ارزیابی اثرات ضدمیکروبی اسانس و نانوامولسیون اسانس سیر بر باکتری‌های جدا شده از مواد غذایی

محورهای موضوعی : مطالعات تجربی

اسما عزیزآبادی ¹ , اشرف کریمی نیک ^{2 *}

1 - گروه میکروبیولوژی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران
2 - گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان

تاریخ دریافت : 1404/02/18 تاریخ پذیرش : 1404/05/09 تاریخ انتشار : 1404/05/14

کلید واژه: اسانس سیر, نانوامولسیون, اثرات ضدباکتریایی, مواد غذایی,

چکیده مقاله :

با توجه به افزایش نیاز به حفظ کیفیت و پایداری محصولات فسادپذیر ، استفاده از اسانس و  نانوامولسیون آن‌ها به‌عنوان راهکارهایی نوین در افزایش پایداری میکروبی این محصولات مورد توجه قرار گرفته است. این تحقیق با هدف مقایسه اثرات ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر باکتری‌های بیماری‌زا و ارزیابی پتانسیل استفاده از نانوامولسیون‌های اسانس سیر در صنایع غذایی انجام شد. اسانس سیر از طریق تقطیر با بخار آب استخراج شد و ترکیبات آن با استفاده از روش کروماتوگرافی شناسایی گردید. نانوامولسیون اسانس سیر با استفاده از روش هموژنیزاسیون تهیه شد. سپس، اثرات ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر پنج باکتری اشرشیا کلی، سالمونلا انتریکا، سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز با استفاده از روش میکروتیتر پلیت ارزیابی شد. دی آلیل دی سولفید،تری سولفید دی پروپیل ، دی سولفید دی پروپیل  و دی آلیل سولفید ترکیبات اصلی اسانس بودند. نانوامولسیون اسانس سیر در مقایسه با اسانس خان، در غلظت‌های پایین‌تر اثرات ضدباکتریایی قوی‌تری داشت. نانوامولسیون سیر در مهار رشد باکتری‌ها، به ویژه در برابر لیستریا مونوسیتوژنز و سالمونلا انتریکا, به مراتب مؤثرتر از اسانس سیر بود. همچنین، نتایج نشان‌دهنده تأثیر بهبود یافته نانوامولسیون در کاهش حداقل غلظت مهارکنندگی  و حداقل غلظت کشندگی نسبت به اسانس خام بود. این مطالعه نشان می‌دهد که نانوامولسیون‌های اسانس سیر به دلیل پایداری بالاتر و اثرات ضدباکتریایی قوی‌تر، گزینه‌ای مناسب برای استفاده در صنایع غذایی به عنوان جایگزینی برای مواد نگهدارنده شیمیایی هستند. نانوامولسیون‌های سیر می‌توانند به عنوان یک سیستم طبیعی مؤثر در حفظ کیفیت و ایمنی محصولات غذایی به کار روند.

چکیده انگلیسی:

Given the increasing need to preserve the quality and stability of perishable products, the use of essential oils and their nanoemulsions has gained attention as innovative strategies for enhancing microbial stability. This study aimed to compare the antibacterial effects of garlic essential oil and its nanoemulsion on pathogenic bacteria and to assess the potential application of garlic essential oil nanoemulsions in the food industry. Garlic essential oil was extracted through steam distillation, and its chemical composition was identified using chromatography. The nanoemulsion of garlic essential oil was prepared using the homogenization method. The antibacterial effects of both garlic essential oil and its nanoemulsion were evaluated against five bacterial strains Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes using the microtiter plate method. The main components of the essential oil were diallyl disulfide, trisulfide di-2-propenyl, dipropyl disulfide, and diallyl sulfide. Compared to the crude essential oil, the nanoemulsion exhibited stronger antibacterial effects at lower concentrations. The garlic nanoemulsion was significantly more effective in inhibiting bacterial growth, particularly against Listeria monocytogenes and Salmonella enterica. Furthermore, the results indicated that the nanoemulsion significantly reduced the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) compared to the crude essential oil. This study demonstrates that garlic essential oil nanoemulsions, due to their higher stability and stronger antibacterial properties, are a promising alternative to chemical preservatives in the food industry. Garlic nanoemulsions can serve as an effective natural system for maintaining the quality and safety of food products.

