مطالعه فلور میکروبی روده جوجه های محلی برای یافتن پروبیوتیک های باسیلوس سوبتلیس و باسیلوس کوآگولانس و بررسی تاثیر آن بر بیان ژن های بیماری زای ctxm و luxs در جدایه های بیماری زای اشریشیاکولی

محورهای موضوعی : مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

زهرا الهیان فیروز ¹ , مجید باصری صالحی ² , مسعود قانع ³

1 - گروه میکروب شناسی، دانشکده علوم، کشاورزی و فناوری‌های نوین، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز
2 - استادیار گروه میکروب شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد کازرون، دانشگاه آزاد اسلامی، کازرون، ایران
3 - دانشیار گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاداسلامی واحد تنکابن، ایران.

تاریخ دریافت : 1400/05/19 تاریخ پذیرش : 1400/10/30 تاریخ انتشار : 1400/12/01

کلید واژه: باسیلوس کوآگولانس, پروبیوتیک‌‌‌‌‌‌‌‌‌, اشریشیاکلی, luxs‌‌‌‌‌‌‌‌‌, باسیلوس سوبتلیس ctxm,

چکیده مقاله :

زمینه و هدف: از آنتی‌بیوتیک‌ها به‌طور گسترده‌ای در سراسر جهان استفاده می‌شود. بااین‌حال، به دلیل ظهور مقاومت آنتی‌بیوتیکی در طیف وسیعی از میکروارگانیسم‌ها، استفاده از آن‌ها در سطح جهانی دچار شکست بزرگی شده است. استفاده از پروبیوتیک‌ها به‌عنوان درمان مکمل و جایگزین برای آنتی‌بیوتیک‌ها مطرح‌شده‌اند. هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات پروبیوتیک‌های جداشده از مرغ‌های محلی بر بیان ژن‌های luxS, ctxM در اشریشیاکلی ‌مقاوم به درمان بود. روش کار: 300 نمونه مدفوعی در فاصله اردیبهشت تا مهرماه سال 1399 از بیماران مراجعه‌کننده به بیمارستان امام خمینی تهران اخذ شد و با محیط‌های کشت اختصاصی و آزمایش‌های بیوشیمیایی نمونه‌های اشریشیاکلی جداسازی شد و سپس توسط PCR با پرایمرهای اختصاصی وجود ژن‌های luxS و ctxM مورد شناسایی قرار گرفت. جهت استخراج سویه‌های بومی باسیلوس کوآگولانس و باسیلوس سوبتلیس محتویات روده تعداد 9 قطعه جوجه محلی که هیچ آنتی‌بیوتیکی مصرف نکرده بودند کشت، جداسازی و توسط روش‌های بیوشیمیایی و PCR شناسایی شد. سویه‌های تجاری باسیلوس سوبتلیس و باسیلوس کوآگولانس برای مقایسه اثرات با باکتری‌های بومی خریداری شده و در ادامه این سویه‌ها در کشت هم‌زمان با سویه‌های اشریشیاکلی مقاوم به درمان حاوی ژن‌های ctxm و luxs قرار گرفتند. جهت بررسی تأثیر این پروبیوتیک‌ها بر بیان ژن‌ها از ریل تایم PCR استفاده شد. یافته ها: از 300 نمونه مدفوعی گرفته‌شده 40 جدایه(5/7 درصد) اشریشیاکلی به دست آمد؛ که 13 نفر از نمونه‌ها(5/32 درصد) مربوط به بیماران سرپایی و 27 نفر را(5/67 درصد) بیماران بستری تشکیل می‌دادند. همه ایزوله‌ها از زنان و مردان با رنج سنی بین 21 تا 62 سال جداشده بودند. 4 سویه اشریشیاکلی جداشده از بیماران حامل ژن‌های ctxM, luxS, بودند. جداسازی باسیلوس کوآگولانس و باسیلوس سوبتلیس از نمونه‌ها با آزمایش‌های بیوشیمیایی و مولکولی تائید شد.‌‌‌‌‌‌‌‌ سویه تجاری باسیلوس کوآگولانس بیان ژن‌های، ctxM, luxS را به ترتیب به میزان 3/3‌‌‌‌‌‌‌‌‌، 2/7‌‌‌‌‌‌‌‌‌ برابر کاهش و سویه بومی بیان این ژن‌ها را به ترتیب 6/3‌‌‌‌‌‌‌‌‌، 2/2‌‌‌‌‌‌‌‌‌ برابر نسبت به گروه کنترل در باکتری اشریشیاکلی کاهش داد. نتایج آنالیز آماری نشان داد که بین حضور پروبیوتیک‌های بومی و تجاری موجود درکشت و کاهش بیان ژن‌های ctxM و luxS ارتباط ‌معنی‌داری وجود دارد. نتیجه‌‌‌‌‌‌‌‌‌گیری‌‌‌‌‌‌‌‌‌: مصرف مکمل باسیلوس کوآگولانس و باسیلوس سوبتلیس با کم کردن بیان ژن‌های مقاومت باعث افزایش تأثیر آنتی‌بیوتیک‌ها بر اشریشیاکلی مقاوم به درمان می‌شوند.

