه های مختلفی از آنها در ماهی و میگو ایجاد بیماری می کنند. عفونت ناشی از فوزاریوم از کوسه، لاک پشت های دریایی، ماهی آزاد اطلس و برخی انواع خرچنگ ها گزارش شده است (11.12). به علت مقاومت گونه‌های فوزاریوم در برابر داروهای ضدقارچی، شناسایی سریع و دقیق آنها برای کنترل تبعات عفونت امری مهم وضروری است. با توجه به مطالب ذکر شده، هدف از این مطالعه سنتز نانوذرات اکسید مس و بررسی خواص ضد میکروبی آنها می باشد. 

مواد و روش ها

سنتز نانوذرات اکسید مس (CuO Nps)

سنتز نانوذرات اکسید مس به روش شیمیایی انجام گردید. مقدار 6 گرم نیترات مس به 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. پس از مخلوط شدن، با استفاده از سدیم هیدروکسید، pH محلول تا مقدار 9 یا 10 رسانده شد. سپس به مدت 10 دقیقه ماکروویو گردید. نمونه مورد نظر سانتریفیوژ شد. محلول رویی را خارج کرده و رسوب حاصل از سانتریفیوژ با استفاده از آب مقطر و الکل 70 درصد شستشو داده و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 60 درجه سلسیوس قرار داده شد تا نانوذرات اکسید مس تشکیل شوند. به منظور ارزیابی نانوذرات اکسید مس تولید شده از طیف سنجی مرئی فرابنفش (UV)، تفرق یا پراش اشعه ایکس (XRD)، میکروسکوپی الکترونی روبشی (FE-SEM)، طیف سنجی پراش انرژی پرتو ایکس (EDS یا EDAX) و آنالیز مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR)استفاده گردید.

ارزیابی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس

در این مطالعه از سویه‌های استاندارد باکتری استرپتوکوکوس اینیایی و اشرشیا کلی و قارچ فوزاریوم سولانی به ترتیب با کد ثبتی PTCC 1887، IBRC-M 11106 و IBRC-M 30506 تهیه شده از مرکز کلکسیون میکروارگانیسم های صنعتی و مرکز ملی ذخایر ژنتیکی ایران، به منظور ارزیابی های ضدمیکروبی نانوذرات اکسید مس استفاده گردید. در ابتدا از کشت 24 ساعته باکتری و قارچ مورد آزمایش، سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند (cfu/ml 108×5/1) تهیه گردید.

تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی پاتوژن های باکتریایی

ابتدا از کشت تازه هر یک از سویه های مورد مطالعه، با استفاده از سواب استریل، بر روی محیط مولر هینتون آگار پاساژ داده شد. سپس با استفاده از پنس استریل، دیسک‌های آنتی بیوتیک ریفامپین (RA)، پنی سیلین (P)، مروپنم (Men) و تتراسایکلین (Te) برای گونه گرم مثبت استرپتوکوکوس اینیایی و از دیسک های آنتی بیوتیک جنتامایسین (GM)، سیپروفلوکساسین (CP)، آموکسی کلاو (AMO) و پنی سیلین برای گونه گرم منفی اشرشیا کلی با فاصله مناسب از یکدیگر بر روی سطح محیط قرار داده شدند. انکوباسیون 48 ساعته در 37 درجه سانتی گراد، قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک‌ها با خط کش استاندارد (برحسب میلی متر) اندازه گیری گردید.

فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید مس سنتز شده، بر اساس انتشار در آگار و با روش چاهک مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور از سوسپانسیون نیم مک فارلند (CFU/ml 108 × 5/1) باکتری های پاتوژن مورد آزمون با سواپ استریل در سطح محیط کشت مولر هینتون آگار کشت یکنواخت تهیه شد. سپس چاهک هایی به قطر 8 میلی متر در محیط حفر شد و پس از تهیه غلظت های مختلف نانوذره در غلظت های 4، 6، 8 و 10 میلی گرم بر میلی لیتر برای باکتری اشرشیاکلی و غلظت های 20، 40، 60 و 80 میلی گرم بر میلی لیتر برای باکتری استرپتوکوکوس اینیایی، مقدار 100 میکرولیتر از نانوذره اکسید مس در داخل چاهک ها ریخته و به مدت 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. پس از این مدت با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها حساسیت یا مقاومت باکتری های مورد آزمون نسبت به نانوذرات اکسید مس تعیین گردید.

