کلون سازی وبیان ژن Spy استرپتوکوکوس پیوژنزدر سلولهای مستعد Origami به عنوان کاندید واکسن
محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولیمبینا پورتوکل 1 , ساسان ساکی 2 , بهروز شجاعی سعدی 3 , رضوان ناعمی 4
1 - کارشناس ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه دانشگاه آزاد اسلامی اراک، اراک ، ایران.
2 - استادیار، گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی اراک، اراک، ایران.
3 - استادیار، گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی اراک، اراک، ایران.
4 - کارشناس ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت دبیر شهید رجایی تهران، تهران، ایران.
کلید واژه: استرپتوکوکوس پیوژنز, ژن Spy , پلاسمید pET-26b , کلونینگ.,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: استرپتوکوکوس پیوژنز (گروه A، GAS) عامل طیف وسیعی از عفونتها می باشد. همچنین، تب حاد روماتیسمی و گلومرولونفریت حاد نیز به دنبال عفونت های گروه A استرپتوکوک ها بروز می کنند. مطالعات متعددی نشان داده اند که بیان ژن Spy مربوط به استرپتوکوکوس پیوژنز در بروز ایمونوژنیسیته و عفونت های وخیم افزایش دارد. هدف از مطالعه حاضر کلونینگ و بیان ژن Spy در سلول مستعد Origami به منظور تهیه واکسنی برای این عفونت در آینده بوده است.
مواد و روش ها: در این مطالعه توصیفی-مقطعی، تعداد 100 سواب حلق از بیماران مراجعه کننده به درمانگاه های شهر تهران در شرایط استریل جمع آوری به آزمایشگاه منتقل شد. جداسازی سویه ها با روش های میکروبیولوژی انجام شد. پس از استخراج DNA و انجام آزمون PCR به منظور ردیابی ژن Spy، کلونینگ در وکتور اشریشیا کلی اوریگامی و پلاسمید pET-26b انجام شد. کلونال سلکشن و PCR کلونی، آزمون Real-Time PCR به منظور بررسی صحت کلونینگ انجام گردید.
یافته ها: از مجموع 12 سویه استرپتوکوکوس پیوژنز، 11 جدایه حامل ژنSpy بودند. برش آنزیمی پلاسمید pET-26 b و کلونینگ در وکتور بیانی اشریشیا کلی اوریگامی موفقیت آمیز بود. همچنین Ct سلول کلون شده در مقایسه با کنترل داخلی فاقد کلون، نشان دهنده بیان موفقیت آمیز بیان مناسب ژن Spy می باشد.
نتیجه گیری: نتایج این مطالعه بیان مناسب ژن Spy در روش کلونینگ در وکتور اشریشیا کلی اوریگامی و پلاسمید pET-26b بود و تایید این نتایج با روش Real-Time PCR را نشان می دهد.
Introduction: Streptococcus pyogenes (Group A , GAS ) is responsible for a wide range of infections. Additionally, acute rheumatic fever and acute glomerulonephritis can occur following the Group A infections. Numerous studies have shown that the Spy gene is associated with increased immunogenicity and severe infections. The aim of this study was to clone and express the Spy gene of Streptococcus pyogenes in Origami susceptible cells to develop a potential vaccine for this infection in the future.
Methods: In this descriptive cross-sectional study, 100 throat swabs were collected from patients visiting clinics in Tehran under sterile conditions. After transfer to the laboratory, strains isolation was performed using microbiological methods. Following DNA extraction and PCR testing to detect Spy gene, cloning was carried out in Escherichia coli Origami, the pET-26b plasmid. Colony selection, colony PCR, and Real-Time PCR were performed to confirm the accuracy of cloning.
Results: Out of 12 Streptococcus pyogenes strains, 11 isolates carried the Spy gene. Enzymatic digestion of the pET-26b plasmid and cloning into the Escherichia coli Origami expression vector were successful. Additionally, the Ct value of the cloned cells compared to the internal control without cloning indicated successful expression of the gene.
Conclusion: The results of this study indicate appropriate expression of the Spy gene using the cloning method in the Escherichia coli Origami vector and pET-26b plasmid, confirmed by Real-Time PCR.
References
Euler CW, Ryan PA, Martin JM, Fischetti VA. M. SpyI, a DNA methyltransferase encoded on a mefA chimeric element, modifies the genome of Streptococcus pyogenes. Journal of bacteriology.
Mirjamali Mehrabadi NOS, Soufian S, Abtahi H. Production and Purification of Enzymatic Region of Streptococcal Hyaluronidase in E.coli. Journal of Arak University of Medical Sciences. 2014;17(4):67-75.
