ارزیابی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از پرندگان زینتی در اصفهان

محورهای موضوعی : میکروبیولوژی

شایان ارباب زاده ¹ , مجید غلامی آهنگران ²

1 - دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.
2 - بیماریهای طیور،دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی

تاریخ دریافت : 1401/07/14 تاریخ پذیرش : 1402/03/08 تاریخ انتشار : 1403/05/29

کلید واژه: اشریشیاکلی, ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی, پرندگان زینتی,

چکیده مقاله :

به منظور ارزیابی میزان مقاومت آنتی بیوتیکی و ژن های اصلی دخیل در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی علیه سولفانامیدها و فلوروکینولون ها، 50 سویه اشریشیاکلی جدا شده از کبد و قلب پرندگان زینتی جمع آوری شد. پس از تست های تکمیلی میکروبی و بیوشیمیایی و تایید کلنی باکتری ها، به خالص سازی کلنی ها پرداخته شد. بعد از آن، کلنی های خالص بر روی محیط کشت مولر هینگتون کشت شد و با آنتی بیوتیک های تجاری دیسک گذاری شد و تست حساسیت آنتی بیوتیکی انجام شد. در مرحله بعد از باکتری های خالص شده DNA استخراج شد و با پرایمر های اختصاصی به تکثیر ژن های qnrA و Sul1 پرداخته شد. نتایج نشان داد 80 درصد باکتری های جداشده به حداقل 2 آنتی بیوتیک مقاوم هستند و 12 درصد سویه ها به 13 آنتی بیوتیک مورد بررسی مقاوم هستند. در این مطالعه بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به تتراسایکلین و انروفلوکساسین و کمترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به جنتامایسین و لینکواسپکتین مشاهده شد. بررسی ژن های مقاومت نشان داد که حدود 71 درصد سویه های مقاوم علیه انروفلوکساسین واجد ژن qnrA و 64 درصد سویه های مقاوم علیه سولفانامیدها بعلاوه تری متوپریم حاوی ژن Sul1 بودند. در این بررسی سویه های مقاوم فاقد ژن های مقاومت نیز یافت شد که نشان از اهمیت سایر ژن های مقاومت در بروز مقاومت علیه سولفانامید ها و فلوروکینولون ها است. لذا به نظر می رسد با توجه به تنوع ژن های دخیل در مقاومت آنتی بیوتیکی، برای ارزیابی مقاومت آنتی بیوتیکی ارزیابی فنوتیپی کارایی بالاتری داشته باشد.

متن کامل:



ارزیابی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از پرندگان زینتی در اصفهان

 

شایان ارباب زاده1، مجید غلامی آهنگران2*، آسیه احمدی دستگردی3

 

1- دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.

2- دانشیار، گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.

3- استادیار، گروه صنایع غذایی، واحد اردستان، دانشگاه آزاد اسلامی، اردستان، ایران.

*مولف مسئول: مجید غلامی آهنگران، دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه ازاد اسلامی، شهرکرد، ایران. پست الکترونیک:[e-mail]

 

چکیده 

فلوروکینولون ها و سولفونامیدها به طور عمده در درمان بیماری های عفونی طیور و پرندگان زینتی استفاده می شوند و از منظر بهداشت عمومی نیز واجد اهمیت هستند. به منظور ارزیابی میزان مقاومت آنتی بیوتیکی و ژن های اصلی دخیل در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی علیه سولفونامیدها، آمینوگلیکوزیدها و فلوروکینولون ها، 50 سویه اشریشیاکلی جدا شده از کبد و قلب پرندگان زینتی جمع آوری شد. پرگنه‌های جدا شده با تست های تکمیلی میکروبی و بیوشیمیایی تایید و خالص سازی شد. بعد از آن، کلنی های خالص بر روی محیط کشت مولر هینتون کشت داده شد و با آنتی بیوتیک های تجاری دیسک گذاری شد و تست حساسیت آنتی بیوتیکی انجام شد. در مرحله بعد از باکتری های خالص شده DNA استخراج شد و با پرایمر های اختصاصی به تکثیر ژن های Aac(3)-IV، qnrA و Sul1 پرداخته شد. نتایج نشان داد 80 درصد باکتری های جداشده به حداقل 2 آنتی بیوتیک مقاوم هستند و 12 درصد سویه ها به 13 آنتی بیوتیک مورد بررسی مقاوم هستند. در این مطالعه بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به تتراسایکلین و انروفلوکساسین و کمترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به جنتامایسین و لینکواسپکتین مشاهده شد. بررسی ژن های مقاومت نشان داد که حدود 71 درصد سویه های مقاوم علیه انروفلوکساسین واجد ژن qnrA و 64 درصد سویه های مقاوم علیه سولفونامیدها بعلاوه تری متوپریم حاوی ژن Sul1 بودند. همچنین، 33 درصد سویه های مقاوم علیه جنتامایسین حامل ژن Aac(3)-IV  بودند. در این بررسی سویه های مقاوم فاقد ژن های مقاومت نیز یافت شد که نشان از اهمیت سایر ژن های مقاومت در بروز مقاومت علیه سولفونامید ها و فلوروکینولون ها است. لذا با توجه به درصد بالای مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از پرندگان زینتی در تست های معمول آنتی بیوگرام و با روش مولکولی، به نظر می رسد عدم موفقیت درمان بیماری های عفونی در این پرندگان ممکن است به دلیل وجود مقاومت آنتی بیوتیکی گسترده و احتمال انتشار ژن های مقاومت باشد.

