انتقالcDNA گیرنده فعال کننده پراکسیزومی نوع گاما 1 موشی به داخل سلولهای فیبروبلاست گاوی و بررسی بیان درون سلولی آن به کمک پروتئین گزارشگر فلورسنت سبز
محورهای موضوعی : پژوهش های بالینی دام های بزرگ
کلید واژه: کلونینگ, فیبروبلاست, ترانسفکشن,
چکیده مقاله :
هدف از این پژوهش، بررسی جایگیری cDNA PPARγ1موشدر پلاسمید بیانی pEGFP-C1 در هسته سلول مورد مطالعه ( فیبروبلاست گاوی) با استفاده از رد یابی مارکر فلورسنتی سبز EGFP می باشد. برای بررسی الگوی بیان و جهت گیری cDNA PPARγ1 درون هسته سلولهای فیبروبلاست گاوی، پس از تکثیر و کلون نمودن آندر پلاسمید بیانی مناسب pEGFP-C1 سلول‌ها با µg 2.4 پلاسمید و µl 6 Lipofectamine 2000 ترانسفکت شدند. مارکر EGFP که به صورت فیوز شده باcDNA PPARγ1بیان می‌شود، برای رد یابی استفاده شد. با ترانسفکت نمودن سلولهای فیبروبلاست گاوی، پروتئین حاصله عمدتا وارد هسته ها گردید. همان طور که انتظار می رفت، cDNA ژن PPARγ1 موشی کلون گردیده متصل به ژن گزارشگر فلورسنت سبز با موفقیت بیان شده و پروتئین حاصله عمدتا به داخل هسته سلولهای مورد مطالعه، وارد شده است. بنابراین می‌توان از پلاسمید نوترکیب حاصله برای مطالعات بیشتر جهت بررسی وظیفه ژن PPARγ1 بهره برد و اتصال EGFP به PPARγ1 مانع از جهت یابی داخل سلولی PPARγ1 نمی شود.
The main aim of this research is to study nuclear localization of mouse PPARγ1 cDNA into pEGFP-C1. To investigate the nuclear localization of PPARγ1 protein linked to EGFP marker gene into bovine fibroblast and analysis of intracellular green fluorescency Mouse PPARγ1 cDNA in a mammalian expression vector (pEGFP-C1) in a chimeric cDNA type, encompassing PPARγ1 with EGFP cDNA. EGFP marker was used for monitoring. To confirm the intracellular localization of EGFP- PPARγ1, bovine fibroblast cells were transfected with the 2.4 µg constructed plasmid and 6 µl Lipofectamine 2000. The related product was entered into the nucleus of bovine fibroblasts after transfection of its cDNA. As expected, chimeric cDNA of EGFP-PPARγ1 correctly expressed and related protein was dominantly entered to the nuclei of the cells. Thus the recombinant plasmid could be applicable for further studies to unravel the further aspects of PPARγ1 function. Moreover fusion of EGFP with PPARγ1 does not hamper the nuclear targeting of PPARγ1.
1- Akiyama, T.E., Baumann, C.T., Sakai, S., Hager, G.L., Gonzalez, F.J. (2002): Selective intranuclear redistribution of PPAR isoforms by RXRα. Molecular Endocrinology. 16, 707–721.
2- Berger, J., Patel, H.V., Woods, J., Hayes, N.S., Parent, S.A., Clemas, J., Leibowitz, M.D., Elbrecht, A., Rachubinski, R.A., Capone, J.P., Moller, D.E. (2000): A PPARγ mutant serves as a dominant negative inhibitor of PPAR signaling and is localized in the nucleus. Molecular Cell Endocrinology. 162, 7–67.
3- Bishop-Bailey, D., Hla, T. (1999): Endothelial cell apoptosis induced by the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) ligand 15-deoxy-Δ12, 14-prostaglandin J2. Journal of Biological Chemistry. 274, 17042–17048.
4- Copeland, N., Jenkins, N., and Court, D. (2001): Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nature Review Genetics 2, 769–779.
5- Fajas, L., Auboeuf, D., Raspe, E., Schoonjans, K., Lefebvre, A., Saladin, R., Najib, J., Laville, M., Fruchart, J., Deeb, S., Vidal-Puig, A., Flier, J., Briggs, M., Staels, B., Vidal, H. and Auwerx, J. (1997): The organization, promoter analysis, and expression of the human PPARg gene. Journal of Biological Chemistry. 272, 18779-18789.
6- Feige, JN., Gelman, L., Michalik, L., Desvergene, B., Wahli, W. (2006): From molecular action to physiological outputs: peroxisome proliferator-activated receptors are nuclear receptors at the crossroads of key cellular functions. Progress in lipid Research. 45:120-135.
7- Ghasemi, S., Ghaedi, K., Nasr-Esfahani, M.H., Esmaeili, A., Tanhaie, S., Rabeei, F., Karbalaii, K., and Baharvand, H. (2009): Cloning of mouse
PPARγ1 cDNA in pEGFP-C1 expression vector. University of Isfahan Biology Journal. Submitted.
8- Mangelsdorf, DJ, T., Beato, M., Herrlich, P., Schutz G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, E., Chambon, P., Evans, RM. (1995): The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83:835-839.
9- Tontonoz, P., Nagy, L., Alvarez, J.G., Thomazy, V.A., Evans, R.M. (1998): PPARγ promotes monocyte/macrophage differentiation and uptake of oxidized LDL. Cell. 93, 241–252.
10- Vidal-Puig, A., Considine, R., Jimenez-Linan, M., Werman, A., Pories, W., Caro, J. and Flier, J. (1997): Peroxisome proliferator–activated receptor gene expression in human tissues. The Journal of clinical investigation. 99, 2416-2422.
11- Wada, K., Nakajima, A., Katayama, K., Kudo, C., Shibuya, A., Kubota, N., Terauchi, Y., Tachibana, M., Miyoshi, H., Kamisaki, Y., Mayumi, T., Kadowaki, T. and Blumberg, R. (2006): Peroxisome proliferator-activated receptor γ-mediated regulation of neural stem cell proliferation and differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281, 12673-12681.
12- Woodsa, J.W., Tanenb, M., Figueroac, D.J., Biswasb, C., Zycbanda, E., Mollerb, D.E., Austinc, C.P., Berger, J.P. (2003): Localization of PPARγ in murine central nervous system: expression in oligodendrocytes and neurons. Brain Research. 975, 10–21.
13- Zhu, Y., Alvares, K., Huang, Q., Rao, M. and Reddy, J. (1993): Cloning of a new member of the peroxisome proliferator-activated receptor gene family from mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 268, 26817-26820.
_||_