تعیین حداقل غلظت بازدارنده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشنده (MBC)

کمترین غلظت مهارکنندگی نانوذره اکسید مس سنتز شده نیز بر اساس کدورت سنجی و با استفاده از روش میکرودایلوشن در محیط مایع در پلیت های 96 چاهکی انجام شد. برای این منظور رقت های مختلف نمونه های نانوذره  (2 تا 80 میلی گرم بر میلی لیتر) در محیط کشت مولر هینتون براث تهیه شده و در مجاورت سوسپانسیون معادل CFU/ml 108 × 5/1 از هر کدام از باکتری های پاتوژن مورد آزمون به مدت 24 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شدند. البته، ابتدا سوسپانسیون باکتری به نسبت 1 به 100 رقیق شد تا تراکم CFU/ml 106 بدست آید و پس از مخلوط شدن با حلال، غلظت نهایی باکتری CFU/ml 105 × 5 شد. در این مطالعه کنترل مثبت (حاوی محیط مولر هینتون براث و سوسپانسیون باکتری معادل (CFU/ml 105 × 5) و کنترل منفی (حاوی محیط مولر هینتون براث و نانو ذره) بود. پس از این مدت آخرین رقتی که در آن کدورت میکروبی مشاهده نشد به عنوان MIC تعیین شد. تست های حداقل غلظت مهاری برای هر باکتری با سه مرتبه تکرار انجام پذیرفت و میانگین نتایج برای آنها در این ارزیابی به ثبت رسید.

به منظور تعیین MBC، از چاهک ثبت شده به عنوان MIC و همینطور غلظت های بالاتر آن در محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد و آخرین رقتی که در آن کلنی مشاهده نشد به عنوان کمترین غلظت باکتری کشی تعیین و گزارش گردید.

بررسی اثر ضد قارچی با تعیین قطر هاله بازدارنده به روش چاهک

از سویه قارچی فوزاریوم سولانی تهیه شده، سوسپانسیون میکروبی دارای کدورتی مطابق آنچه که در مراحل قبل گفته شد، تهیه گردید. سپس با استفاده از سواب پنبه ای استریل، کشت قارچی به صورت یکنواخت در محیط سابرو دکستروز آگار انجام گرفت. پس از آن با استفاده از پیپت پاستور شیشه ای استریل، چاهک هایی به قطر 8 میلی متر در محیط های کشت حفر شده و مقدار 100 میکرولیتر از نانوذره اکسید مس با غلظت های 100، 50، 25 و 5/12 میلی گرم در میلی لیتر به داخل چاهک ها انتقال داده شد. انکوباسیون پلیت ها به مدت 48 ساعت و در دمای 35 درجه سانتی گراد انجام شد و پس از طی این مدت قطر هاله های عدم رشد اندازه گیری و ثبت گردید.

نتایج

تهیه نانوذرات اکسید مس به روش مایکروویو

در طی سنتز نانوذرات اکسید مس به روش شیمیایی، نانوذرات دچار تغییر رنگ از آبی شفاف به کدر و سپس سیاه به دلیل احیاء یون های مس و تجمع آنها به صورت نانوذره در محلول شدند (شکل1).

 

 

شکل1: تغییر رنگ نانوذرات اکسید مس در طی فرایند تولید از آبی شفاف به کدر و سپس سیاه

 

ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز XRD

در بررسی و ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز XRD مشخص گردید طبق استاندارد JCPDS به شماره 1451-36 نتایج این آزمون از زاویه حدود 10 درجه آغاز و تا زاویه حدود 80 درجه به عنوان نقطه پایان ادامه داشته است که از دلایل تایید و صحت سنتز موفق این نانو ذرات می باشد. بر اساس نمودار 1 الگوی پیک هایXRD ، مربوط اندیس های میلر در سطوح مختلفی بوده که مربوط به زوایای ɵ2 بوده و نشان دهنده ساختار مکعبی مراکز سطحیFace-centered cubic (fcc)  در طیف نمونه نانوذرات اکسید مس می باشد. بر اساس فرمول ذکر شده میانگین نانوذرات در نتایج حاصل از XRD  به طور متوسط 68 نانومتر محاسبه گردید.

 

نمودار1: طیف XRD نانوذرات اکسید مس سنتز شده

 

ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز  EDS

ارزیابی های ساختاری نانوذره سنتز شده، ترکیب عنصری آن نیز به کمک طیف سنجی پراش اشعه ایکس مورد ارزیابی قرار گرفت. در نمودار 2 همانطور که مشخص است مس در پتانسیل ورودی kev 1 حضوری تقریباً کامل و در ولتاژ kev 8 نیز حضور نسبی از خود نشان داده است که با نتایج پژوهش های پیشین مطابقت خوبی دارد (12). لازم بذکر است که معمولاً مس در ولتاژ های ورودی پایین تر، جذب الکترون بالاتری را از خودش نشان می دهد. البته علت این امر را می توان ناشی از ویژگی های سطحی مس بیان نمود. با توجه نمودار2، مشخص شد که 44/64 درصد مس و 56/35 درصد اکسیژن در نمونه وجود دارد. 

 

 

نمودار2: گراف مربوط به آنالیز نانوذره اکسید مس طی آنالیز EDS

 

همانطور که در آنالیز MAP امکان ارائه توزیع فراوانی عناصر موجود در یک تصویر امکان پذیر خواهد بود برای ذرات اکسیژن و مس به صورت مجزا و در ترکیب باهم (اکسید مس) در شکل 2 قابل رصد و ارزیابی بود.