واژگان کلیدی: اشریشیاکلی، پرندگان زینتی، ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی.

 

 مقدمه

جنس اشرشیا، یکی از اعضاي خانواده انتروباکتریاسه است که به عنوان جزئی از فلور طبیعی در روده بزرگ انسان و حیوانات وجود دارد. اشریشیاکلي، یک باسیل گرم منفی تاژك دار و متحرك است که بعضی از سویه های آن کپسول دارند (15). این باکتری به عنوان عضو مهم فلور طبیعی روده، در طول عمر حضور دارد. این باکتری علاوه بر مشکلات گوارشی، می تواند به صورت فرصت طلب در خارج از دستگاه گوارش سبب بیماري‌هایی مانند بیماري‌هاي دستگاه ادراري گردند و به عنوان یک باکتري فرصت طلب سبب عفونت‌هاي زخم، پنومونی، مننژیت و سپتی سمی در انسان شوند. در بررسی ميكروبي، حضور اشریشیاکلي شاخص قابل اطمينان از آلودگي مدفوعي آب است و خطر ابتلا به بيماري هاي منتقله از طریق آب را نشان می‍‍‍‍‍‍دهد (21). 

کلی باسیلوز یکی از مهم‌ترین بیماري‌هاي ماکیان است که توسط سویه‌هاي مختلف اشریشیاکلی ایجاد می شود. این بیماری در پرندگان عمدتاً با وجود ضایعات پری کاردیت، پری هپاتیت، پری تونیت و سپتی سمی مشخص می‌شود. تلفات، دارو درمانی، کاهش رشد و ضریب تبدیل غذایی و نیز افزایش استعداد به سایر بیماری‌های عفونی  از دیگر مشخصه‌های این بیماری است (11، 15).  آنتی بیوتیک‌ها به طور وسیع براي درمان و کاهش خسارات اقتصادی ناشی از تلفات در بیماری کلی باسیلوز، در پرندگان استفاده می‌شوند. علاوه بر آن، آنتی بیوتیک‌ها به عنوان محرک رشد و پیشگیری از بیماری‌های عفونی استفاده می‌شوند. مصرف گسترده و بعضاً طولانی مدت با عدم رعایت دوزهای موثر می‌تواند باعث مقاومت پیش رونده علیه آنتی بیوتیک‌ها شود. مبناي ژنتیکی بروز مقاومت آنتی بیوتیکی مشخص است و بیشتر بین یک گونه یا بین انواع مختلف باکتري‌ها توسط اجزاي ژنتیکی پلاسمید، اینتگرون و ترانسپوزون قابل انتقال است ( (14، 15). پلاسمیدها اجزای خارج کروموزومی هستند که می‌توانند به طور مستقل تکثیر کنند. ترانسپوزون‌ها توالی کوتاهی از مولکولDNA  موجود در پلاسمید هستند که از طریق ترانسپوزیشن به سایر پلاسمیدها و یا کروموزوم ها منتقل می‌شوند (14، 23). فاکتورهای انتقال مقاومت می‌توانند مسئول مقاومت نسبت به یک یا چند آنتی بیوتیک باشند. به طور کلی برای انتقال افقی مواد ژنتیکی و پلاسمیدها از یک باکتری به باکتری دیگر و ایجاد مقاومت روش‌های مختلفی مانند القا یا جابه‌جایی، الحاق، تغییر شکل و تغییر محل وجود دارد که در نهایت می‌تواند باعث تولید یک آنزیم خاص، تغییر در نفوذ پذیری میکروارگانیسم نسبت به دارو، انتقال فعال دارو به خارج، تغییر در گیرنده‌های دارویی و تغییر مسیر متابولیکی در باکتری مقاوم و تغییر در آنزیم هدف شود (5، 9).

مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها به خصوص مقاومت چند دارویی و  پتانسیل دریافت فاکتورهاي مقاومت توسط باکتري‌هاي انسانی یک نگرانی بهداشتی در تمام کشورها است. استفاده گسترده از آنتی بیوتیک‌های متنوع در طول دوره پرورش پرندگان زینتی به منظور کنترل بیماری‌های عفونی زمینه را برای بروز مقاومت میکروبی چندگانه فراهم کرده است (5). از طرفی انتقال پلاسمیدهای حامل ژن مقاومت ممکن است حامل چند ژن مقاومت باشد یا اینکه یک ژن، پروتئین های مختلفی را کد کند که عملکرد چندگانه داشته باشند و به طور همزمان باکتری، تحمل بالایی را نسبت به چند آنتی بیوتیک نشان دهد. به عنوان مثال ممکن است ژن‌های مقاومت نسبت به فلوروکینولون‌ها در پلاسمیدهای حاوی چند ژن مقاومتی یافت می‌شوند. این ژن­ها شامل بتالاکتامازهای وسیع الطیف، آنزیم‌های ampc و کارباپنم‌ها می‌باشد (16). همچنین ژن کد کننده واریته ای از آمینوگلیکوزید استیل ترانسفراز به نام acc(6)-Ib-cr دارای عملکرد دوگانه است و علاوه بر ایجاد مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزیدها در ایجاد مقاومت علیه فلوروکینولون‌ها نیز اثر دارد (16). این ژن درون کاست‌های ژنی مرتبط با انتگرون‌های واقع در پلاسمیدهای دارای مقاومت چندگانه یافت می‌شود که انتقال این ژن‌ها به محصولات غذایی انسان می تواند باعث بروز مقاومت آنتی بیوتیکی گسترده علیه آنتی بیوتیک‌های وسیع الطیف در درمان بیماری‌های عفونی انسان مانند فلوروکینولون‌ها شود. قبلاً نشان داده شده که مقاومت‌های چندگانه در اشریشیاکلی امکان پذیر است و گزارش‌های متفاوتی در اشریشیاکلی جدا شده از موارد بیماری پرندگان و گوشت طیور از ایران و سراسر جهان وجود دارد (3، 10 و 11) که نشان دهنده فراگیر بودن این خطر جدی است.

