بررسی واکنش پذیری آنتی ژن نوترکیب OMP31 باکتری بروسلا با سرم بیماران مبتلا به بروسلوز جهت استفاده در تشخیص به روش الایزا
محورهای موضوعی : نشانگر های زیستی پلاسما
امیر حسین تارمچی
1
*
,
زهرا تقی پور
2
,
فائزه سبزه ای
3
,
سعید کابلی
4
1 - گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان
2 - گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان
3 - گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان
4 - گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان
کلید واژه: omp31 , الایزا, تشخیص سرمی, بروسلا, تب مالت,
چکیده مقاله :
زمینه و هدف: بروسلوز یا تب مالت یک عفونت زئونوتیک باکتریایی با گسترش جهانی است که توسط گونه بروسلا ایجاد میشود. علائم بارز این بیماری شامل تب در انسان و سقط در حیوانات آلوده میباشد. گام اساسی در کنترل این بیماری ، شناسایی صحیح و به موقع است؛ بنابر این توسعه روشهای تشخیصی کارآمد حائز اهمیت است. در این مطالعه از تست الایزا بر پایه پروتئین نوترکیب OMP 31 استفاده شده است که با استناد به تحقیقات پیشین ، یک پروتئین ایمونوژن با توانایی تحریک پاسخ ایمنی و تولید آنتیبادی مناسب میباشد. هدف از این تحقیق بررسی میزان واکنش پذیری این پروتئین با آنتیبادیهای IgG و IgM موجود در سرم بیماران است.
مواد و روشها: کاست ژنی طراحی‌شده در وکتور pET-28a کلون شد و به باکتری E.coli BL21(DE3) انتقال داده شد. بعد از تایید حضور پروتئین به روش وسترن بلات ، تخلیص پروتئینی به روش کروماتوگرافی میل ترکیبی انجام شد. پس از تعیین غلظت، آنتی ژن بر روی پلیت الایزا کوت شده و واکنش پذیری آن با سرم بیماران و سرم گروه کنترل ، مورد بررسی قرار گرفت. حساسیت و دقت برای هر دو نوع آنتیبادی IgM و IgG توسط آنالیز ROC ارزیابی شد..
نتایج: پس از بیان پروتئین ، حضور پروتئین OMP31 نوترکیب توسط وسترن بلات تایید شده و غلظت آن به کمک آزمون بردفور37/54 میکروگرم بر میلی لیتر تخمین زده شد. حساسیت و اختصاصیت واکنش پروتئین نوترکیب با IgG و IgM موجود در سرم افراد بیمار و سالم به ترتیب 56/56 و %5/72 برای IgG ؛ و %7/75 و 79/62 برای IgM گزارش شد.
نتیجه گیری: به نظر می رسد پروتئین نوترکیب تولید شده ، قادر به واکنش مناسبی با سرم بیماران بوده و تفاوت معناداری در میزان واکنش پذیری آن با گروه بیمار و گروه کنترل مشاهده شد.
Background & Aim: Brucellosis or Malta fever is a zoonotic bacterial infection with a global distribution caused by Brucella species. The hallmark symptoms of this disease include fever in humans and abortion in infected animals. The essential step in controlling this disease is correct and timely identification; therefore, the development of effective diagnostic methods is important. In this study, an ELISA test based on recombinant protein OMP 31 was used, which, based on previous research, is an immunogenic protein with the ability to stimulate an immune response and produce appropriate antibodies. The aim of this project is to investigate the reactivity of this protein with IgG and IgM antibodies present in the serum of patients.
Materials and Methods: The designed gene cassette was cloned in the pET-28a vector and transferred into a bacterial expression host. After confirming the nature of the protein, an appropriate volume of it was expressed and purified by affinity chromatography. After determining the concentration, the antigen was coated on an ELISA plate and its reactivity with patient serum and control serum was examined, and the sensitivity and specificity for both IgM and IgG antibodies were evaluated by ROC analysis.
Results: After expression of the recombinant protein, its identity was confirmed by Western blot and its concentration was estimated at 54.37 μg/ml by Bradford test, and a suitable reaction with the tested sera was reported, with a sensitivity and specificity of 56.56 and 72.5% for IgG; and 75.7% and 62.79 for IgM.
Conclusion: The produced recombinant protein was able to react with patient serum, and a significant difference in its reactivity with the patient group and the control group was observed.
Keywords: Omp31, Brucellosis, Serodiagnosis, ELISA .
1. Yousefi S, Abbassi-Daloii T, Tahmoorespour M, Sekhavati MH. Nanoparticle or conventional adjuvants: which one improves immune response against Brucellosis? %J Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2019;22(4):360-6.
2. Golshani M, Buozari S. A review of Brucellosis in Iran: Epidemiology, Risk Factors, Diagnosis, Control, and Prevention. Iran Biomed J. 2017;21(6):349-59.