 

الف

ب

ج

 

 

شکل2: تصاویر Mapping ذرات مس و اکسیژن به صورت مجزا و در ترکیب باهم طی آنالیز EDS. الف: مس، ب: اکسیژن و ج: ترکیبی از مس و اکسیژن (اکسید مس) می باشد.

 

ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز  FT-IR

در ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز  FT-IR نتایج بدست آمده از آنالیز در طول موج های بین  cm-15/4003 – 397 صورت پذیرفت. در طیف FT-IR مربوط به نانوذرات مس اکسید شده، پیک  O-H از cm-1 38/3467 و به خاطر اتصال گروه های عاملی مذکور به نانوذرات اکسید مس است. پیک های دیگر در cm-1 08/1076 و cm-1 92/1403 مربوط به یون نیترات حاصل از ترکیب مس نیترات احیا شده است. جذب cm-1 20/1639 مربوط به ارتعاش کششی گروهC=C  حلقه های فنولی می باشد. با توجه به گروه های عاملی حاصل از نتایج FT-IR، این آنالیزها تایید کننده نتایج حاصل از EDS می باشد (نمودار3).

 

نمودار3: نمودار مربوط به طیف FT-IR نانوذرات اکسید نیکل سنتز شده

 

ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آنالیز میکروسکوپی FESEM

در این پژوهش، تعیین اندازه و شکل نانوذرات اکسید مس سنتز شده از طریق میکروسکوپ الکترونی FESEM مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر به دست آمده از آنالیز FESEM نشان می دهد که شکل نانوذرات سنتز شده کروی می باشد و در برخی نقاط تجمع ذرات و آگلومریزه شدن نانو ذرات مشاهده می شود. همچنین ابعاد نانوذره سنتز شده در بازه 535/51 تا 875/143 نانومتر می باشند. نتایج حاصل FESEM تایید کننده نتایج بدست آمده از XRD  می باشد تصاویر قابل مشاهده در شکل 3 با بزرگنمایی های متفاوت تهیه و ثبت شده اند (شکل3).

 

 

شکل3: مورفولوژی و اندازه نانوذرات اکسید مس در تصاویر FESEM

 

 ارزیابی نانوذره اکسید مس از طریق آزمون UV-Vis

نتایج بدست آمده از آزمون  UV-Vis نشان داد، در بازه طول موج 900 - 190 جذب انرژی صورت گرفته که نانو ذرات اکسید مس بیشترین جذب را در طول موج 205 نانومتر نشان دادند و این نشان دهنده وجود نانوذرات سنتز شده درون محلول می باشد (نمودار4).

 

 

نمودار4: نمودار جذب نور مرئی – فرابنفش نانوذرات اکسید مس

 

نتایج مربوط به بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها

در بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها مشخص گردید که استرپتوکوکوس اینیایی نسبت به آنتی بیوتیک های ریفامپین و مروپنم حساس و در برابر آنتی بیوتیک های پنی سیلین و تتراسایکلین مقاوم می باشد. همچنین باکتری اشرشیا کلی نیز در حضور آنتی بیوتیک های جنتامایسین و سیپروفلوکساسین حساسیت نشان داد در حالی که در برابر دو داروی دیگر یعنی آموکسی کلاو و پنی سیلین مقاوم بود(جدول1).

 

جدول1: نتایج بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی گونه های باکتریایی به روش دیسک دیفیوژن

The diameter of the lack of growth in millimeters
باکتری مورد مطالعه	ریفامپین	پنی سیلین	مروپنم	تتراسایکلین
Streptococcus iniae	25	0	22	16
	جنتامایسین	سیپروفلوکساسین	آموکسی کلاو	پنی سیلین
Escherichia coli	28	27	17	17

ب

الف

 

شکل4: نتایج مربوط به بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها در روش دیسک

الف: پلیت باکتری استرپتوکوکوس اینیایی  ب: پلیت باکتری اشرشیا کلی

 

نتایج مربوط به تعیین قطر هاله بازدارنده از رشد باکتری ها در روش چاهک

در بررسی نتایج مربوط به تعیین قطر هاله بازدارنده از رشد باکتری ها در روش چاهک بیشترین قطر هاله عدم رشد در غلظت های بالای نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری استرپتوکوکوس اینیایی مشاهده گردید که این میزان 15 میلی متر ارزیابی و ثبت شد. پس از آن نیز غلظت های 80، 60، 40 و 20 میلی گرم بر میلی لیتر از نانوذره با ظهور قطر های بازدارنده ای به ترتیب به میزان 13، 12، 11 و 10 میلی متر، این گونه باکتریایی را از رشد در ناحیه حضور اکسید مس باز داشتند. این در حالی بود که در غلظت های کمتر از 20 میلی گرم بر میلی لیتر، بر روی این باکتری و طی این روش، اثر بازدارندگی مشاهده نشد. در این ارزیابی گونه گرم منفی اشرشیا کلی حساس تر بود و در غلظت های پایین تر نانوذره، قطر هاله بازدارنده داشت. این اندازه گیری در غلظت های 10، 8، 6 و 4 میلی گرم بر میلی لیتر اکسید مس به ترتیب معادل 15، 11، 9 و 7 میلی متر بود (جدول2).