مقاومت باکتری نسبت به سولفامیدها معمولاً توسط ژن‌های Sul1، Sul2 و Sul3 ایجاد می‌شود که در باکتری‌های گرم منفی مانند اشریشیاکلی در انسان و حیوان وجود دارد. این ژن‌ها ازطریق ترانسپوزون و پلاسمید های بزرگ قابل انتقال هستند (13). در خانواده انتروباکتریاسه مقاومت در برابر سولفونامیدها توسط 3 ژن کنترل می‌شود. ژن Sul1 قسمتی از اینتگرون کلاس یک هست که شایع‌ترین اینتگرون جداشده از آنتروباکتریاسه‌ها هست به همین علت Sul1 بارزترین نقش را در ایجاد مقاومت نسبت به سولفونامیدها دارد (5). مقاومت نسبت به فلوروکینولون‌ها نیز با ژن‌های مختلفی مانندqnrA،  qnrB، qnrC، qnrD، qnrSو qnrVو چندین نوع دیگر ایجاد می‌شود. ژن­های مقاوم نسبت به کوینولون ها در جدایه های مختلف آنتروباکتریاسه در سراسر جهان یافت شده اند که بیشترین آن در اشریشیاکلی عنوان شده است (7). پروتئین خالص شده qnr به دو آنزیم DNA ژیراز و توپوایزومراز ۴ به منظور ممانعت از عمل آنتی بیوتیک­های کینولون باند شده و از آن‌ها محافظت می­کند و باعث ایجاد مقاومت می‌شود (24). 

هدف از این پژوهش بررسی و تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی در اشریشیاکلی جدا شده از پرندگان زینتی تلف شده در اصفهان است.

 

مواد و روش ها

جمع آوری نمونه

در این پژوهش مقطعی طی مدت یک سال، از فروردین 1400 تا فروردین 1401 از بین مجموع سویه‌های اشریشیاکلی جدا شده از پرندگان زینتی تلف شده و ارجاع شده به آزمایشگاه ها و کلینیک های خصوصی دامپزشکی، 50 سویه به طور تصادفی انتخاب شد. سویه های انتخاب شده از سطح قلب و کبد با علایم پرخونی، پری هپاتیت و پری کاردیت جداسازی شده بودند. پرندگان زینتی نمونه گیری شده از خانواده طوطی سانان شامل مرغ عشق، کاسکو، طوطی سبز، عروس هلندی، و طوطی کوتوله برزیلی و از خانواده گنجشک سانان شامل قناری و فنچ بودند.

 

شناسایی اشریشیاکلی

به منظور شناسايي باكتري اشریشياكلي در نمونه مورد نظر با سواب يا انس استريل در كنار شعله با تلقيح بر روي نمونه مورد نظر، بر روي محيط كشت مك کانکی بصورت خطي كشت داده شد و به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتي گراد نگهداري شد. در صورت رويت شدن پرگنه‌هاي لاكتوز مثبت (صورتي رنگ)، با رنگ آمیزی گرم، باسیل های گرم منفی تایید شد. از پرگنه‌هاي مشكوك بر روی محیط ائوزین متیلن بلو (Eosin methylene blue)  EMBبصورت خطي كشت داده شده و به مدت 24 ساعت در دماي 24 درجه سانتي گراد انكوبه شد. پرگنه‌هاي لاكتوز مثبت كه بر روي محيط EMB ايجاد جلاي سبز فلزي کردند به صورت اوليه به عنوان باكتري اشریشياكلي شناسايي شدند. سپس بر روي اين پرگنه‌ها تستهاي افتراقي IMVIC انجام شد. پرگنه‌هایی که از لحاظ تست‌هاي بيوشيميايي توليد ايندول، احياي متيل رد،VP و احياي سيترات به صورت مثبت، مثبت، منفي، منفي باشند به عنوان اشريشياكلي شناسايي می‌شوند (5). 

 

تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی  

برای تعیین حساسیت باکتری جدا شده نسبت به داروهای آنتی بیوتیک‌های رایج، از روش انتشار دیسکی ساده به روش استاندارد کربی بوئر استفاده شد (8). معمولا" این روش بر اساس اندازه گیری قطر هاله عدم رشد باکتری  بر روی محیط کشت جامد استوار است. 

در این آزمون از محیط کشت مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) و دیسک های آنتی بیوتیکی (شرکت پادتن طب، ایران) استفاده شد که شامل: انروفلوکساسین(5 میکروگرم)، سولفونامید + تری متوپریم، فلورفنیکل(30 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم)، اکسی تتراسیکلین(30 میکروگرم)، لینکواسپکتین(200/15 میکروگرم)، داکسی سیکلین(30 میکروگرم)، دیفلوکساسین(10 میکروگرم)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم)، نئومایسین(30 میکروگرم)، کلستین (10 میکروگرم)، آمپی سیلین (10 میکروگرم)، آموکسی سیلین (25 میکروگرم) است.