منابع و مأخذ:


1. Angane, M., Swift, S., Huang, K., Butts, C. A., & Quek, S. Y. (2022). Essential oils and their major components: An updated review on antimicrobial activities, mechanism of action and their potential application in the food industry. Foods, 11(3), 464.
2. Aranda, K. R. S., Fagundes-Neto, U., & Scaletsky, I. C. A. (2004). Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp. Journal of clinical microbiology, 42(12), 5849-5853.
3. Bantawa, K., Rai, K., Subba Limbu, D., & Khanal, H. (2018). Food-borne bacterial pathogens in marketed raw meat of Dharan, eastern Nepal. BMC research notes, 11, 1-5.
4. Chen, H., & Zhong, Q. (2022). Physical and antimicrobial properties of self-emulsified nanoemulsions containing three synergistic essential oils. International journal of food microbiology, 365, 109557.
5. Chen, J.-Q., Healey, S., Regan, P., Laksanalamai, P., & Hu, Z. (2017). PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources. Food Science and Human Wellness, 6(2), 39-59.
6. Confessor, M. V. A., Agreles, M. A. A., Campos, L. A. d. A., Silva Neto, A. F., Borges, J. C., Martins, R. M.,…Cavalcanti, I. M. F. (2024). Olive oil nanoemulsion containing curcumin: antimicrobial agent against multidrug-resistant bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 108(1), 241.
7. Dehariya, N., Guha, P., & Gupta, R. K. (2021). Extraction and characterization of essential oil of garlic (Allium sativa L.). Int. J. Chem. Stud, 9(1), 1455-1459.
8. Espitia, P. J., Fuenmayor, C. A., & Otoni, C. G. (2019). Nanoemulsions: Synthesis, characterization, and application in bio‐based active food packaging. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18(1), 264-285.
9. Farazi, G., Asadi, G., & Gharachorloo, M. (2023). Investigating the Effect of Garlic Essential Oil Nanoemulsion Encapsulated with Arabic Gum on Antioxidant Activity, Shelf Life, and Sensory Properties of Flavored Olive Oil. Journal of food science and technology (Iran), 20(140), 96-112.
10. Hassanzadeh, H., Alizadeh, M., Hassanzadeh, R., & Ghanbarzadeh, B. (2022). Garlic essential oil‐based nanoemulsion carrier: release and stability kinetics of volatile components. Food Science & Nutrition, 10(5), 1613-1625.
11. Hu, G., Cai, K., Li, Y., Hui, T., Wang, Z., Chen, C.,…Zhang, D. (2021). Significant inhibition of garlic essential oil on benzo [a] pyrene formation in charcoal-grilled pork sausages relates to sulfide compounds. Food Research International, 141, 110127.
12. Kariminik, A., Moradalizadeh, M., Foroughi, M. M., Tebyanian, H., & Motaghi, M. M. (2019). Chemical composition and antibacterial activity of the essential oils extracted from 4 medicinal plants (Labiatae) of Kerman, Iran. Journal of Applied Biotechnology Reports, 6(4), 172-179.
13. Liu, M., Guo, W., Feng, M., Bai, Y., Huang, J., & Cao, Y. (2024). Antibacterial, anti-biofilm activity and underlying mechanism of garlic essential oil in water nanoemulsion against Listeria monocytogenes. LWT, 196, 115847.
14. Liu, M., Pan, Y., Feng, M., Guo, W., Fan, X., Feng, L.,…Cao, Y. (2022). Garlic essential oil in water nanoemulsion prepared by high-power ultrasound: Properties, stability and its antibacterial mechanism against MRSA isolated from pork. Ultrasonics Sonochemistry, 90, 106201.
15. Mehrotra, M., Wang, G., & Johnson, W. M. (2000). Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance. Journal of clinical microbiology, 38(3), 1032-1035.
16. Paolino, D., Mancuso, A., Cristiano, M. C., Froiio, F., Lammari, N., Celia, C., & Fresta, M. (2021). Nanonutraceuticals: The new frontier of supplementary food. Nanomaterials, 11(3), 792.
17. Rattanachaikunsopon, P., & Phumkhachorn, P. (2008). Diallyl sulfide content and antimicrobial activity against food-borne pathogenic bacteria of chives (Allium schoenoprasum). Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 72(11), 2987-2991.
18. Satyal, P., Craft, J. D., Dosoky, N. S., & Setzer, W. N. (2017). The chemical compositions of the volatile oils of garlic (Allium sativum) and wild garlic (Allium vineale). Foods, 6(8), 63.
19. Seow, Y. X., Yeo, C. R., Chung, H. L., & Yuk, H.-G. (2014). Plant essential oils as active antimicrobial agents. Critical reviews in food science and nutrition, 54(5), 625-644.
20. Sepahvand, F., Rashidian, E., Jaydari, A., & Rahimi, H. (2022). Prevalence of Listeria monocytogenes in raw milk of healthy sheep and goats. Veterinary Medicine International, 2022(1), 3206172.
21. Sharma, S., Mulrey, L., Byrne, M., Jaiswal, A. K., & Jaiswal, S. (2022). Encapsulation of essential oils in nanocarriers for active food packaging. Foods, 11(15), 2337.
22. Sindhu, M., Rajkumar, V., Annapoorani, C. A., Gunasekaran, C., & Kannan, M. (2023). Nanoencapsulation of garlic essential oil using chitosan nanopolymer and its antifungal and anti-aflatoxin B1 efficacy in vitro and in situ. International journal of biological macromolecules, 243, 125160.
23. Swangsri, T., Reamtong, O., Saralamba, S., Rakthong, P., Thaenkham, U., & Saralamba, N. (2024). Exploring the antimicrobial potential of crude peptide extracts from Allium sativum and Allium oschaninii against antibiotic-resistant bacterial strains. Pharmaceutical biology, 62(1), 666-675.
24. Tao, J.-j., Xiang, J.-j., Jiang, M., Kuang, S.-f., Peng, X.-x., & Li, H. (2022). A microtitre plate dilution method for minimum killing concentration is developed to evaluate metabolites-enabled killing of bacteria by β-lactam antibiotics. Frontiers in Molecular Biosciences, 9, 878651.
25. Vaičiulytė, V., Ložienė, K., & Taraškevičius, R. (2022). Impact of edaphic and climatic factors on Thymus pulegioides essential oil composition and potential prevalence of chemotypes. Plants, 11(19), 2536.
26. Wu, C.-Y., Wang, C.-Y., Sun, G.-J., Li, Y.-Q., Liang, Y., Hua, D.-L.,…Mo, H.-Z. (2023). Antibacterial characteristics of allyl methyl disulfide and dimethyl trisulfide of Allium tenuissimum flower essential oil against Escherichia coli O157: H7. Industrial Crops and products, 202, 117058.