 

جدول2: نتایج مربوط به اندازه گیری قطر هاله عدم رشد در روش چاهک

 

نتایج مربوط به تعیین MIC و MBC نانوذرات اکسید مس علیه گونه های باکتری

در بررسی حداقل غلظت مهار کننده رشد باکتری، کمترین غلظت نانوذره اکسید مس که در حضور آن کدورت قابل جذبی در دستگاه الایزا ثبت نگردید به عنوان MIC درنظر گرفته شد. همانطور که مشخص است برای باکتری استرپتوکوکوس اینیایی این مقدار 128 میکروگرم بر میلی لیتر بوده است. همینطور برای باکتری اشرشیا کلی نیز حداقل غلظت مهاری همین مقدار (128 میکروگرم بر میلی لیتر) بود. پس از تعیین میزان MIC از چاهک های فاقد کدورت بر روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده شد و نتایج پس از گذشت 2۴ ساعت مورد بررسی قرار گرفت. کمترین غلظتی که باعث مرگ باکتری های تلقیح شده گردد، به عنوان حداقل غلظت کشنده (MBC) در نظر گرفته می گردد. نتایج حاکی از آن بود که برای استرپتوکوکوس اینیایی مقدار MBC نانوذرات اکسید مس با MIC آن برابر و به میزان 128 میکروگرم بر میلی لیتر بوده است، در حالی بود که برای اشرشیا کلی مقدار MBC بیشتر و 256 میکروگرم بر میلی لیتر اندازه گیری شد.

 

نتایج مربوط به تعیین قطر هاله بازدارنده رشد قارچ فوزاریوم در روش چاهک

همچنین برای قارچ فوزاریوم سولانی مشخص گردید در غلظت های بالاتر از 50 میلی گرم نانوذره، حساسیت به نسبت بیشتری در مقایسه با غلظت های کمتر از این مقدار دارد به طوری که در غلظت 100 میلی گرم بر میلی لیتر با قطر هاله 18 میلی متری از رشد بازداشته می شود (جدول3).

 

جدول3: نتایج مربوط به اثر ضد قارچی نانوذرات اکسید مس علیه فوزاریوم سولانی در روش چاهک

The diameter of the lack of growth in millimeters
Bacteria under study
Streptococcus iniae
Escherichia coli

The diameter of the lack of growth in millimeters
Mushroom study	100	50	25	12.5
Fuzarium solani	18	11	10	10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

الف

ب

 

ج

 

 

 

 

 

 

 

 

 

و

ه

د

 

 

 

و

د

ه

 

 

 

 

 

 

 

شکل5: نتایج مربوط به بررسی تأثیرات ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس

الف: قطر هاله بازدارنده رشد قارچ فوزاریوم سولانی در روش چاهک. ب: قطر هاله بازدارنده رشد باکتری اشرشیا کلی

ج: قطر هاله بازدارنده رشد باکتری استرپتوکوکوس اینیایی. د: حداقل غلظت مهار کننده (MIC) باکتری های استرپتوکوکوس اینیایی و اشرشیا کلی. ه: حداقل غلظت کشنده (MBC) باکتری استرپتوکوکوس اینیایی.

و: حداقل غلظت کشنده (MBC) باکتری اشرشیا کلی.

 