برای انجام آزمایش انتشار از دیسک، هر جدایه باکتری را بر روی محیط مک کانکی آگار به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند. سپس 4 تا 5 پرگنه از محیط مک کانکی آگار به لوله آزمایش حاوی TSBمنتقل و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد برای تهیه کدورت نیم مک فارلند انکوبه شدند.

پس از آن با سواب استریل از سوسپانسیون باکتریایی نیم مک فارلند روی محیط مولر هینتون آگار کشت خطی داده شد. پس از گذشت تقریبا 10 دقیقه، دیسک های آنتی بیوتیکی بر روی محیط مولر هینتون تلقیح شده قرار داده شد و پلیت ها به مدت 18 ساعت در دمای 35 درجه سانتی گراد انگوبه گردیدند. سپس قطر هاله عدم رشد هر دیسک اندازه گیری و در نهایت میزان مقاومت و حساسیت هر جدایه با مقایسه با استاندارد جهانی قرائت شد (CLSI).

 

 شناسایی ژن‌های مقاومت علیه آنتی بیوتیک ها

استخراج DNA

در این بررسي استخراج DNA از جدایه هاي مورد نظر به روش جوشانیدن طبق دستورالعمل زیر انجام شد  (1).

500 میكرولیتر PBS را در داخل میكروتیوب یک و نیم میلي لیتری ریخته و سپس چند لوپ از كشت جامد)محیط لوریا برتاني 24 ساعته) جدایه هاي مورد نظر به میكروتیوب اضافه و سوسپانسیون یكنواختي از آن تهیه گردید.

میكروتیوبهاي حاوي سوسپانسیون در سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه قرار داده و بعد از این مرحله مایع رویي دور ریخته شد.

مراحل یک و دو تكرار گردید.

به میكروتیوب 500 میكرولیتر بافر تریس ادتا (Tris-EDTA; TE) اضافه شد و سپس سوسپانسیون یكنواخت گردید.

 میكروتیوب حاوي سوسپانسیون به مدت 10 دقیقه در بن ماري جوش قرار داده شد.

بعد از عمل لیز باكتري به وسیله جوشانیدن، میكروتیوب در سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه قرار داده شد. مقدار 30 میكرولیتر از میكروتیوب برداشته و به میكروتیوب جدید منتقل و سپس این میكروتیوب در یخچال 20- درجه سانتیگراد براي مراحل بعدي آزمایش نگهداري گردید.

 

مراحل انجام PCR

به منظور شناسایی وضعیت مقاومت باکتریایی نسبت به آنتی بیوتیکهای دسته فلوروکینولونها، سولفونامیدها و جنتامایسین، ژن های مربوط به مقاومت نسبت به کینولون ها (qnr)، سولفونامیدها (Sul1) و جنتامایسین (Aac-3-IV) در نمونه های مورد بررسی مورد تکثیر قرار گرفت.

واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل5/2 میکرولیتر PCR بافر X10، 5/1 میلی مول کلرید منیزیم، 2/0 میلی مول dNTP،  100 نانوگرم DNA الگو، 5/0 میکرومول از هر پرایمر، و یک واحد آنزیم Taq Polymerase در حجم نهایی 25 میکرولیتر آماده سازی شد.

واکنش PCR در دستگاه ترموسیکلر اپندورف آلمان انجام شد.

برنامه دمایی واکنش PCR به صورت واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی گراد برای 3 دقیقه، و 35 سیکل شامل واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتی گراد برای 60 ثانیه، همسرشت سازی در دمای 50  (برای تکثیر ژن qnrA)، 47 (برای تکثیر ژن Sul1) و 55 (برای تکثیر ژن Aac(3)-IV) درجه سانتی گراد برای90 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه سانتی گراد برای 60 ثانیه به همراه گسترش نهایی در 72 درجه سانتی گراد برای 10 دقیقه انجام شد.

محصول PCR رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید بر روی ژل آگارز 5/1% (3/0 گرم آگارز در 25 میلی لیتر بافر 1X TBE حل شد) الکتروفورز شد و با UV doc مشاهده و ثبت شد.

 

جدول شماره1- اختصاصات پرایمرهای مورد استفاده در شناسایی ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در اشریشیاکلی

آنتی بیوتیک	ژن مقاومت	توالی (`5 به `3)	اندازه محصول	منبع
کینولون ها	qnrA	F:GGGTATGGATATTATTGATAAAG R:CTAATCCGGCAGCACTATTTA	670	7
سولفونامیدها	Sul1	F:TTCGGCATTCTGAATCTCAC R:ATGATCTAACCCTCGGTCTC	822	35
جنتامایسین	Aac(3)-IV	F: CTTCAGGATGGCAAGTTGGT R:TCATCTCGTTCTCCGCTCAT	286

 

نتایج

 شناسایی اشریشیاکلی

سویه‌های مورد بررسی از جهت خصوصیات میکروسکوپی، کشت بر روی محیط مک کانکی و EMB مورد بررسی قرار گرفتند و پس از تایید، تست‌های بیوشیمیایی IMVIC در مورد آنها انجام شد. تمامی 50 سویه مورد بررسی به صورت باسیل گرم منفی، با ایجاد رنگ ارغوانی بر روی محیط کشت مک کانکی و ایجاد جلای سبز فلزی بر روی EMB تایید اولیه شدند و تست IMVIC را به صورت ایندول مثبت، MR مثبت، VP منفی و سیترات منفی نشان دادند.