3. Naseri ZM, Alikhani MYP, Hashemi SHM, Kamarehei F, Arabestani MRP. Prevalence of the Most Common Virulence-Associated Genes among Brucella Melitensis Isolates from Human Blood Cultures in Hamadan Province, West of Iran. Iranian journal of medical sciences. 2016;41(5):422-9.
4. Avila-Calderon ED, Lopez-Merino A, Sriranganathan N, Boyle SM, Contreras-Rodriguez A. A history of the development of Brucella vaccines. Biomed Res Int. 2013;2013:743509.
5. Shi D, Chen Y, Chen M, Zhou T, Xu F, Zhang C, et al. Bioinformatics analysis of Omp19 and Omp25 proteins for designing multi-epitope vaccines against Brucella. Medicine. 2023;102(11):e33182.
6. Cassataro J, Pasquevich K, Bruno L, Wallach JC, Fossati CA, Baldi PC. Antibody reactivity to Omp31 from Brucella melitensis in human and animal infections by smooth and rough Brucellae. Clin Diagn Lab Immunol. 2004;11(1):111-4.
7. Baldi PC, Miguel SE, Fossati CA, Wallach JC. Serological follow-up of human brucellosis by measuring IgG antibodies to lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella species. Clin Infect Dis. 1996;22(3):446-55.
8. Ahmed IM, Khairani-Bejo S, Hassan L, Bahaman AR, Omar AR. Serological diagnostic potential of recombinant outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella melitensis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay. BMC Vet Res. 2015;11:275.
9. Zhang F, Li Z, Jia B, Zhu Y, Pang P, Zhang C, et al. The Immunogenicity of OMP31 Peptides and Its Protection Against Brucella melitensis Infection in Mice. Sci Rep. 2019;9(1):3512.
10. Hisham Y, Ashhab Y. Identification of Cross-Protective Potential Antigens against Pathogenic Brucella spp. through Combining Pan-Genome Analysis with Reverse Vaccinology. J Immunol Res. 2018;2018(1):1474517.
11. Tian M, Song M, Yin Y, Lian Z, Li Z, Hu H, et al. Characterization of the main immunogenic proteins in Brucella infection for their application in diagnosis of brucellosis. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2020;70:101462.
12. Jezi FM, Razavi S, Mirnejad R, Zamani K. Immunogenic and protective antigens of Brucella as vaccine candidates. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 2019;65:29-36.
13. Zhang F, Li Z, Jia B, Zhu Y, Pang P, Zhang C, et al. The immunogenicity of OMP31 peptides and its protection against Brucella melitensis infection in mice. Scientific Reports. 2019;9(1):1-7.
14. Dumon-Seignovert L, Cariot G, Vuillard L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21 (DE3), C41 (DE3), and C43 (DE3). Protein expression and purification. 2004;37(1):203-6.
15. Gupta V, Verma D, Singh S, Vihan V. Serological diagnostic potential of recombinant outer membrane protein (Omp31) from Brucella melitensis in goat and sheep brucellosis. Small Ruminant Research. 2007;70(2-3):260-6.
16. Dehghani S, Sabzehei F, Taromchi AH, Mobaien AR, Arsang-Jang S. Hybrid recombinant Omp 22, 25, and 31 immunodominant epitopes can be used for serodiagnosis of brucellosis. Journal of Immunological Methods. 2021;497:113123.
17. Shirdast H, Ebrahimzadeh F, Taromchi AH, Mortazavi Y, Esmaeilzadeh A, Sekhavati MH, et al. Recombinant Lactococcus Lactis displaying Omp31 antigen of brucella melitensis can induce an immunogenic response in BALB/c mice. Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2021;13(1):80-9.
18. Yin D, Li L, Song X, Li H, Wang J, Ju W, et al. A novel multi-epitope recombined protein for diagnosis of human brucellosis. BMC infectious diseases. 2016;16(1):1-8.
19. Tiwari S, Kumar A, Thavaselvam D, Mangalgi S, Rathod V, Prakash A, et al. Development and comparative evaluation of a plate enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant outer membrane antigens Omp28 and Omp31 for diagnosis of human brucellosis. Clinical and Vaccine Immunology. 2013;20(8):1217-22.
20. Özdemir M, Feyzioğlu B, Kurtoğlu MG, Doğan M, Dağı HT, Yüksekkaya Ş, et al. A comparison of immuncapture agglutination and ELISA methods in serological diagnosis of brucellosis. International Journal of Medical Sciences. 2011;8(5):428.
21. Chaudhuri P, Prasad R, Kumar V, Gangaplara A. Recombinant OMP28 antigen-based indirect ELISA for serodiagnosis of bovine brucellosis. Molecular and cellular probes. 2010;24(3):142-5.