بحث

درسال هاي اخیر، بررسی هاي آزمایشگاهی نشان داده اند که برخی از داروها در فرم نانومتري داراي فعالیت ضد باکتریایی مؤثرتري هستند(13.14). یون و همكاران اثرات ضد باکتریایی نانوذرات مس و نقره را براي اشرشیاکلی و باسیلوس سوبتیلیس گزارش کردند، که نانو ذرات مس فعالیت ضد باکتریایی بیشتري در مقایسه با نانو ذرات نقره از خود نشان دادند (15). بطور کلی اطلاعات اندکی در مورد فعالیت ضد میكروبی نانو ذرات اکسید مس در دسترس است. اما در اکثر مطالعات بر روی نانو ضد میکروب های مبتنی بر فلز، اثربخشی بیولوژیکی این ماده به طور قابل توجهی بالاتر یا طولانی تر از زیست فعالی خود فلز بوده است. این عملکرد به چندین جنبه از جمله خواص وابسته به اندازه نانو فلز، نسبت سطح به حجم بالای ذرات بسیار ریز و در نهایت ویژگی‌های غیر متعارف مربوط به وجود سطح مرتبط گزارش شده است (16.17).  نانوذره اکسید مس نسبت به نانوذره نقره ارزانتر است و به آسانی با پلیمرها مخلوط می گردد و از لحاظ فیزیكی و شیمیایی نسبتاً پایداراست. نانو ذرات به شدت یونی اکسید فلزي نظیر اکسید مس، داراي پتانسیل لازم براي کاربرد به عنوان عوامل ضد میكروبی می باشند و می توانند با ناحیه سطحی بسیار وسیع و مورفولوژي هاي کریستالی مختلفی تهیه شوند (18.19). به نظر می رسد که مس و ترکیبات حاوی آن، اثر ضد میکروبی خود را با تولید رادیکال های هیدروکسیل فعال اعمال می کنند که می تواند باعث آسیب های جبران ناپذیری مانند اکسیداسیون پروتئین ها، برش مولکول های DNA و RNA و آسیب غشایی به دلیل پراکسیداسیون لیپیدی شود(20.21). هنوز دانش قطعی در مورد تعامل نانوذرات اکسید مس با میکروارگانیسم ها و نفوذ احتمالی نانوذرات به سلول­های میکروبی وجود ندارد اما گزارشات دیگری نیز در خصوص مکانیسم اثرات ضدمیکروبی این ترکیبات به چشم می خورد. به عنوان مثال Applerot و همکارانش با هدف روشن کردن فعالیت ضد باکتریایی اکسید مس وابسته به اندازه (از مقیاس کوچک تا مقیاس نانو) آزمایشاتی انجام دادند. در پژوهش آنها نیز مشخص گردید که فعالیت ضد باکتریایی قوی نانوذرات اکسید مس به دلیل تولید ROS توسط نانوذرات متصل به سلول‌های باکتریایی است که به نوبه خود باعث افزایش استرس اکسیداتیو درون سلولی می‌شود. این پارادایم توسط چندین سنجش مانند پراکسیداسیون لیپیدی و سویه های گزارشگر استرس اکسیداتیو تایید شد. علاوه بر این، میکروسکوپ الکترونی نشان داد که نانوذرات کوچک اکسید مس به سلول‌ها نفوذ کرده ‌اند. در مجموع، نتایج گزارش ‌شده در اینجا ممکن است مفاهیم مختلف موجود در گزارشات مربوط به مکانیسم ضد باکتریایی نانوذرات اکسید مس را تطبیق دهد و همچنین پتانسیل توسعه دستگاه‌های مبتنی بر نانوذرات اکسید مس را برای مهار عفونت‌های باکتریایی برجسته کند(22).

در مطالعه ما جهت بررسی مورفولوژی و اندازه نانوذرات اکسید مس سنتز شده توسط فرآیند شیمیایی مایکروویو، آنالیز میکروسکوپی FESEM مورد استفاده قرار گرفت. همانطور که از تصاویر FESEM قابل استنتاج است، در طی روش سنتز اکسید مس، مورفولوژی تقریباً هم محور و کروی نانوذرات با اندازه تقریبی بین 52 تا 144 نانومتر قابل تشخیص می باشد. با این حال، به دلیل فعالیت سطحی بالای ذرات در مقیاس نانو و تشکیل گروه ‌های هیدروکسیل در حین شستشو، غالباً ذرات اکسید مس سنتز شده به هم می‌چسبند و آگلومر تشکیل می‌دهند که در تصاویر ما نیز این چسبندگی نانوذرات دیده شد. نتایج مطالعات مختلف نشان داده است که سنتز پودر اکسید مس با روش‌های مختلف باعث مورفولوژی متفاوتی می‌شود. با بررسی اثر شکل و مورفولوژی نانو ذرات اکسید مس بر خواص ضد میکروبی، نشان داده شده است که ذرات با مورفولوژی کروی و ابعاد نانومتری به دلیل نسبت سطح به حجم بالا، توانایی بهتری در از بین بردن میکروارگانیسم ها در محیط کشت دارند(23.24.25). طیف‌سنجی FTIR نیز در ادامه و برای شناسایی نانوذرات اکسید مس با استفاده از اتصالات موجود برقرار شده بین ذرات، استفاده گردید. طیف FTIR نانوذره اکسید مس نشان می‌دهد که باند جذب وسیع در cm-1 38/3467 و مربوط به گروه عاملی هیدروکسیل (OH) است. اوج جذب این نمودار نیز در همین محدوده مشاهده گردید. باند IR در حدود cm-1 20/1639 را می توان به خمش آروماتیک گروه آلکن (C=C) اختصاص داد. قله های دیگر قابل مشاهده در نمودار، به ارتعاش تغییر شکل باند گروه های آلکانی، الکل‌های اولیه و ثانویه و نیز ارتعاش خمشی گروه های آروماتیک مربوط بود.