 

 مقاومت آنتی بیوتیکی

پس از انجام آنتی بیوگرام، سویه های مورد نظر کمترین مقاومت آنتی بیوتیکی را نسبت به جنتامایسین (6 درصد) و بیشترین مقاومت را نسبت به تتراسایکلین (78 درصد) نشان دادند. در این بررسی 80 درصد سویه ها حداقل به دو آنتی بیوتیک مقاومت نشان دادند و 12 درصد سویه‌ها به تمامی 13 آنتی بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی بیوگرام، مقاومت نشان دادند. نتایج آنتی بیوگرام در جدول 2 آمده است.

 

جدول 2- فراوانی (درصد) مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از تلفات پرندگان زینتی در اصفهان

 

آنتی بیوتیک	مقاوم	نیمه حساس	حساس
انروفلوکساسین	38 (76)*	7 (14)	5 (10)
سولفونامید+ تری متوپریم	28 (56)	7 (14)	15 (30)
فلورفنیکل	27 (54)	4 (8)	19 (38)
تتراسایکلین	39 (78)	6 (12)	5 (10)
آمپی سیلین	27 (54)	3 (6)	10 (20)
جنتامایسین	3 (6)	1 (2)	46 (92)
نئومایسین	30 (60)	10 (20)	10 (20)
لینکواسپکتین	19 (38)	6 (12)	25 (50)
اکسی تتراسایکلین	37 (74)	3 (6)	10 (20)
کلرامفنیکل	22 (44)	8 (16)	20 (40)
کلستین	27 (54)	12 (24)	11 (22)
دیفلوکساسین	23 (46)	7 (14)	20 (40)
داکسی سیکلین	20 (40)	5 (10)	25 (50)

·       داده ها به صورت فراوانی و درصد در داخل پرانتز ارائه شده است.

 

 ردیابی ژن‌های مقاومت آنتی بیوتیکی

 

در الکتروفورز محصول PCR قطعات ژنومی 822 (شکل 1)، 670 (شکل 2) و 286 (شکل 3) جفت بازی مربوط به  ژن های Sul1، qnrA و Act(3)-IV تکثیر شد.

الکتروفورز محصول PCR نشان می دهد از مجموع 50 سویه اشریشیاکلی مورد بررسی،  36 درصد سویه ها (18 سویه) حاوی ژن Sul1، 54 درصد سویه ها (27 سویه) حاوی ژن qnrA و 2 درصد سویه ها (یک سویه) حامل ژن Act(3)-IV بودند (جدول 3). در این بررسی 28/64 درصد سویه های مقاوم به سولفونامید بعلاوه تری متوپریم (18 سویه از 28 سویه) حامل ژن Sul1 و 71 درصد سویه های مقاوم به انروفلوکساسین (27 سویه از 38 سویه) حامل qnrA و 33 درصد سویه های مقاوم به جنتامایسین (یک سویه از سه سویه) حامل Act(3)-IV بودند. 10 سویه از 28 سویه اشریشیاکلی مقاوم به سولفونامیدها (71/35 درصد) حامل ژن Sul1 و 10 سویه از 38 سویه مقاوم به انروفلوکساسین (31/26 درصد) حامل ژن qnrA نبودند. همچنین 2 سویه از 3 سویه اشریشیاکلی مقاوم به جنتامایسین حامل ژن Act(3)-IV نبودند.

 

جدول 3- ارزیابی مقاومت فنوتیپی و ژنوتیپی آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی

 

دسته آنتی بیوتیکی	فنوتیپ / ژنوتیپ	فراوانی (درصد)
فلوروکینولون	فنوتیپ (انروفلوکساسین)	38 (76)
	ژنوتیپ (qnrA)	27 (54)
سولفونامید	فنوتیپ (سولفونامید)	28 (56)
	ژنوتیپ (Sul1)	18 (36)
آمینوگلیکوزید	فنوتیپ (جنتامایسین)	3 (6)
	ژنوتیپ (Act(3)-IV)	1 (2)

 

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن Sul1 (ستون 1 و 2: کنترل مثبت، ستون 3 تا 6: نمونه های مثبت 822 جفت بازی، ستون 7: مارکر، ستون 8: کنترل منفی).

 

شکل 2-الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن  qnrA (M: مارکر، ستون 1 تا 3: نمونه های مثبت 670 جفت بازی، ستون 4: کنترل منفی)

 

 

 

شکل 3- الکتروفورز محصول PCR مربوط به تکثیر ژن Aac(3)-IV (M: مارکر، ستون 1: نمونه مثبت 286 جفت بازی، ستون 2: کنترل منفی).