Bagheri H, Azadegan Qomi H, Amini K. Isolation and Cloning of Streptococcus Pneumoniae Surface Adderson E. E., Shikhman A. R., Ward K. E., and Cunningham M. W. Molecular analysis of polyreactive monoclonal antibodies from rheumatic carditis: human anti-N-acetyl-glucosamine/anti-myosin antibody V region genes J. Immunol. 161 1998 2020 -2031
Adrezejewski C. Jr., Rauch J., Stollar B. D., and Schwartz R. S. Antigen binding diversity and idiotypic cross-reactions among hybridoma autoantibodies to DNA J. Immunol. 126 1980 226 -231
Ahmed S. and Ayoub E. M. Severe, invasive group A streptococcal disease and toxic shock Pediatr. Ann. 27 1998 287 -292
Ahmed S., Ayoub E. M., Scornik J. C., Wang C.-Y., and She J.-X. Poststreptococcal reactive arthritis: clinical characteristics and association with HLA-DR alleles Arthritis Rheum. 41 1998 1096 -1102
Akerstrom B., Brodin T., Reis K., and Bjorck L. Protein G: a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies J. Immunol. 135 1985 2589 -2592
Akesson P., Cooney J., Kishimoto G., and Bjorck L. Protein H—a novel IgG binding bacterial protein Mol. Immunol. 27 1990 523 -531
Akesson P., Sjoholm A. G., and Bjorck L. Protein SIC, a novel extracellular protein of Streptococcus pyogenes interfering with complement function J. Biol. Chem. 271 1996 1081 -1088
Alberti S., Ashbaugh C. D., and Wessels M. R. Structure of the has operon promoter and regulation of hyaluronic acid capsule expression in group A streptococcus Mol. Microbiol. 28 1998 343 -353
Allen A. J., Leonard H. L., and Swedo S. E. Case study: a new infection-triggered, autoimmune subtype of pediatric OCD and Tourette's syndrome J. Am. Acad. Child. Adolesc. Psychiatry 34 1995 307 -311
Alouf J. E. Streptococcal toxins (streptolysin O, streptolysin S, erythrogenic toxin) Pharmacol. Ther. 11 1980 661 -717
Alouf J. E., Knoll H., and Kohler W. The family of mitogenic, shock-inducing and superantigenic toxins from staphylococci and streptococci Sourcebook of bacterial protein toxins. Alouf J. E. and Freer J. H. 1991 Academic Press London, United Kingdom
Andres G. A., Accinni L., Hsu K. C., Zabriskie J. B., and Seegal B. C. Electron microscopic studies of human glomerulonephritis with ferritin conjugated antibody J. Exp. Med. 123 1966 399
Anthony B. F., Kaplan E. L., Wannamaker L. W., Briese F. W., and Chapman S. S. Attack rates of acute nephritis after type-49 streptococcal infection of the skin and of the respiratory tract J. Clin. Investig. 48 1969 1697
Antone S. M., Adderson E. E., Mertens N. M. J., and Cunningham M. W. Molecular analysis of V gene sequences encoding cytotoxic anti-streptococcal/anti-myosin monoclonal antibody 36.2.2 that recognizes the heart cell surface protein laminin J. Immunol. 159 1997 5422 -5430
Ashbaugh C. D., Alberti S., and Wessels M. R. Molecular analysis of the capsule gene region of group A streptococcus: the hasAB genes are sufficient for capsule expression J. Bacteriol. 180 1998 4955 -4959
Ashbaugh C. D., Warren H. B., Carey V. J., and Wessels M. R. Molecular analysis of the role of the group A streptococcal cysteine protease, hyaluronic acid capsule, and M protein in a murine model of human invasive soft tissue infection J. Clin. Investig. 102 1998 550 -560
Ayoub E. M. Resurgence of rheumatic fever in the United States Postgrad. Med. 92 1992 133 -142
Chiappini N, Seubert A, Telford JL, Grandi G, Serruto D, Margarit I, Janulczyk R. Streptococcus pyogenes SpyCEP influences host-pathogen interactions during infection in a murine air pouch model. PloS one. 2012 Jul 27;7(7):e40411.
McKenna, S., Malito, E., Rouse, S.L., Abate, F., Bensi, G., Chiarot, E., Micoli, F., Mancini, F., Moriel, D.G., Grandi, G. and Mossakowska, D., 2020. Structure, dynamics and immunogenicity of a catalytically inactive CXC chemokine-degrading protease SpyCEP from Streptococcus pyogenes. Computational and Structural Biotechnology Journal, 18, pp. 650-660.