طی پژوهش ما، اثرات هم افزایی یا پوشش دهی نانوذرات اکسید مس با مواد دیگر انجام نشد اما خواص ضدباکتریایی آن بر علیه دو گونه باکتریایی استرپتوکوکوس اینیایی و اشرشیا کلی در مقایسه با آنتی بیوتیک ها و همینطور اثرات ضدقارچی نانوذرات علیه گونه فوزاریوم سولانی، که هر سه ساکن محیط های آبی نیز می باشند، بررسی گردید. نتایج نشان داد که اشرشیا کلی طی سنجش بازدارندگی در روش چاهک در غلظت های پایین تری از رشد بازداشته می شود در حالی که در تعیین حداقل غلظت کشنده (MBC)، حتی در غلظت بالای نانوذره مس اثر خوبی نسبت به آنتی بیوتیک ها نشان نداد که این رفتار، ناشی از تفاوت در ساختار دیواره سلولی باکتریایی آنها نسبت به استرپتوکوکوس اینیایی است. بنابراین، باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به طور کلی مقاومت متفاوتی در برابر نانوذرات اکسید فلزی از خود نشان می دهند.

در مطالعه Ślosarczyk و همکاران در سال 2023 از نانوذرات اکسید مس برای توقف رشد باکتری های گرم مثبت (باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس) و گرم منفی (باکتری پسودوموناس آئروژینوزا) استفاده شد. در این مطالعه نشان داده شد که نانوذرات اکسید مس، در تمام غلظت‌های آزمایش شده، خواص ضد باکتریایی دارند. با این وجود، بهترین خواص مکانیکی، نانوذرات اکسید مس در 25/0 درصد وزنی به دست آمد(26). در مطالعه Swain  و همکاران در سال 2014 که به مطالعه فعالیت ضد میکروبی نانوذرات مبتنی بر فلز در برابر میکروب های مرتبط با بیماری های موجود در آبزی پروری پرداختند، نانوذرات فلزی و اکسید فلزی سنتز شده تجاری و آزمایشگاهی مختلف برای فعالیت های ضد میکروبی خود در برابر طیف وسیعی از عوامل باکتریایی و قارچی از جمله سیانوباکتری های خاص آب شیرین غربالگری شدند. در میان نانوذرات مختلف، اکسید مس سنتز شده (CuO)، اکسید روی (ZnO)، فعالیت ضد باکتریایی وسیعی از خود نشان دادند. در مطالعه Swain  و همکاران قطر اکسید مس سنتز شده 92 نانومتر بود که غلظت 5/0 میلی گرم بر میلی لیتر برای استافیلوکوک اورئوس، گونه های ویبریو و سودوموناس آئروژینوزا اثر بازدارندگی داشت و از غلظت 1 تا 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر برای سویه های باسیلوس سوبتیلیس، گونه های سیتروباکتر، فلاووباکترها و آئروموناس هیدروفیلا اثر بازدارندگی نشان داد (27).در مطالعه ما نانوذرات اکسید مس با قطر بین 52 تا 144 نانومتر در غلظت 20 میلی گرم بر میلی لیتر به بالا برای استرپتوکوکوس اینیایی و در غلظت 4 میلی گرم برمیلی لیتر برای اشرشیا کلی اثر بازدارندگی نشان داد.

در پژوهش ما اثرات ضدقارچی قابل توجهی نیز علیه سویه استاندارد آبزی فوزاریوم سولانی مشاهده گردید که در غلظت های بیشتر از 50 میلی گرم نانوذره، میزان این بازدارندگی تشدید می شد. در پژوهش های مشابه، گونه های متعددی از جمله آسپرژیلوس به عنوان یک قارچ فرصت طلب، با نانوذرات حاوی مس در اندازه حدوداً 25 نانومتری به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد محیط انکوبه شدند. در نتایج به دست آمده، جوانه زنی هاگ یا رشد رشته های رویشی مشخص نگردید اما الکتروفورز DNA ژنومی جدا شده پس از قرار گرفتن در معرض نانوذرات، نشان دهنده تکه تکه شدن ژنوم قارچ و نفوذ نانوذره در دیواره سلولی بوده است(28). همچنین بررسی فعالیت نانوذرات مس علیه گونه کاندیدا آلبیکنس طی مطالعه دیگری حاکی از آن بود که مخمر قرار گرفته در معرض یک سطح مسی، در مدت 5 دقیقه در دمای 23 درجه سانتی گراد غیرفعال می گردد. در آن مطالعه، رنگ فلورسنت دی هیدرواتیدیوم، برای شناسایی ROS سیتوپلاسمی در کنار یک رنگ حساس به مس که جذب نانوذره را نشان می‌داد، جهت نشان دادن اهمیت یون‌های مس در فعالیت قارچ کشی، استفاده شد. رنگ‌آمیزی بافت‌های زنده/مرده مخمری نشان داد که غشاها در مواجهه با سطح مس فوراً آسیب می‌بینند، که این خود نشان می‌دهد تعامل فیزیکی نانوذرات Cu با سلول مخمری در مکانیسم مرگ سلولی آن، حیاتی می باشد(29).