 

بحث

نتایج به دست آمده از آنتی بیوگرام سویه‌های اشریشیاکلی جدا شده از موارد تلفات پرندگان زینتی در اصفهان نشان می‌دهد که درصد بالایی از جدایه‌ها به آنتی بیوتیک های معمول و رایج در درمان بیماری های عفونی پرندگان و بعضاً دسته آنتی بیوتیک‌های مورد استفاده در کنترل بیماری‌های عفونی انسان مقاومت نشان می‌دهند. مقاومت بالای ۷۰ درصدی در تتراسایکلین و انروفلوکساسین و نیز مقاومت بالای ۵۰ درصدی در برابر سولفونامید به همراه تری متوپریم نشان دهنده مقاومت بالای جدایه‌های اشریشیاکلی  نسبت به آنتی بیوتیک های وسیع الطیف پرکاربرد است. برای مقایسه داده های بدست آمده با سایر مطالعات مشابه بر روی پرندگان زینتی مطالعه جامعی در خصوص مقاومت آنتی بیوتیکی در پرندگان زینتی در ایران یافت نشد اما مطالعات دیگری در خصوص پرندگان صنعتی موجود است (10، 19 و 26) که تا حدودی از الگوی مشابه تبعیت می‌کند و نشان از توسعه مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های اشریشیاکلی دارد. مصرف گسترده انروفلوکساسین به تنهایی و مصرف همزمان با برخی از خانواده‌های آنتی‌بیوتیکی می‌تواند دلیل این مقاومت بالا باشد که در درمان بیماری های عفونی پرندگان زینتی در سراسر ایران مورد استفاده قرار می گیرد. علاوه بر آن، مطالعات خارج از کشور نیز نشان می‌دهد که این آنتی بیوتیک در سایر کشورها نیز از مقاومت بالایی برخوردار است و بیشترین درصد مقاومت را به خود اختصاص داده است (7، 22 و 23). 

در مطالعه حاضر کمترین مقاومت نسبت به جنتامایسین (۶ درصد) و بعد از آن نسبت به لینکواسپکتین (38 درصد) مشاهده شده است. در سایر مطالعات در داخل کشور نیز کمترین مقاومت نسبت به لینکواسپکتین گزارش شده شده است (2، 10، 20 و 26). کمترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به جنتامایسین در مطالعه اخیر می‌تواند به دلیل مصرف کمتر جنتامایسین در پرندگان باشد چرا که این دارو به شکل تزریقی است و کمتر در پرندگان استفاده می شود. بهرحال، وجود مقاومت بالای آنتی بیوتیکی نسبت به انروفلوکساسین، سولفونامید به همراه متوپریم، آمپی سیلین و داکسی سایکلین می‌تواند به دلیل استفاده متداول از این آنتی بیوتیک ها در درمان پرندگان زینتی باشد که تجویز پی در پی این آنتی بیوتیک‌ها، بعضاً بدون انجام تست‌های حساسیت آنتی بیوتیکی باعث ظهور و گسترش میکروارگانیسم های مقاوم به این آنتی بیوتیک‌ها شده است.

از آنجاییکه که ژن‌های مقاومت آنتی بیوتیکی در گسترش مقاومت در بین میکروارگانیسم‌ها نقش عمده‌ای دارند در مطالعه اخیر به پایش ژن‌های مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک‌های فلوروکینولون، سولفونامید و جنتامایسین که از نظر دامپزشکی و پزشکی واجد اهمیت هستند پرداخته شد. در مطالعه اخیر نیز میزان مقاومت نسبت به سولفونامیدها در تست آنتی بیوگرام ۵۰ درصد بوده است که از مجموع ۵۰ سویه  اشریشیاکلی جدا شده  18 سویه یا به عبارتی 36 درصد واجد ژن Sul1 بودند. در این مطالعه 64 درصد سویه های با فنوتیپ مقاومت علیه سولفونامیدها (18 سویه از 28 سویه) واجد ژن Sul1 بودند. وجود ژن Sul1 در 64 درصد سویه‌های مقاوم علیه سولفونامیدها نشان می‌دهد که تنها وجود Sul1  برای بروز مقاومت کافی نیست و ممکن سایر ژن ها مثل Sul2  و Sul3 نیز نقش داشته باشند. بهر حال مطالعات گذشته نشان می‌دهد که در بین ژن های مقاومت به سولفونامیدها Sul1 از فراوانی بالاتری برخوردار هست و قبلاً نیز اهمیت ژن Sul1 در ایجاد مقاومت علیه سولفونامیدها در اشریشیاکلی نشان داده شده است که حاکی از اهمیت و فراوانی بالاتر این ژن نسبت به سایر ژن های مقاومت در برابر سولفونامیدها بوده است (3). قدمت استفاده از سولفامیدها در درمان بیماریهای پرندگان و امکان مصرف همزمان این آنتی بیوتیک با سایر آنتی بیوتیک های متداول می‌تواند دلیل گستردگی ژن های مقاومت در بین سویه‌های اشریشیاکلی باشد. 

از طرفی، درصدهای بالای ردیابی ژن های مقاومت در مطالعه اخیر دلالت بر گسترش و توسعه مقاومت در اشریشیاکلی دارد که وجود ژن‌های مقاومت و میزان مقاومت آنتی بیوتیکی در این میکروارگانیسم به عنوان شاخصی برای ارزیابی میزان مقاومت آنتی بیوتیکی در انسان و حیوانات به کار برده می شود به طوری که سویه‌های حامل ژن های مقاومت و بیماری زا می توانند به عنوان مخزن ژن‌های مقاومت در محصولات طیور و مصرف کننده نهایی یعنی انسان باشند (5).

