جداسازی و کلون سازی ژن آنزیم کوتیناز باکتری ترموبیفیدا فوسکا

محورهای موضوعی : میکروب شناسی محیطی

الهه پورفخرایی ¹ , مهرداد بهمنش ² , مجید عرفانی مقدم ³

1 - گروه بیوفیزیک، دانشگاه تربیت مدرس
2 - گروه ژنتیک، دانشگاه تربیت مدرس
3 - گروه بیوفیزیک، دانشگاه تربیت مدرس

تاریخ دریافت : 1392/07/25 تاریخ پذیرش : 1392/08/25 تاریخ انتشار : 1389/07/09

کلید واژه: کلون سازی, ترموبیفیدا فوسکا, کوتیناز,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: آنزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها است و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. هدف از این پژوهش، جداسازی و کلون سازی ژن آنزیم کوتیناز از باکتری ترموبیفیدا فوسکا (Thermobifida fusca) بود. مواد و روش‌ها: نمونه برداری از خاک های جنگلی شمال ایران صورت گرفت. با استفاده از محیط کشت اختصاصی و شرایط محیطی مناسب (10 pH= و دمای 60 درجه سانتیگراد) جداسازی باکتری بومی ترموفیل ترموبیفیدیا فوسکا انجام شد. پس از طراحی پرایمر ، ژن کوتیناز (cut1) از باکتری یاد شده جدا گردید. سپس در وکتور pBluescript sk کلون و به سویه DH5α اشریشیا کلی انتقال داده شد. به منظور تایید کلون سازی، هضم آنزیمی انجام ونمونه ها برای تعیین توالی ارسال گردید. یافته‌ها: در این تحقیق برای یافتن آنزیم کوتیناز با ویژگی‌های مطلوب تر‌، جداسازی و کلونینگ ژن آنزیم کوتیناز از باکتری ترموفیل بومی ترموبیفیدا فوسکا انجام شد. کلون سازی به کمک روش هضم آنزیمی و تعیین توالی مورد تایید قرار گرفت. با توجه به نتایج BLAST بیشترین شباهت با 98% همانندی با آنزیم کوتیناز cut1 و 96% شباهت باآنزیم کوتیناز cut-1.KW3 در باکتری ترموبیفیدا فوسکا مشاهده گردید. نتیجه گیری: با استفاده از آنزیم کوتیناز کلون شده در این تحقیق و با توجه به طیف وسیع عملکردی آن در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می‌تواند در رفع آلودگی‌های زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند.

چکیده انگلیسی:

Background and Objectives: Cutinase belongs to serine hydrolase family that is used for elimination of environmental pollutions due to its special structural and functional properties and applications. In this study, cutinase gene was isolated from indigenous thermophiles Thermobifida fusca and was cloned in E. coli. Material and Methods: Sampling was performed from forest soils in the north of Iran. Thermobifida fusca bacteria were isolated with suitable cultures under optimized conditions (pH 10 and T=62 °C). After primer designation, cut1 gene was isolated from bacterium and then, was cloned in pBluescript sk vector and was introduced into E. coli DH5α. The colonization was confirmed based on enzymatic digestion and sequencing.  Result: Based on BLAST software, there was 98% and 96% similarities were obtained with cut1 and cut-1.KW3, respectively.  Conclusions: Based on broad functions of the enzyme on various substrates and its ability for synthesis of various polyester compounds, this enzyme has an important role in environmental decontamination.

منابع و مأخذ:

1. Carvalho CML, Aires-Barros MR, Cabral1 JMS. Cutinase structure, function and biocatalytic applications.  Electron J Biotechnol. 1998; 1(3): 160-173.

            2. Heredia A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim Biophys Acta. 2003; 1620(1-3): 1-7.

            3. Degani O, Salman H, Gepstein S, Dosoretz CG. Synthesis and characterization of a new cutinase substrate, 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. J Biotechnol. 2006; 121(3): 346-350.

            4. Xia Y, Yu K, Navarre D, Seebold K, Kachroo A, Kachroo P. The glabra1 mutation affects cuticle formation and plant responses to microbes. Plant Physiol. 2010; 154(2): 833-846.

            5. Liu Z, Gosser Y, Baker PJ, Ravee Y, Lu Z, Alemu G, Li H, Butterfoss GL, Kong XP, Gross R, Montclare JK. Structural and functional studies of Aspergillus oryzae cutinase: Enhanced thermostability and hydrolytic activity of synthetic ester and polyester degradation. J Am Chem Soc. 2009; 131(43): 15711-15716.

            6.  Billig S, Oeser T, Birkemeyer C, Zimmermann W, Hydrolysis of cyclic poly (ethyle                 terephthalate) trimers by a carboxylesterase from Thermobifida fusca KW3. Appl                         Microbiol Biotechnol. 2010; 87(5): 1753-1764.

            7. Chen S, Su L, Billig S, Zimmermann W, Chen J, Wu J. Biochemical characterization of the cutinases from Thermobifida fusca. J Mol Catal B Enzym. 2010; 63(3-4): 121-127.

    8. Gonçalves AP, Cabral JM, Aires-Barros MR. Immobilization of a recombinant cutinase by entrapment and by covalent binding. Kinetic and stability studies. Appl Biochem Biotechnol. 1996; 60(3): 217-28.

         9. Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E. The Prokaryotes. Third Edition. USA: Springer Science-Business Media, Inc. 2006.

     10. Zhang Z, Wang Y, Ruan J. Reclassification of Thermomonospora and Microtetraspora. Int J Syst Evol Microbiol. 1998; 48(2): 411-422

          11. Wei R, Oeser T, Zimmermann W. Cloning, expression and mutagenesis of cutinases isolated from Thermobifida fusca KW3 and their applications for polyethylene terephthalate hydrolysis. Submitted to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE. 2010.