بطور کلی می توان گفت با وجود پیشرفت عظیم چند دهه اخیر در درک تأثیر مس و نانوذرات حاوی آن بر میکروارگانیسم‌ ها، بسیاری از سؤالات بی‌پاسخ در مورد اثر ضد میکروبی آنها همچنان باقی مانده است. لذا شناخت کامل این فرآیند و مکانیسم های مرتبط با آن، به ویژه با توجه به استفاده گسترده از مس به عنوان یک عامل ضد میکروبی در کاربردهای مختلف و ضرورت فوری برای توسعه جایگزین های جدید در مقابله با میکروارگانیسم های مقاوم به چند دارو و همچنین نقش محافظتی نانوذرات مس و دوره بازیابی مورد نیاز برای ایمن بودن نانوذرات مس برای استفاده به عنوان یک آنتی باکتریال برای هر گونه ماهی در صنعت آبزی پروری ضروری خواهد بود.

نتیجه گیری

نانوذرات اکسید مس سنتز شده در این پژوهش کروی شکل و به اندازه حدوداً 51 تا 144 نانومتر بودند که در محدوده مناسبی جهت کاربرد به عنوان داروهای ضدمیکروبی و اهداف پزشکی است. نتایج فعالیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس تولید شده در این مطالعه، نشان داد که در صورتی که پروسه بالینی آن تأیید شود قابل رقابت با برخی آنتی بیوتیک های باکتریایی تجاری مثل پنی سیلین، تتراسایکلین و آموکسی کلاو، خواهد بود، که می‌توانند از نظر دارویی برای مبارزه با باکتری‌های بیماری‌زای برجسته مانند استرپتوکوکوس اینیایی و اشرشیا کلی مورد استفاده قرار گیرند. همچنین نتایج بدست آمده از این مطالعه اثرات قابل توجه ضد قارچی را در تمامی غلظت های به کار رفته از 5/12 تا 100 میلی گرم، نشان داد که این بازدارندگی مطلوب می باشد. به طور کلی، این مطالعه ساده، کم هزینه، سازگار با محیط زیست و بهره‌وری بالا از ساخت نانوذرات اکسید مس را ارائه نمود. 

 

تقدیر و تشکر

 

تعارض منافع

نویسندگان اعلام می کنند که تعارض منافع وجود ندارد.

 

مصوبات پژوهشی

شناسه اخلاق: IR.IAU.CTB.REC.1401.087

منابع مورد استفاده

1.       Anuj SA, Gajera HP, Hirpara DG, Golakiya BA. Interruption in membrane permeability of drug-resistant Staphylococcus aureus with cationic particles of nano‑silver. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2019 Jan 15;127:208-16.

2.       Anuj SA, Gajera HP, Hirpara DG, Golakiya BA. Bactericidal assessment of nano-silver on emerging and re-emerging human pathogens. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 2019 Jan 1;51:219-25.

3.       Baptista PV, McCusker MP, Carvalho A, Ferreira DA, Mohan NM, Martins M, Fernandes AR. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria—“A Battle of the Titans”. Frontiers in microbiology. 2018 Jul 2;9:1441.

4.       Karunakaran C, SakthiRaadha S, Gomathisankar P. Photocatalytic and bactericidal activities of hydrothermally and sonochemically prepared Fe2O3–SnO2 nanoparticles. Materials Science in Semiconductor Processing. 2013 Jun 1;16(3):818-24.

5.       Elemike EE, Onwudiwe DC, Nundkumar N, Singh M. CuO and Au-CuO nanoparticles mediated by Stigmaphyllon ovatum leaf extract and their anticancer potential. Inorganic Chemistry Communications. 2019 Jun 1;104:93-7.

6.       Saravanakumar K, Sathiyaseelan A, Mariadoss AV, Xiaowen H, Wang MH. Physical and bioactivities of biopolymeric films incorporated with cellulose, sodium alginate and copper oxide nanoparticles for food packaging application. International Journal of Biological Macromolecules. 2020 Jun 15;153:207-14.

7.       Devi HS, Singh TD. Synthesis of copper oxide nanoparticles by a novel method and its application in the degradation of methyl orange. Adv Electron Electr Eng. 2014;4(1):83-8.

8.       Dagher S, Haik Y, Ayesh AI, Tit N. Synthesis and optical properties of colloidal CuO nanoparticles. Journal of Luminescence. 2014 Jul 1;151:149-54.

9.       Grigore ME, Biscu ER, Holban AM, Gestal MC, Grumezescu AM. Methods of synthesis, properties and biomedical applications of CuO nanoparticles. Pharmaceuticals. 2016 Nov 30;9(4):75.

10.       Nations S, Long M, Wages M, Maul JD, Theodorakis CW, Cobb GP. Subchronic and chronic developmental effects of copper oxide (CuO) nanoparticles on Xenopus laevis. Chemosphere. 2015 Sep 1;135:166-74.

11.       Ali Soomro R, Tufail Hussain Sherazi S, Memon N, Raza Shah M, Hussain Kalwar N, Richard Hallam K, Shah A. Synthesis of air stable copper nanoparticles and their use in catalysis. Advanced Materials Letters. 2014 Apr 1;5(4):191-8.