یکی از چالش‌های مهم در کنترل بیماری های عفونی در انسان و حیوانات مقاومت‌های چند دارویی هست که در مطالعه اخیر 80 درصد سویه ها حداقل به دو آنتی بیوتیک مقاومت نشان دادند و 12 درصد سویه ها به تمامی 13 آنتی بیوتیک مورد استفاده در تست آنتی بیوگرام، مقاومت نشان دادند. در همین رابطه، Sigirci و همکاران در سال 2020  با بررسی 20 سواب کلواک از پرندگان زینتی به ظاهر سالم و بررسی الگوی مقاومت دارویی نشان دادند که 67 درصد سویه های اشریشیاکلی نسبت به 3 آنتی بیوتیک یا بیشتر مقاومت داشتند (22). علاوه بر آن، Sauarez Perez در 103 سویه اشریشیاکلی جدا شده از قناری به مقاومت چندگانه پرداخت و نشان داد 8/39 درصد حداقل به 3 آنتی بیوتیک مقاومت داشته اند (23). Horn و همکاران در سال 2015 نیز در 7/55 درصد سویه های اشریشیاکلی جدا شده از سواب کلواک و کالبدگشایی قناری های تلف شده مقاومت آنتی بیوتیکی چندگانه را گزارش نمودند (7).

بطورکلی این مطالعه نشان داد که مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های جدا شده از تلفات پرندگان بسیار گسترده است و در واقع مقاومت‌های بالایی نسبت به آنتی بیوتیک‌های متداول وجود دارد. مقاومت بالا دو نگرانی را به وجود می آورد اول اینکه مقاومت بالای آنتی بیوتیکی باعث عدم کارایی آنتی بیوتیک ها در کنترل بیماری‌های عفونی پرندگان می شود که منجر به تلفات و هزینه های بالای دارو درمانی می گردد و از طرفی دیگر، انتقال ژن های مقاومت به پاتوژن های انسانی، درمان بیماریهای عفونی را در انسان پیچیده می کند و نگرانی‌های جدی برای بهداشت عمومی ایجاد می کند. لذا توصیه بر این است که حتماً در موارد بیماری‌های عفونی حساسیت آنتی بیوتیکی سنجیده شود و براساس حساسیت آنتی بیوتیکی داروی مناسب انتخاب شود. علاوه بر آن با رعایت دوز و دوره مصرف، الزاماتی موجود در خصوص تجویز آنتی بیوتیک ها رعایت شود و تا حد امکان از داروهایی که در پزشکی استفاده می شود استفاده نگردد. 

 

 

منابع

 

1. Ahmed, O. B., and Dablool, A. S. (2017). Quality improvement of the DNA extracted by boiling method in gram negative bacteria. International Journal of Bioassays, 6: 5347-5349.

2. Bozorgmehri Fard, M.H., Karimi, V., Fathi, E., Behmanesh, R., (2007). Bacteriologic survey on infectious cellulitis in broiler chickens in Masjid Soleiman slaughterhouse, Iran. Archives of Razi Institute, 62: 91-95.

3. Costa, D., Vinue, L., Poeta, P., Coelho, A.C., Matos, M., and Saenz, Y. (2009). Prevalence of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli isolates in faecal samples of broilers. Veterinary Microbiology, 138: 339-344.

4. Ghaniei, A., Mojaverrostami, S., Lotfallahzadeh, B., Darzi Lemraski, M., Sepehrnia, P., and Imani Jajarmi, A., (2014). Geographical and seasonal variation in antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broiler chicken carcasses in Iran. European Journal of Experimental Biology, 4: 173-177.

5. Gholami-Ahangaran, M., and Zia-Jahromi, N., (2014). Identification of shiga toxin and intimin genes in Escherichia coli detected from canary (Serinus canaria domestica). Toxicology and industrial health, 30: 724-727.

6. Gregova, G., Kmetova, M., Kmet, V., Venglovsky, J., and Feher, A., (2012). Antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from a poultry slaughterhouse. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 19: 75-7.

7. Horn, R.V., Cardoso, W.M., Lopes, E.S., Teixeira, R.S., Albuquerque, Á.H., Rocha-e-Silva, R.C., and Bezerra, W.G., (2015). Identification and antimicrobial resistance of members from the Enterobacteriaceae family isolated from canaries (Serinus canaria). Pesquisa Veterinária Brasileira, 35: 552-556.

8. Hudzicki, J. (2009). Kirby-Bauer disk diffusion susceptibility test protocol. American society for microbiology, 15: 55-63.

9. Jacoby, GA., Strahilevitz, J., and Hooper, D.C., (2014). Plasmid-mediated quinolone resistance. Microbiology Spectrum, 2:100-110. 

10.Jafari, R., Ghanbarpour, R., Ghorbanpour Najaf Abadi, M., Mayahi, M., and Amani, A., (2015). Determination of antibiotic resistance patterns in Escherichia coli isolated from healthy and colisepticemic broiler chickens in Ahvaz. Iran Journal of Veterinary Microbiology,11: 109-117.

  11. Kashif, J., Buriro, R., Memon, J., Yaqoob, M., Soomro, J., and Dongxue, D., (2013). Detection of class 1 and 2 integrons, β-lactamase genes and molecular characterization of sulfonamide resistance in Escherichia coli isolates recovered from poultry in China. Pakistan Veterinary Journal, 33: 321-324.

12. Mooljuntee, S., Chansiripornchai, P., and Chansiripornchai, N., (2010). Prevalence of the cellular and molecular antimicrobial resistance against E. coli isolated from Thai broilers. The Thai Journal of Veterinary Medicine, 40: 311-315.

13. Mojaver Rostami, S., Ghaniei, A., and Mohammadi, V., (2018). Phenotypic and genotypic resistance of Escherichia coli isolated from broiler chickens of Urmia to sulfonamides. Iranian Veterinary Journal, 13: 86-91.