متن کامل:



مجله میکروب شناسی مواد غذایی                                                                                     

ارزیابی اثرات ضدمیکروبی اسانس و نانوامولسیون اسانس سیر بر باکتری‌های جدا شده از مواد غذایی

اسما عزیزآبادی1،2، اشرف کریمی نیک1⃰

1.گروه میکروبیولوژی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران

2.مرکز تحقیقات ایمن سازی مواد غذایی و کشاورزی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران

 ⃰نویسنده مسئول، پست الکترونیک : [e-mail] 

 

چکیده

با توجه به افزایش نیاز به حفظ کیفیت و پایداری محصولات فسادپذیر، استفاده از اسانس و  نانوامولسیون آن‌ها به‌عنوان راهکارهایی نوین در افزایش پایداری میکروبی این محصولات، مورد توجه قرار گرفته است. این تحقیق با هدف مقایسه اثرات ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر باکتری‌های بیماری‌زا و ارزیابی پتانسیل استفاده از نانوامولسیون‌های اسانس سیر در صنایع غذایی انجام شد. اسانس سیر به روش تقطیر با بخار آب استخراج شد و ترکیبات آن با استفاده از روش کروماتوگرافی شناسایی گردید. نانوامولسیون اسانس سیر با استفاده از روش هموژنیزاسیون تهیه شد. سپس اثرات ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر پنج باکتری اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز با استفاده از روش میکروتیتر پلیت، ارزیابی شد. دی آلیل دی سولفید، تری‌سولفید دی پروپیل، دی سولفید دی پروپیل و دی آلیل سولفید، ترکیبات اصلی اسانس بودند. نتایج این پژوهش نشان داد نانوامولسیون اسانس سیر نسبت به فرم خام آن، اثر ضدباکتریایی قوی‌تری بر پنج گونه پاتوژن غذایی دارد. این برتری در تمامی غلظت‌های مورد بررسی مشهود بوده و بیشترین حساسیت مربوط به سالمونلا انتریکا با مهار رشد 99.89٪ در غلظت 1.56 µg/ml بود. مقادیر حداقل غلظت بازدارندگی رشد و کشندگی در نانوفرمولاسیون به‌طور معناداری کاهش یافته و آزمون‌های آماری نیز تفاوت‌های معنادار بین غلظت‌ها را تأیید کردند (p<0.001). یافته‌ها پتانسیل بالای کاربرد نانوامولسیون سیر را در صنایع غذایی به عنوان یک نگهدارنده طبیعی و مؤثر نشان می‌دهد.