12.       Qamar H, Rehman S, Chauhan DK, Tiwari AK, Upmanyu V. Green synthesis, characterization and antimicrobial activity of copper oxide nanomaterial derived from Momordica charantia. International journal of nanomedicine. 2020 Apr 16:2541-53.

13.       Talebian S, Shahnavaz B, Nejabat M, Abolhassani Y, Rassouli FB. Bacterial-mediated synthesis and characterization of copper oxide nanoparticles with antibacterial, antioxidant, and anticancer potentials. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2023 Mar 6;11:1140010.

14.       Atri A, Echabaane M, Bouzidi A, Harabi I, Soucase BM, Chaâbane RB. Green synthesis of copper oxide nanoparticles using Ephedra Alata plant extract and a study of their antifungal, antibacterial activity and photocatalytic performance under sunlight. Heliyon. 2023 Feb 1;9(2).

15.       Yoon KY, Byeon JH, Park JH, Hwang J. Susceptibility constants of Escherichia coli and Bacillus subtilis to silver and copper nanoparticles. Science of the Total Environment. 2007 Feb 15;373(2-3):572-5.

16.       Applerot, G., Lellouche, J., Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R., Gedanken, A. and Banin, E. (2012), Understanding the Antibacterial Mechanism of CuO Nanoparticles: Revealing the Route of Induced Oxidative Stress. Small, 8: 3326-3337.

17.       Vorobyova V, Vasyliev G, Uschapovskiy D, Lyudmyla K, Skiba M. Green synthesis, characterization of silver nanoparticals for biomedical application and environmental remediation. Journal of Microbiological Methods. 2022 Feb 1;193:106384.

18.       Saha T, Mobarak MB, Uddin MN, Quddus MS, Naim MR, Pinky NS. Biogenic synthesis of copper oxide (CuO) NPs exploiting Averrhoa carambola leaf extract and its potential antibacterial activity. Materials Chemistry and Physics. 2023 Sep 1;305:127979.

19.       Alavi M, Dehestaniathar S, Mohammadi S, Maleki A, Karimi N. Antibacterial activities of phytofabricated ZnO and CuO NPs by Mentha pulegium leaf/flower mixture extract against antibiotic resistant bacteria. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2021 Jun;11(3):497.

20.       Bandeira M, Giovanela M, Roesch-Ely M, Devine DM, da Silva Crespo J. Green synthesis of zinc oxide nanoparticles: A review of the synthesis methodology and mechanism of formation. Sustainable Chemistry and Pharmacy. 2020 Mar 1;15:100223.

21.       Franco D, Calabrese G, Guglielmino SP, Conoci S. Metal-based nanoparticles: Antibacterial mechanisms and biomedical application. Microorganisms. 2022 Sep 3;10(9):1778.

22.       Applerot G, Lellouche J, Lipovsky A, Nitzan Y, Lubart R, Gedanken A, Banin E. Understanding the antibacterial mechanism of CuO nanoparticles: revealing the route of induced oxidative stress. Small. 2012 Nov 5;8(21):3326-37.

23.       Zhang Q, Zhang K, Xu D, Yang G, Huang H, Nie F, Liu C, Yang S. CuO nanostructures: synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 2014 Mar 1;60:208-337.

24.       Sathiyavimal S, Vasantharaj S, Kaliannan T, Garalleh HA, Garaleh M, Brindhadevi K, Chi NT, Sharma A, Pugazhendhi A. Bio-functionalized copper oxide/chitosan nanocomposite using Sida cordifolia and their efficient properties of antibacterial, anticancer activity against on breast and lung cancer cell lines. Environmental Research. 2023 Feb 1;218:114986.

25.       Hong MZ, Li JM, Chen ZJ, Lin XY, Pan JS, Gong LL. Global burden of major gastrointestinal cancers and its association with socioeconomics, 1990–2019. Frontiers in Oncology. 2022 Nov 1;12:942035.

26.       Ślosarczyk A, Klapiszewska I, Parus A, Balicki S, Kornaus K, Gapiński B, Wieczorowski M, Wilk KA, Jesionowski T, Klapiszewski Ł. Antimicrobial action and chemical and physical properties of CuO-doped engineered cementitious composites. Scientific Reports. 2023 Jun 27;13(1):10404.

27.       Swain P, Nayak SK, Sasmal A, Behera T, Barik SK, Swain SK, Mishra SS, Sen AK, Das JK, Jayasankar P. Antimicrobial activity of metal based nanoparticles against microbes associated with diseases in aquaculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2014 Sep;30:2491-502.

28.       Gomaa EZ, Housseiny MM, Omran AA. Fungicidal efficiency of silver and copper nanoparticles produced by Pseudomonas fluorescens ATCC 17397 against four Aspergillus Species: A molecular study. Journal of Cluster Science. 2019 Jan 15;30:181-96.

29.       Quaranta D, Krans T, Espírito Santo C, et al. Mechanisms of contact-mediated killing of yeast cells on dry metallic copper surfaces. Appl Environ Microbiol. 2011;77(2):416-426

---