14. Miles, T., McLaughlin, W., and Brown, P. (2006). Antimicrobial resistance of Escherichia coli isolates from broiler chickens and humans. BMC Veterinary Research, 2: 2-7.

15. Nolan, L.K., Vaillancourt, J., Barbieri, N.L., Logue, C.M. (2020). Colibacillosis. In: Swayne, DE; Boulianne, M; Logue, CM; McDougald, LR; Nair, V and Suarez, DL (Eds.), Disease of Poultry. (14th Edn.), Massachusetts, W.B. Publishing. PP. 770-790.

16. Omidvar Panah, M., Najafi, M., and Peymani, A., (2018). Plasmid-mediated quinolones resistance in clinically important bacteria. Journal of Qazvin University of Medical Science, 22: 90-99.

17. Pomba, C., Rantala, M., Greko, C., Baptiste, K.E., Catry, B., Van, D., Sanders, P., (2017). Public health risk of antimicrobial resistance transfers from companion animals. Journal Antimicrobial Chemotherapy, 72: 957–968.

18. Ponce-Rivas, E., Muñoz-Márquez, M. E., and Khan, A.A., (2012). Identification and molecular characterization of class 1 integrons in multiresistant Escherichia coli isolates from poultry litter. Applied and Environmental Microbiology, 78: 5444-5447.

19. Rafiei Tabatabaei, R., and Nasirian, A., (2003). Isolation, identification and antimicrobial resistance patterns of Escherichia coli isolated from chicken flocks. Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics 2: 39-42.

20. Saberfar, E., Pourakbari, B., Chabokdavan, K., and Dolatshahi, F.T., (2008). Antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from Iranian broiler chicken flocks, 2005–2006. Journal of Applied Poultry Research, 17: 302-304.

21. Shahiri, M., Gholami-Ahangaran, M., Rahimi, E., (2018). The comparing of antibiotic resistance pattern in Escherichia coli isolates from chicken meat that reared under conventional and without antibiotic condition. Iran Journal of Food Microbiology, 5: 11-18.

22. Sigirci, B.D., Celik, B., Halac, B., Adiguzel, M.C., Kekec, I., Metiner, K., and Kahraman, B.B., (2020). Antimicrobial resistance profiles of Escherichia coli isolated from companion birds. Journal of King Saud University-Science, 32: 1069-1073.

23. Suárez-Pérez, A., Corbera, J.A., González-Martín, M., Tejedor-Junco, M.T., (2021). Multidrug-Resistant Phenotypes of Escherichia coli Isolates in Wild Canarian Egyptian Vultures (Neophron percnopterus majorensis). Animals, 11: 1692.

24. Tran, J.H., Jacoby, G.A., Hooper, D.C., (2005). Interaction of the plasmid-encoded quinolone resistance protein qnr with Escherichia coli DNA gyrase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49: 118-125.

25. Van, T.T.H., Chin, J., Chapman, T., Tran, L.T., Coloe, P.J., (20080. Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: An analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes.  International Journal of Food Microbiology, 124: 217-223.

26. Zahraei Salehi, T., and Farashi Bonab, S., (2006). Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains isolated from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. International Journal of Poultry Science, 5: 677-84.

 

 

The Evaluation of phenotype and genotype of antibiotic resistance in Escherichia coli strains isolated from companion birds in Isfahan

 

Shayan Arbabzadeh1, Majid Gholami-Ahangaran2, Asiye Ahmadi-Dastgerdi3

 

1- Graduated of Veterinary Medicine Faculty, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.

2- Associated Professor, Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.

3- Assistance Professor, Department of Food Science and Technology, Ardestan Branch, Islamic Azad University, Ardestan, Iran.

* Corresponding author: Majid Gholami-Ahangaran, Department of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran. Email: [e-mail]

 

Abstract

 

Fluoroquinolones and sulfonamides are mainly used in the treatment of infectious diseases of poultry and pet birds and are also important in public health. To evaluating the level of antibiotic resistance and the main genes involved in antibiotic resistance against sulfonamides, aminoglycosides and fluoroquinolones, 50 strains of Escherichia coli (E. coli) isolated from the liver and heart of pet birds were collected. The isolates were confirmed and purified with additional microbial and biochemical tests. After that, the pure colonies were cultured on Mueller Hinton's medium and disked with commercial antibiotics. In the next step, DNA was extracted from the purified bacteria and Aac (3)-IV, qnrA and Sul1 genes were amplified with specific primers. The results showed that 80% of the isolated bacteria are resistant to at least 2 antibiotics and 12% of the strains are resistant to 13 antibiotics. In this study, the highest antibiotic resistance to tetracycline and enrofloxacin and the lowest antibiotic resistance to gentamicin and lincospectin were observed. Examination of resistance genes showed that about 71% of the strains resistant to enrofloxacin contained the qnrA gene and 64% of the strains resistant to sulfonamides and trimethoprim contained the Sul1 gene. Also, 33% of gentamicin resistant strains carried the Aac(3)-IV gene. In this study, resistant strains without resistance genes were also found, which shows the importance of other resistance genes in the occurrence of resistance against sulfonamides and fluoroquinolones. Therefore, it seems that the failure to treat infectious diseases in pet birds may be due to the presence of widespread antibiotic resistance and the possibility of the spread of resistance genes.

 

Keywords: Escherichia coli, Pet birds, Antibiotic resistance genes.

---