کلون سازی، تعیین توالی و بیان ژن آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی

محورهای موضوعی : زیست فناوری میکروبی

راضیه افراسیابی ¹ , خسرو آقایی‌پور ² , فرشید کفیل‌زاده ³ , صدیقه سادات صفویه ⁴

1 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
2 - بخش ژنومیکس و مهندسی ژنتیک، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج
3 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
4 - بخش ژنومیکس و مهندسی ژنتیک، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج

تاریخ دریافت : 1388/12/25 تاریخ پذیرش : 1389/02/25 تاریخ انتشار : 1389/01/12

کلید واژه: SDS-PAGE, L - آسپاراژیناز, اروینیا کریزانتمی, pAED4,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: آنزیم L - آسپاراژیناز داروی موثر در درمان لوکمی لنفوبلاستیک و لنفومای غیرهوچکینی است. مهم‌ترین باکتری‌های مولد این آنزیم باکتری‌های اشریشیا کلی و گونه‌های مختلف اروینیا به‌ویژه اروینیا کریزانتمی می‌باشند.هدف از این پژوهش، ارزیابی آنزیم L-آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی DSM 4610 بود. مواد و روش‌ها: در ابتدا DNA ژنومی باکتری استخراج و پس از طراحی پرایمرهای اختصاصی Echr Asn F و Echr Asn R1 آزمون PCR انجام شد.در مرحله بعد، این ژن درون وکتورpTZ57R/T الحاق و به درون سلول میزبان اشریشا کلی DH5α وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب استخراج گردیدند. پس از تعیین توالی، نتایج توسط نرم افزارDNAMAN مورد بررسی قرار گرفت. با طراحی پرایمرهای بیانی، همسانه سازی در ناقل pAED4 انجام شد و پس از تراریخت نمودن سلول‌های اشریشیا کلی BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. یافته‌ها: ژن جدا شده از سویه اروینیا کریزانتمی DSM4610 تفاوت‌های مشخصی با سایر ژن‌های مربوط به این آنزیم در بانک ژن داشت و با شماره دسترسی JF972567 در بانک ژن ثبت شد. بیشترین میزان بیان پروتئین پس از فرآیند بهینه‌سازی در شرایط. غلظت نیم میلی‌مولار IPTG ، محیط کشت LB Broth و دمای 37 درجه سانتی‌گراد حاصل گردید. الکتروفورز پروتئین روی ژل SDS-PAGE ، پروتئینی به وزن مولکولی تقریبا 5/37 کیلودالتون را نشان داد . نتیجه‌گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که آنزیم L-آسپاراژیناز باکتری اروینیا کریزانتمی، شرایط مناسب برای مطالعات بیشتر به عنوان یک آنزیم ضدلوکمی را دارد.

چکیده انگلیسی:

Background and objectives: L-asparaginases enzyme is an effective drugs for treatment of lymphoblasticleukemia and Non-Hodgkin's lymphoma. Escherichia coli and Erwinia strains specially Erwinia chrysanthemi are more important producers of this enzyme. The aim of this study was survey on L-asparaginase enzyme obtained from Erwinia chrysanthemi DSM4610. Materials and methods: After bacterial genomic DNA extraction, a PCR procedure was performed with specific primers, Echr Asn F and Echr Asn R1. At the next step, the amplified DNA segment were ligated in a pTZ57R/T vector and after transformation into E. coli DH5á, the recombinant plasmids were extracted. After sequencing, the results were analyzed by DNAMAN software. By designin its expression primers, the gene was cloned in a pAED4 vector and after transformation into E.coli BL21(DE3) cells, its expression was assessed by SDS-PAGE analysis. Results: The sequence of the isolated gene from Erwinia chrysanthemi DSM4610 was different from other similar genes in Gene Bank and was assigned with the accession number: JF972567 in Gene Bank. The most expression was found in the condition of 0.5 mM of IPTG, LB broth media and 37°C. SDS-PAGE analysis showed 37.5 KD protein. Conclusion: Results revealed that the L-asparaginase enzyme obtained of Erwinia chrysanthemi has proper features for further study as an antileukemia enzyme.

