تشخیص گونه مایکوپلاسما گالی‌سپتیکوم به‌وسیله 16S rRNA PCR با پرایمرهای اختصاصی در نمونه‌های بالینی

محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی

سید علی پوربخش ¹ , افشین ذاکری ² , نریمان شیخی ³ , سعید چرخکار ⁴ , عباس اشتری ⁵

1 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، ایران، ایران
2 - دانشجوی دوره دکترای تخصصّی بیماریهای طیور، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، ایران، ایران
3 - گروه علوم درمانگاهی، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران
4 - گروه علوم درمانگاهی، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران
5 - آزمایشگاه رفرانس مایکوپلاسما، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج، کرج، ایران

تاریخ دریافت : 1388/03/16 تاریخ پذیرش : 1388/10/14 تاریخ انتشار : 1388/06/01

کلید واژه: PCR, نمونه‌های بالینی, مایکوپلاسما گالی‌سپتیکوم,

چکیده مقاله :

مایکوپلاسما گالی سپتیکوم به عنوان یکی از اصلی ترین پاتوژن های پرندگان، خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت مرغداری وارد می کند. هدف اصلی این مطالعه شناسایی گونه مایکوپلاسما گالی سپتیکوم در نمونه های بالینی با استفاده از روش 16S rRNA PCRمی باشد. برای بررسی تیتر سرمی، 18 فارم تخم گذار تجارتی و 8 فارم مادر گوشتی انتخاب و تست RSAT (Rapid Serum Agglutination Test) انجام گردید. جهت نمونه‌برداری برای PCR (Polymerase Chain Reaction)، از 17 فارمی که در تست RSAT مثبت شده بودند، 10 فارم انتخاب و 109 سوآپ استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه از هر فارم تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلی لیتر PBS انداخته شد و به آزمایشگاه منتقل گردید تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه، پرایمرهای اختصاصی برای ژن 16S rRNA استفاده شد. پرایمرهای مورد استفاده برای ژن16S rRNA کاملاً اختصاصی مایکوپلاسما گالی سپتیکوم می باشد و با تمام مایکوپلاسما ها و دیگر باکتری های موجود در نای طیور قابل تفریق است. از 26 فارم مورد آزمایش، 17 فارم در تست سرمی RSAT مثبت شدند. محصولPCR تولیدی توسط پرایمرهای اختصاصی، در 10 فارم، 46 نمونه معادل 2/42 درصد در PCR ، باند 530 جفت بازی را برای همه سویه های فیلدی بر روی ژل الکتروفورز تشکیل داد.16S rRNA PCR با حساسیت بالا می تواند در تشخیص قطعی عفونت با مایکوپلاسما گالی سپتیکوم در آزمایشگاه به کار برده شود.

چکیده انگلیسی:

Mycoplasma gallisepticum (MG) as one the major pathogens of birds, causes significant economic losses in poultry industry. The main purpose of the present study was to detect Mycoplasma gallisepticum in clinical samples using the 16S rRNA PCR method. For serological screaming test, 18 commercial laying farms and 8 broiler breeder farms were selected and rapid serum agglutination test (RSAT) was performed. For polymerase chain reaction sampling, 10 of the 17 farms that were positive in RSAT were selected and 109 sterile swab samples were collected from the palatine cleft, trachea, air sacs and lungs in each farm. Three swabs from three birds were placed in test tube containing 1 ml of phosphate buffered saline and transferred to laboratory form PCR testing. In this study, specific primers for 16S rRNA gene were used. The aforementioned primers are totally specific for MG and can be differentiated from other Mycoplasmaand bacteria present in the trachea of poultry of the 26 farms examined, 17 farms were positive in RSAT serologic test. The 530 bp PCR product produced by specific primers of all field strains appeared on electrophoresis gel in 46 samples from 10 farms accounting to 42.2%.The 16S rRNA PCR with very high sensitivity can be employed in definitive diagnosis of Mycoplasma gallisepticum infection in vitro.  

منابع و مأخذ:

1. حسینی، ح. (1385): مطالعات مولکولی جدایه­های مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم از طیور، رساله دکترای تخصصّی بیماری­های طیور، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، صفحات: 120-1.


2. Biomune. (2006):VECTORMUNE®FP-MG.http://www.biomune.company.com/chickens/vectormunefpmg.html.


3. Biro, J., Erdei, N., Szekely, I. and Stipkovits, L. (2006): Differentiation of mycoplasma gallisepticum strains using molecular methods. Acta Veterinaria Hungarica, 54: 437-448.


4. Bradbury, J.M. and Levisohn, S. Experimantal infections in poultry. In: Tully, J.G. (1996):  Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Volume II-Diagnostic Procedures, San Diego, CA: Academic Press. pp: 361-370.


5. Charlton, B.R., Bickford, A.A., Chin, R.P. and Walker, R.L. (1999): Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Mycoplasma gallisepticum isolates from turkeys from the central valley of California. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11:408-415.


6. Charlton, B.R., Bickford, A.A., Walker, R.L. and Yamamoto, R. (1999): Complementary randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis patterns and primer sets to differentiate Mycoplasma gallisepticum strains. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11: 158-161.


7. Collett, S.R. (2005): Monitoring broiler breeder flocks for mycoplasma gallisepticum infection after vaccination with ts- 11. Department of production animal studies, faculty of veterinary science, University of Pretoria, pp: 1-79.


8. Dennis, Y.M., Chiu, W.K. and Allen Chan, K.C. (2006): Clinical applications of PCR. Humana Press, pp: 4- 22.


9. Fan, H.H., Kleven, S.H. and Jackwood, M.W. (1995): Application of polymerase chain reaction with arbitrary primers to strain identification of Mycoplasma gallisepticum. Avian Dis., 39: 729-735.


10. Feberwee, A., Mekkes, D.R., de Wit, J.J., Hartman, E.G. and Pijpers, A. (2005): Comparison of culture, PCR, and different serologic tests for detection of mycoplasma gallisepticum and mycoplasma synoviae infections. Avian Dis., 49: 260-268.


11. Garcia, M., Ikuta, N., Levisohn, S. and Kleven, S.H. (2005): Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens. Avian Dis., 49: 125-32.


12. Gharaibeh, S. and Al Roussan, D. (2008): The use of molecular techniques in isolation and characterization of mycoplasma gallisepticum from commercial chicken in Jordan. Int. J. Poult. Sci., 7(1): 28-35.


13. Kempf, I., Blanchard, A. Gesbert, F. Guittet, M. and Bennejean, G. (1993): The polymerase chain reaction for Mycoplasma gallisepticum infection. Avian Pathol., 22: 739-750.


14. Khan, M.I. (2002): Multiplex PCR of Avian Pathogenic Mycoplasmas, in PCR Detection of Microbial Pathogens, by Joachim, Frey, Konard, Sachse Humana Press, pp: 223.


15. Kleven, S.H. (2008): Control of avian mycoplama infections in commercial poultry. Avian Dis., 52: 367-374.


16. Kleven, S.H. Mycoplasmosis. In: Saif, Y.M., Barnes, H.J., Gilsson, J.R., Fadly, A.M., Mc Dongald, L.R. and swayne, D.E. (2008): Diseases of Poultry. 12^th ed., Iowa state university press, USA, pp: 805-808.


17. OIE terrestrial manual. (2008): Avian mycoplasmosis, chapter 2.3.5. pp: 482-496.