استفاده از تکنیکqPCR به منظور شناسایی سویه های کدکننده توکسین کلستریدیوم دیفیسیل

محورهای موضوعی : میکروبیولوژی

لیلا نوری ¹ , مهدی ابراهیمی ² , مهدی علیجانیان زاده ³

1 - گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران
2 - گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، ورامین، ایران
3 - گروه علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران

تاریخ دریافت : 1397/03/13 تاریخ پذیرش : 1397/09/04 تاریخ انتشار : 1397/03/01

کلید واژه: کلستریدیوم دیفیسیل, qPCR, توکسین‌tcdA, توکسین tcdB,

چکیده مقاله :

کلستریدیوم ‌دیفیسیل (Clostridium difficile)، باکتری گرم ‌مثبت، بی‌هوازی و اسپوردار بوده و عامل گاستروآنتریتوکولیت با غشاءکاذب است. هنگامی که میکروفلور طبیعی روده، توسط فاکتورهای خطر، مانند درمان با آنتی‌بیوتیک‌ها، شیمی‌‌درمانی و غیره آشفته می‌شود،کلستریدیوم دیفیسیل فرصت تکثیر یافته و باعث بیماری می‌شود. عوامل اصلی بیماری‌زایی این باکتری، دوتوکسینB وAهستند،که توسط ژن‌هایtcdA وtcdB کد می‌شوند. هدف از این تحقیق توسعه روش qPCR به منظور شناسایی عفونت کلستریدیوم‌دیفیسیل از طریق طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌هایtcdAو tcdB می‌باشد. در این مطالعه ابتدا با بررسی دقیق نواحی حفاظت‌شده در توالی ژن‌هایtcdAو tcdB، دو جفت پرایمر برای تکثیر اختصاصی نواحی مورد نظر طراحی‌شد. سپس بهینه‌سازی روش qPCRبا استفاده از این پرایمرها انجام‌شد. حساسیت روش با استفاده از غلظت-های مختلف DNA باکتری مورد ارزیابی قرارگرفت. علاوه براین، به منظور بررسی اختصاصیت روش از DNA باکتری‌های مولد اسهال (اشرشیاکلی، شیگلا دیسانتری، سالمونلا تیفی و یرسینا انتروگلیتیکا) استفاده شد. در نهایت عملکرد روش بهینه‌سازی-شده با تعداد 100 نمونه بالینی مورد ارزیابی قرارگرفت. حساسیت روش به میزان pg100از DNA و اختصاصیت روش بهینه-سازی شده 100% تعیین شد. در نمونه‌های بالینی مورد مطالعه با روش بهینه‌سازی شده 9 مورد مثبت شناسایی شد. با توجه به نتایج بدست آمده استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌هایtcdA و tcdB می‌تواند به عنوان رویکرد مناسبی برای شناسایی سریع و دقیق عفونت C. difficile در تکنیک qPCR مورد استفاده قرارگیرد.

چکیده انگلیسی:

Clostridium difficile is the most important spore forming, gram positive, anaerobic bacilluswhich is known as prevalent factor of hospital diarrhea and causative agent of pseudomembrane colitis. The important virolence factors of this bacteria is A and B toxins. the clinical demonstration of Clostridium difficile infection range from asymptomatic colonization, to sever diarrhea, pseudo membranous colitis, toxic megacolon and death. The purpose of this study was to extract Clostridium difficile cells from faecal samples and develop a routine diagnostic laboratory method using qPCR to identify this bacteria with high sensitivity and accuracy. 100 clinical samples were collected within 6 months from patients being treated at Ayyatollah Taleghani education and treatment medical center. a standard strain was obtained from Pasteur Institue micobial seed bank. For determination of the specificity of the method being developed, the DNA of Escherichia coli, Shigella, Shigelladysenteriae, Salmonella typhi, Yersinia Entrocolitica were extracted and analyzed along with a primer designed for Toxin A in Clostridium difficile using q PCR. After optimization of the test conditions, 100 clinical samples were evaluated. Among the samples, 9 of them were (9%) positive. For evaluation of the sensitiviy of the test, the obtained DNA from the bacteria was diluted, and further analyzed using qPCR. To determine the specificity of the test, the genome of diarrhea causing bacteria were used which lead to positive results only from the genome of Clostridium difficile. Based on the obtained results, the sensitivity and precision of qPCR in rapid detection of 100 pg of DNA was determined.