طراحی کیت سنجش آنتی ژن P24 ویروس HIV با استفاده از آنتی بادی منوکلونال انسانی

محورهای موضوعی : میکروب شناسی تشخیصی

معصومه هاشمی ¹ , سید مهدی بوترابی ² , رضا حاجی حسینی ³ , علی میرجلیلی ⁴

1 - گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور تهران
2 - شرکت پیشتاز طب
3 - گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور تهران
4 - گروه بیوتکنولوژی، انستیتو واکسن و سرم سازی رازی

تاریخ دریافت : 1388/03/25 تاریخ پذیرش : 1388/04/25 تاریخ انتشار : 1388/04/10

کلید واژه: آزمون الیزا, آنتی ژن p24, سنجش ایمنی, HIV,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: چندین روز پس از عفونت با ویروس HIV و قبل از تغییرات سرمی در مرحله وجود RNA ویروس در خون، آنتی ژن p24 در خون قابل سنجش است. مطالعات نشان می دهد در مراحل اولیه عفونت آنتی ژن p24 بسیار زودتر از آنتی بادی بر علیه ویروس ظاهر می شود. بنابراین ارزیابی آنتی ژن p24 ویروس می تواند شاخص مناسبی برای تشخیص عفونت در مراحل اولیه بیماری باشد. هدف از این پژوهش استفاده از روش الایزا برای تشخیص آنتی‌ژن p24 با حساسیت و ویژگی بالا و مقایسه آن با روش های دیگر تشخیصی به منظور تشخیص عفونت در مراحل اولیه می باشد. مواد و روش ها: 300 نمونه خون با کیت نسل سوم تعیین آنتی بادی بر علیه HIV مورد آزمایش قرار گرفت. 30 نمونه مثبت از مرکز تحقیقات ایدز و از بیماران تایید شده با روش ایمونوبلات و NAT جمع آوری شد. تمام نمونه ها با کیت طراحی شده آنتی ژن p24 به روش الیزا مورد بررسی قرار گرفت. برای حذف اثر تداخلی احتمالی وجود آنتی بادی بر علیه آنتی ژن p24 ، نمونه سرم هایی که تست آنتی بادی آنها مثبت بود با محلول های مختلفی مانند بافر گلیسین 5/1 مولار با pH 2 ، اسید کلریک 5/0 نرمال، ترایتون X-100 با غلظت 1/0 درصد، بافر قلیایی شماره 1 و شماره 2 مجاور شدند. نتایج: از 30 نمونه مثبت در 21 مورد تست آنتی ژن در کیت طراحی شده با آنتی بادی منوکلونال انسانی و 18 مورد در کیت طراحی شده با آنتی بادی منوکلونال موشی قبل از مجاورت با محلول گلیسین مثبت شد (حساسیت تشخیصی به ترتیب 70% و 60%). پس از مجاور سازی 28 نمونه در کیت طراحی شده با آنتی بادی منوکلونال انسانی و 27 مورد در کیت طراحی شده با آنتی بادی منوکلونال موشی مثبت شد (حساسیت تشخیصی به ترتیب 93% و 90%). در کیت طراحی شده برای تشخیص آنتی ژن p24 حد مرزی بر مبنای جذب نوری نمونه های منفی 15/0 (معادل 2 پیکوگرم در میلی لیتر آنتی ژن p24) تعیین شد. اختلاف بین میانگین جذب نوری نمونه های مثبت و منفی در تست آنتی ژن از نظر آماری با 005/0p< قابل توجه بود (جذب نوری 6/1 در مقابل 08/0). حساسیت آنالیتیک سنجش با استفاده از آنتی بادی منوکلونال انسانی و استفاده از آنتی ژن WHO 1 واحد در میلی لیتر و با آنتی ژن نوترکیب 2 پیکوگرم در میلی لیتر بدست آمد که در استفاده از آنتی بادی منوکلونال موشی این مقدار به ترتیب 4 و 8 بود. بر اساس نتایج حاصل از نمونه های منفی اختصاصیت سنجش 100% محاسبه گردید. مجاور سازی نمونه سرم های مثبت و نمونه هایی از پانل BBI دارای تست آنتی ژن و آنتی بادی و PCR بافر گلیسین 5/1 مولار با pH 2 باعث افزایش حساسیت تشخیصی گردید (70% در مقابل 93%). نتیجه گیری: این تست حساسیت و ویژگی بالایی برای تشخیص HIV دارد و در مقایسه با روش های دیگر تشخیص، ساده، سریع، دقیق و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه می باشد. از این تست در غربالگری نوزادان تولد یافته از مادران HIV مثبت و همچنین تعیین تکلیف در مورد افرادی که تست الیزا نسل چهارم مثبت داشته ولی تست وسترن بلات آن را تائید نکرده می توان استفاده کرد.

چکیده انگلیسی:

Background and Objective: Several days after infection with HIV and before serum changes in the stage that there is RNA HIV in the blood, the antigen P24 of the HIV is measurable in the blood. The studies done show that in the primary stages of the infection, antigen p24 appears sooner than antibody; therefore, the evaluation of antigen p24 can be an appropriate index for diagnosing the infection in the first stages of the disease. Materials and Methods: 300 negative samples from blood donor were tested with the third-generation kit for determining the antibody against HIV. 30 positive samples were collected from the AIDS Research Center and the patients confirmed with Immunoblot and NAT methods. All the samples were investigated with the designed kit for antigen p24 in Elisa method. From among the samples, the samples of serums the antibody test of which were positive, pretreatment with different solutions including 1.5 molars of Buffer Glycin with PH=2, hydrochloric acid 0.5 N, Trition X-100 with a concentration of 0.1% , alkaline buffer No.1 and 2 for removing the probable interventional effect of antibody against antigen p24. Result: From among 30 positive samples, 21samples of antigen tests were positive in the kit designed by human monoclonal and 18 cases in the kit designed by mouse monoclonal antibody before pretreatment samples with Glycin (the diagnostic sensitivity is 70% and 60% respectively). After pretreatment, 28 samples in the kit designed by human monoclonal antibody and 27 samples in the kit designed by mouse monoclonal were positive.( the diagnostic sensitivity were 93% and 90% respectively). In the kit designed for detecting antigen p24, the cut off was determined on the basis of optical density of the negative samples 0.15(equal to 2 pg/ml of antigen P24). The difference between the average of optical density of the positive and negative samples in antigen test was significant statistically(pConclusion: This test has high sensitivity and specificity in diagnosing HIV and is more simple, fast, accurate, and economical in comparison with other diagnostic methods. This test may be used for screening newborns from the mothers with positive HIV and the taking decision about the cases for whom the fourth-generation of Elisa Tests are positive but Western Blot Test has not confirmed it.