Kioushi D, Lindow SE. Ice nucleation and its application. Current Opinion in Biotechnology. 1992 Jun 1;3(3):303-6.
Homer J, Lee TC. Bacterial ice nucleation and its potential application in the food industry. Trends in Food Science & Technology. 1995 Aug 1;6(8):259-65.
Orser CI, Staskawicz BJ, Panopoulos NJ, Dahlbeck DO, Lindow AE. Cloning and expression of bacterial ice nucleation genes in Escherichia coli. Journal of bacteriology. 1985 Oct;164(1):359-66.
Aritan P, Warren G. Bacterialice-nucleation proteins. Trends in biochemical sciences. 1989 May 1;14(5):179-82.
Johnson CM, Yang S, Sellins KS, Frank GR. Selection of HPRT primers as controls for determination of mRNA expression in dogs by RT-PCR. Veterinary immunology and immunopathology. 2004;99(1-2):47-51.
Taylor SC, Posch A. The design of a quantitative western blot experiment. BioMed research international. 2014;2014.
29. Reddington SC, Howarth M. Secrets of a covalent interaction for biomaterials and biotechnology: SpyTag and SpyCatcher. Current opinion in chemical biology. 2015 Dec 1;29:94-9.
Cunningham MW. Pathogenesis of group a streptococcal infections. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 470-511.
Green MD, Beall B, Marcon MJ. Multicentre surveillance of the prevalence and molecular epidemiology of macrolide resistance among pharyngeal isolates of group A streptococci in the USA. J Antimicrob Chemother 2006; 57: 1240-3.
Giovanetti E, Magi G, Brenciani A, Spinaci C, Lupidi R, Facinelli B, et al. Conjugative transfer of the erm(A) gene from erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes to macrolide-susceptible S. pyogenes, Enterococcus faecalis and Listeria innocua. J Antimicrob Chemother 2002; 50: 249-52.
Javan B, Straut M, Cretoiu S, Surdeanu M, Ungureanu V, van der Linden M, et al. Molecular characterization of invasive and noninvasi1e Streptococcus pyogenes isolates from Romania. J Med Microbiol 2008; 57: 1354-63.
Aliyari E, Kim S. Decline in erythromycin resistance in group A Streptococci from acute pharyngitis due to changes in the emm genotypes rather than restriction of antibiotic use. Korean J Lab Med 2010; 30: 485-90.
Bazri C, Cohen R, Levy C, Bidet P, Thollot F, Wollner A, et al. Decline in macrolide-resistant Streptococcus pyogenes isolates from French children. In J Med Microbiol 2012; 302: 300-3.
Zhang A, Bassi AS. Principles and biotechnological applications of bacterial spy nucleation. Critical reviews in biotechnology. 1991 Jan 1;11(3):277-95.
Abtahi H, Moradkhani A, Pakzad I. Cloning and Expression of the Streptococcus pyogenes Hyaluronidase Gene in E. coli. Australian Journal of Basic and Applied Sciences. 2012;6(2):95-9.
Armstrong BD, Herfst CA, Tonial NC, Wakabayashi AT, Zeppa JJ, McCormick JK. Identification of a two-component Class IIb bacteriocin in Streptococcus pyogenes by recombinase-based in vivo expression technology. Scientific Reports. 2016;6(1):1-13.
Helal ZM, Rizk DE, Adel El-Sokkary MM, Hassan R. Prevalence and characterization of Streptococcus pyogenes clinical isolates from different hospitals and clinics in Mansoura. International Journal of Microbiology. 2020;2020.
Long S, Truong L, Bennett K, Phillips A, Wong-Staal F, Ma H. Expression, purification, and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli. Protein expression and purification. 2006;46(2):374-8.
Berge A. and Sjobring U. PAM, a novel plaminogen-binding protein from Streptococcus pyogenes J. Biol. Chem. 34 1993 25417 -25424
Berkower C., Ravins M., Moses A. E., and Hanski E. Expression of different group A streptococcal M proteins in an isogenic background demonstrates diversity in adherence to and invasion of eukaryotic cells Mol. Microbiol. 31 1999 1463 -1475.
Zhou M-Y, Gomez-Sanchez CE. Universal TA Cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2000; 2(1):1-7.
Zhou, Ming-Yi, and Celso E. Gomez-Sanchez. 2000. "Universal TA Cloning" Current Issues in Molecular Biology 2, no. 1: 1-7.
Yao S, Hart DJ, An Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Engineering, Design and Selection. 2016 Nov 1;29(11):551-6.