کلمات کلیدی: اسانس سیر، نانوامولسیون، اثرات ضدباکتریایی، مواد غذایی

 

 

 

 

 

 

مقدمه

در دهه‌های اخیر، افزایش نگرانی‌ها نسبت به مصرف مواد نگهدارنده شیمیایی در صنعت غذا و دارو، پژوهشگران را به سوی بهره‌گیری از ترکیبات زیست‌فعال طبیعی سوق داده است. اسانس‌های گیاهی، به‌عنوان منابعی غنی از ترکیبات فنولی، ترپنوئیدی و آلی‌سولفیدی، به دلیل اثرات ضدمیکروبی، آنتی‌اکسیدانی و ایمنی بالا، در تحقیقات علمی به طور ویژه ای مورد توجه قرار گرفته اند. استفاده از اسانس‌ها در صنایع غذایی به دلیل ویژگی‌های ضدباکتریایی، ضدویروسی و طعم‌دهی برجسته، اهمیت فراوانی دارد. در میان اسانس‌های گیاهی، اسانس سیر (Allium sativum) به سبب دارا بودن ترکیبات گوگردی فعال مانند: آلیسین، دی‌آلیل دی‌سولفید و سایر ترکیبات فرار، دارای فعالیت‌های ضدمیکروبی قابل‌توجهی در برابر طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و مولد فساد می‌باشد .(Swangsri et al., 2024)با این حال، به کارگیری مستقیم اسانس سیر در محصولات غذایی با چالش‌هایی مانند ناپایداری در مقابل نور، حرارت و اکسیداسیون، همچنین طعم تند و ناخوشایند آن مواجه است که مانع از بهره‌برداری گسترده و مؤثر از این اسانس در صنعت غذا می‌شود(Espitia et al., 2019). به منظور فائق آمدن بر این محدودیت‌ها، فناوری‌های نوین تحویل هدفمند، به‌ویژه استفاده از نانوامولسیون‌ها، مورد توجه قرار گرفته‌اند. نانوامولسیون‌ها که به‌عنوان سیستم‌های کلوئیدی با اندازه قطره‌ای کمتر از 200 نانومتر، شناخته می‌شوند، به دلیل ویژگی‌های خاص خود از جمله سطح تماس بالا، قابلیت رهایش کنترل‌شده، و پایداری بالا در برابر شرایط محیطی مختلف، در بهبود کارایی اسانس‌ها مؤثر هستند(Chen & Zhong, 2022). این سیستم‌ها با افزایش پایداری اسانس‌ها، می‌توانند از تجزیه آن‌ها در برابر نور و حرارت جلوگیری کنند و همچنین اثرات جانبی طعمی ناخواسته را کاهش دهند. نانوامولسیون‌ها علاوه بر افزایش پایداری، توانایی بهبود حل‌پذیری اسانس‌ها در محیط‌های آبی را دارند. این ویژگی می‌تواند در بهبود انتشار اسانس‌ها در محصولات غذایی کمک کند و تأثیر آن‌ها را در طعم‌دهی و خواص ضدباکتریایی افزایش دهد. مطالعات اخیر همچنین نشان داده‌اند که نانوامولسیون‌ها می‌توانند در ایجاد سیستم‌های تحویل هوشمند برای اسانس‌ها نقش مهمی ایفا کنند، به‌طوری که رهایش اسانس‌ها تنها در مواقع نیاز به‌طور دقیق و کنترل‌شده انجام شود. این قابلیت می‌تواند در توسعه محصولات غذایی با خواص بهبود یافته و تأثیرات ضدباکتریایی و ضدویروسی مؤثرتر بسیار مفید باشد(Confessor et al., 2024). در این مطالعه، هدف بررسی تأثیرات ضدمیکروبی اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر روی چندین باکتری مولد فساد مواد غذایی، از جمله اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیتوژنز، سودوموناس ائروژینوزا و سالمونلا انتریکا، می‌باشد. از نظر کاربردی، نتایج این تحقیق می‌تواند منجر به توسعه بسته‌بندی‌های فعال زیست‌پایه یا پوشش‌های خوراکی با منشأ طبیعی شود که علاوه بر افزایش ایمنی و ماندگاری محصولات غذایی، نیاز به مواد نگهدارنده سنتتیک را کاهش داده و پذیرش مصرف‌کنندگان را ارتقاء دهد.