چکیده انگلیسی:

Inroduction & Objective: The aim of this study was to investigate the effects of probiotics isolated from local chickens on the expression of luxS, ctxM genes in resistant Escherichia coli.  Material and Methods: Biochemical tests of Escherichia coli samples were isolated and then the presence of luxS and ctxM genes was detected by PCR with specific primers. In order to extract the native strains of Bacillus coagulans and Bacillus subtilis, the intestinal contents of 9 local chickens were cultured, isolated and identified by biochemical and PCR methods. Results: Commercial strains of Bacillus subtilis and Bacillus coagulans were isolated along with isolates of resistant Escherichia coli strains containing ctxm and luxs genes. Real-time PCR was used to evaluate gene expression. From 300 fecal samples taken, 40 isolates(7.5%) of Escherichia coli were obtained; Four Escherichia coli strains were isolated from patients carrying ctxM and luxS genes. Isolates of Bacillus coagulans and Bacillus subtilis were confirmed by molecular experiments. Decreased by 2.2 times, equal to the control group in Escherichia coli. Conclusion: The results of statistical analysis showed that there was a significant relationship between the presence of native and commercial probiotics in culture and reduced expression of ctxM and luxS genes.

منابع و مأخذ:

1.Adjei-Fremah, S., Ekwemalor, K., Asiamah, EK., Ismail, H., Ibrahim, S., Worku, M. (2018). Effect of probiotic supplementation on growth and global gene expression in dairy cows. Journal of Applied Animal Research, 46(1); 257–263.

2.Ahmad , M., Khan, AU. (2019). Global economic impact of antibiotic resistance: A review. 2019 Epub.

3.Altun, GK., Erginkaya, Z. (2021). Identification and characterization of Bacillus coagulans strains for probiotic activity and safety. Epub.

4.Apajalahti, JH., Kettunen, A., Bedford, MR., Holben, WE. (2001). Percent G+ C profiling accurately reveals diet-related differences in the gastrointestinal microbial community of broiler chickens. Applied and Environmental Microbiology, 67(12); 5656–5667.

5.Asaithambi, N., Singh, SK., Singha, P. (2021). Current status of non-thermal processing of probiotic foods: A review. Epub.

6.Baho, S., Samarasinghe, S. (2018). Gene expression analysis of the AI-2-controlled genes and biofilm formation-related genes of the antibiotic-resistant Escherichia coli at Different Growth Stages.

7.Cotar, AI., Chifiriuc, MC., Dinu, S., Pelinescu, D., Banu ,O., Lazãr, V. (2010). Quantitative real-time PCR study of the influence of probiotic culture soluble fraction on the expression of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing genes. Romanian archives of Microbiology and Immunology, 69(4); 213–223.

8.Czarnik, AW., Mei, H-Y. (2007). How and Why to Apply the Latest Technology*. In: Taylor JB, Triggle DJ, editors. Comprehensive Medicinal Chemistry II. Oxford: Elsevier, 289–557.

9.Darvishi, N., Fard, NA., Sadrnia, M. (2021). Genomic and proteomic comparisons of bacteriocins in probiotic species Lactobacillus and Bifidobacterium and inhibitory ability of Escherichia coli MG 1655. 2021 Epub.

10.El-Saadony, MT., Alagawany, M., Patra, AK. (20121). The functionality of probiotics in aquaculture: An overview. Epub.

11.Federation, FWD. (2015). Communications Sessions 01-04. Epub.

12.Fu, L., Wang, S., Zhang, Z. (2019). Co-carrying of KPC-2, NDM-5, CTX-M-3 and CTX-M-65 in three plasmids with serotype O89: H10 Escherichia coli strain belonging to the ST2 clone in China. Epub.

13.Fu, P., Zhao, Q., Shi, L. (2021). Identification and characterization of two bacteriophages with lytic activity against multidrug-resistant Escherichia coli. Epub.

14.Goel ,N., Fatima, SW., Kumar, S., Sinha, R., Khare, SK. (2021). Antimicrobial resistance in biofilms: Exploring marine actinobacteria as a potential source of antibiotics and biofilm inhibitors. Epub.

15.Hai ,NV. (2015). Research findings from the use of probiotics in tilapia aquaculture: A review. Fish & Shellfish Immunology, 45(2); 592–597.

16.Harounabadi, S. (2016). The survey of molecular and antimicrobial activity of isolated bacteria from the Caspian Sea. Iranian Journal of Medical Microbiology, 10(1); 16–23.

17.Hussein, SA. (2013). Antimicrobial activity of probiotic bacteria. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, G Microbiology, 5(2); 21–34.