منابع و مأخذ:

1. Kotzia GA, Labrou NE. L-Asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937: cloning, expression and characterization. J Biothechnol. 2007; 127:657-669.

2. Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. Do bacterial L-asparaginase utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu?. J Biochem Biophys Acta . 2001; 1550:117-128.

3. Aghaiypour K, Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Er. Chrysanthemi L- asparaginase . J Biochem. 2001; 40: 5655-5664.

4. Huser A, Kloppner U, Rohm K. Cloning, sequence analysis and expression of ansB from Pseudomonas fluorescens, encoding periplasmic glutaminase/asparaginase. FEMS Microbial. 1999; 178:327-335.

5. Kotzia GA, Labrou NE. Cloning, expression and characterization of Erwinia carotovora L-asparaginase. J Biotechnol. 2005; 119: 309-323.

6. Lubkowski J, Palm GJ, Gilliland GL, Derst C, Rohm K, wlodawer A. Crystal structure and aminoacid sequence of wolinella succinogenes L-asparaginase. J  Biochem. 1996; 241:201-207.

7. Harms E, Wehner A, Aung HP, Rohm KH. A catalytic role for threonine-12 of E.coli asparaginaseII as established by site-directed mutagenesis. FEBS.1991; 285: 55-58.

8. Ferrara MA, Severino NMB, Mansure JJ, Martins AS, Oliveira  EMM, Siani AC, Pereira N, Torres FAG, Bon EPS. Asparaginase Production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring saccharomyces cervisiae Asp3 gene . Enz And Microbiol Technol. 2006; 39:1457-1463.

9. Kozak M, Borek D, Janowski R, Jaskolski M. Crystalization and preliminary crystallographic studies of five crystall forms of Escherichia coli L-asparaginaseII (Asp90 Glu mutant). Acta crystallogr D Biol  Crystallogr. 2002; 58:130-132.

10. Ward KR, Adams GDJ, Alpar HO, Irwin WJ. Protection of the enzyme L-asparaginase during lyophilisation–a molecular modelling approach to predict required level of lyoprotectant. J Pharmaceutics. 1999; 187:153-162.

11. Zhang YQ, Zhou WL, Shen WD, Chen YH, Zha XM, Shirai K, Kiguchi K. Synthesis, characterization and immunogenicity of silk fibroin–L-asparaginase bioconjugates. J Biotechnol. 2005; 120:315-326.

12. Maure AM. Therapy of Acute lymphoblastic leukemia in childhood. J Blood. 1980; 56: 1-10.

13. Filupa D, Nagle JW, Pulford S, Anderson DM. Sequence of L-asparaginase gene from Erwinia chrysanthemi NCPPB1125. Nucleic Acid Res. 1988; 16:10385.

14. Ye RW, Tao W, Bedzyk L, Young T, Chen M, Li L. Global gene expression profiles of Bacillus subtilis grownunder anaerobic condition. J Bacteriol. 2002; 182:4458-4465.

15. Minton NP, Bullman  HM, Scawen MD, Atkinson T, Gilbert HJ. Nucleotide sequence of the Erwinia chrysanthemi NCPPB 1066 L-asparaginase gene. J Gen Microbial .1986; 46:25-35.

16. Tilsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Brown S, Dijl JM. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. J Microbiol Mol Biol Rev. 2000; 64: 515-547.

17. Maita T, Morokuma K, Mastuda G. Amino acid sequence of L-asparaginase from E.coli. J Biochem. 1974; 76:1351-1354.

18. Perlman D, Halvorson HO. A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic signal peptides. J Mol Biol. 1983; 167:391-409.

19. Khushoo A, Pal Y, Singh BN, Mukherjee KJ. Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginaseII. protein Exp and purify. 2004; 38:29-36.

20. David T, Bonthron. L-AsparaginaseII of Escherichia coli K-12: cloning, mapping and sequencing of the ansB gene. Gene. 1990; 91:101-105.

21. Sinclair K, warner JP, Bonthron DT. The ASPI gene of saccharomyces cerevisiae, encoding the intracellular isozyme of L-asparaginase. J Gen Microbial. 1994; 144:37-43.

22. Catalog pET system manual (Novagen ) ten^th edition ٫ 2002.