روش کار

استخراج اسانس سیر و  شناسایی ترکیبات آن

سیر با نام علمی Allium sativum L. پس از برداشت در فصل تابستان از مزارع کشاورزی منطقه کرمان (زرند)، جمع‌آوری شده و به‌مدت پنج روز در شرایط سایه و در دمای محیط خشک گردید. سپس نمونه‌های خشک‌شده به‌صورت پودر در‌آمدند. اسانس سیر به روش تقطیر با بخار آب و با استفاده از دستگاه کلونجر استخراج شد. به‌منظور شناسایی ترکیبات موجود در اسانس، آنالیز با دستگاه گاز کروماتوگرافی متصل به طیف‌سنج جرمی (GC/MS) صورت گرفت. شناسایی مواد تشکیل‌دهنده بر اساس مقایسه طیف‌های جرمی و شاخص‌های بازداری حاصل با داده‌های مربوط به ترکیبات استاندارد انجام پذیرفت. درصد نسبی هر یک از ترکیبات نیز با محاسبه سطح زیر منحنی کروماتوگرام‌ها تعیین شد. به‌طور کلی، تعیین اجزای اصلی اسانس از طریق تحلیل طیف‌های جرمی و محاسبه شاخص بازداری آن‌ها صورت گرفت(Kariminik et al., 2019). 

تهیه نانوامولسیون‌ اسانس سیر

برای تهیه نانوامولسیون، از روش هموژنیزاسیون به کمک سورفکتانت غیر یونی تویین 80، استفاده شد. در این فرایند، اسانس سیر به عنوان بخش اصلی فاز روغنی به‌کار گرفته شد. ابتدا مقدار مشخصی از اسانس سیر با روغن گیاهی مخلوط گردید تا یک فاز روغنی همگن حاصل شود. سپس، برای تثبیت امولسیون و کاهش کشش سطحی بین فازهای آبی و روغنی، بین 1 تا 5 درصد وزنی تویین 80 به این مخلوط افزوده شد. در ادامه، فاز آبی به‌آرامی و به‌صورت تدریجی به ترکیب افزوده گردید و با هم‌زدن کامل، یک امولسیون اولیه شکل گرفت. امولسیون اولیه حاصل، تحت فرآیند هموژنیزاسیون با دور بالا قرار گرفت تا اندازه قطرات فاز روغنی به محدوده نانومتری (کمتر از 100 نانومتر) کاهش یابد. به‌منظور بررسی اندازه و مورفولوژی ذرات تشکیل‌شده، از میکروسکوپ الکترونی روبشی، استفاده شد(Hassanzadeh et al., 2022).

جداسازی و شناسایی باکتری‌های پاتوژن از مواد غذایی 

جداسازی باکتری های سالمونلا انتریکا از گوشت مرغ و اشریشیا کلی، سودوموناس ائروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس از گوشت گاو قصابی ها و لیستریا مونوسیتوژنز از شیر خام انجام گرفت. تمامی ارزیابی ها مطابق با استاندارد متدهای میکروبی معتبر انجام گرفت. نمونه‌های گوشتی شامل مرغ و گوشت گاو تحت شرایط کاملاً استریل جمع‌آوری شدند. از هر نمونه، ۲۵ گرم به صورت تصادفی از نقاط مختلف محصول برداشته شد و در ۲۲۵ میلی‌لیتر آب پپتون بافر شده هموژنیزه گردید. جهت رشد باکتری های اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز به ترتیب از محیط کشت مکانکی آگار، زایلوز لیزین دی اکسی کولات آگار، ستریماید آگار، و بلاد آگار استفاده شد. پلیت ها به مدت 24 ساعت در دمای مناسب هر باکتری گرمخانه گذاری شدند. پس از رشد باکتری ها و تشکیل کلنی، تست های تشخیصی و بیوشیمیایی از قبیل: اکسیداز،کاتالاز، اوره از، تخمیر قند، حرکت و ایندول برای شناسایی هر باکتری انجام شد(Bantawa et al., 2018; Sepahvand et al., 2022).