18.Jiang, L., Luo, Y., Cao, X., Liu, W., Song, G., Zhang, Z. (2021). Lux,S quorum sensing system mediating Lactobacillus plantarum probiotic characteristics. Epub.

19.Kim, JY., Young, JA., Gunther, IV NW., Lee, J. (2015). Inhibition of Salmonella by bacteriocin‐producing lactic acid bacteria derived from us kimchi and broiler chicken. Journal of Food Safety, 35(1); 1–12.

20.Laxminarayan, R., Duse, A., Wattal, C. (2013). Antibiotic resistance—the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases, 13(12); 1057–1098.

21.Lezotre, P-L. (2014). Part I - state of play and review of major cooperation initiatives. In: Lezotre P-L, editor. International Cooperation, Convergence and Harmonization of Pharmaceutical Regulations. Boston: Academic Press, 7–170.

22.Li, Y-K., Chen, H., Shu, M. (2021). Isolation, characterization and application of an alkaline resistant virulent bacteriophage JN01 against Escherichia coli O157:H7 in milk and beef. Epub.

23.Ling, H., Kang, A., Tan, MH., Qi, X., Chang,, MW. (2010). The absence of the luxS gene increases swimming motility and flagella synthesis in Escherichia coli K12. Biochemical and Biophysical Research Communications, 401(4); 521–526.

24.Mejía-Pitta, A., Broset, E., Fuente-Nunez, C. (2021). Probiotic engineering strategies for the heterologous production of antimicrobial peptides. Epub.

25.Melnikov, SV., Stevens, DL., Fu, X. (2020). Exploiting evolutionary trade-offs for posttreatment management of drug-resistant populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(30); 17924–17931.

26.Mirzaei, R., Mesdaghinia, A., Hoseini, SS., Yunesian, M. (2019). Antibiotics in urban wastewater and rivers of Tehran, Iran: Consumption, mass load, occurrence, and ecological risk. Epub.

27.Moini, J., Ahangari, R., Miller, C., Samsam, M. (2020). Chapter 10 - gynecologic problems. In: Moini J, Ahangari R, Miller C, Samsam M, editors. Global Health Complications of Obesity. Elsevier, 223–256.

28.Percival, SL., Williams, DW. (2014). Chapter Six - Escherichia coli. In: Percival SL, Yates MV, Williams DW, Chalmers RM, Gray NF, editors. Microbiology of Waterborne Diseases (Second Edition). London: Academic Press, 89–117.

29.Redweik, GAJ., Stromberg, ZR., Goor, AV., Mellata, M. (2020). Protection against avian pathogenic Escherichia coli and Salmonella kentucky exhibited in chickens given both probiotics and live Salmonella vaccine. Poultry Science, 99(2); 752–762.

30.Rehman, N., Azam, S., Ali, A. (2021) Molecular epidemiology of antibiotic-resistant genes and potent inhibitors against TEM, CTX-M-14, CTX-M-15, and SHV-1 proteins of Escherichia coli in district Peshawar, Pakistan. Epub.

31.Rigobelo, E., Karapetkov, N., Maestá, SA., Ávila, F de., McIntosh, D. (2015). Use of probiotics to reduce faecal shedding of Shiga toxin-producing Escherichia coli in sheep. Beneficial Microbes, 6(1); 53–60.

32.Sales, A., Fathi, R., Mobaiyen, H., Bonab, F., Kondlaji, K. (2017). Molecular study of the prevalence of CTX-M1, CTX-M2, CTXM3 in Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical samples in tabriz town, iran. Electronic J Biol, 13(3); 253–259.

33.Seo ,M-R., Park, YS., Pai, H. (2010). Characteristics of plasmid-mediated quinolone resistance genes in extended-spectrum cephalosporin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Korea. Chemotherapy, 56(1); 46–53.

34.Shawa, M., Furuta ,Y., Mulenga, G. (2021). Novel chromosomal insertions of ISEcp1-blaCTX-M-15 and diverse antimicrobial resistance genes in Zambian clinical isolates of Enterobacter cloacae and Escherichia coli. Antimicrobial Resistance & Infection Control, 10(1); 79.

35.Tamtaji, OR., Kouchaki, E., Salami, M. (2017). The effects of probiotic supplementation on gene expression related to inflammation, insulin, and lipids in patients with multiple sclerosis: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Journal of the American College of Nutrition, 36(8); 660–665.

36.Vincenzi, A., Goettert, MI., Souza, CFV de. (2021). An evaluation of the effects of probiotics on tumoral necrosis factor (TNF-α) signaling and gene expression. Epub.

37.Wang, G., Liu, J., Xia, Y., Ai, L. (2021). Probiotics-based interventions for diabetes mellitus: A review, Epub.

38.Wu, C-F., Valdes, JJ., Bentley, WE., Sekowski, JW. (2003). DNA microarray for discrimination between pathogenic 0157:H7 EDL933 and non-pathogenic Escherichia coli strains. Biosensors and Bioelectronics, 19(1);1–8.