آزمون مولکولی و بررسی حضور ژن ویرولانس در باکتری‌های جدا شده از مواد غذایی

استخراج DNA با استفاده از کیت تجاری سیناژن انجام شد. جهت تعیین کیفیت DNAهای استخراج شده، دستگاه نانودراپ در طول موج­های 260 و 280 نانومتر به ترتیب برای بررسی میزان جذب DNA و پروتئین­ها وتعیین میزان خلوص DNA انجام گردید.  لیست پرایمرهای مورد استفاده جهت تکثیر ژن های ویرولانس هدف در جدول (1)، ذکر شده است(Aranda et al., 2004; Chen et al., 2017; Mehrotra et al., 2000). مخلوط واکنش پی‌سی‌آر در حجم کل ۲۰ میکرولیتری تهیه شد که شامل موارد زیر است: مسترمیکس به میزان ۱۰ میکرولیتر، هر یک از پرایمرهای فوروارد و ریورس به میزان ۱ میکرولیتر، DNA به میزان ۴ میکرولیتر، و آب دیونیزه استریل به میزان ۴ میکرولیتر. برنامه سیکل دمایی به صورت زیر اجرا شد: مرحله دناتوراسیون اولیه در ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه. سپس، سیکل‌های پی‌سی‌آر (تعداد ۳۵ سیکل) شامل مراحل زیر بودند: دناتوراسیون در ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ ثانیه، اتصال پرایمر در دمای ۵۵-۶۰ درجه سانتی‌گراد (بسته به نوع پرایمر) به مدت ۳۰ ثانیه، و پلیمریزاسیون در ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱ دقیقه. مرحله پلیمریزاسیون نهایی در ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۷ دقیقه انجام شد. در نهایت، محصول پی‌سی‌آر با استفاده از تکنیک الکتروفورز در ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

 

جدول 1: توالی پرایمرهای مورد استفاده

باکتری	ژن هدف	توالی پرایمر (۵’→۳’)	طول محصول (bp)
اشریشیا کلی	lt	F: GGCGACAGATTATACCGTGC	۴۵۰
		R: CGGTCTCTATATTCCCTGTT
استافیلوکوکوس اورئوس	sea	F: GGTTATCAATGTGCGGGTGG	۲۷۰
		R: CGGCACTTTTTTCTCTTCGG
سودوموناس آئروژینوزا	exoS	F: GAGGAGGCCGATGAGTCG	۳۵۰
		R: TCCTCGCCAGTTCGTTTC
سالمونلا انتریکا	stn	F: ATGATGTAATTTCTATCGTC	۲۶۰
		R: TTAATGCTAGTTCTGTTTG
لیستریا مونوسایتوژنز	hlyA	F: CGGAGGTTCCGCAAAAGATG	۳۰۰
		R: CCTCCAGAGTGATCGATGTT

 

 

بررسی فعالیت ضدباکتریایی اسانس سیر با استفاده از روش میکروتیتر پلیت

فعالیت ضدباکتریایی اسانس سیر با استفاده از روش میکروتیتر پلیت بر باکتری های جدا شده از موادغذایی و مورد تایید قرار گرفته به روش مولکولی، مورد بررسی قرار گرفت. غلظت‌های اسانس شامل 0.39، 0.78، 1.56، 3.12، 6.25 و 12.5 µg/ml در محیط مولر هینتون براث تهیه شدند. از دی متیل سولفوکسید یک درصد به عنوان کنترل منفی و سیپروفلوکساسین (5/0 – ۱۲۸ µg/ml) به عنوان کنترل مثبت، استفاده گردید. از سویه‌های باکتریایی اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا انتریکا، و لیستریا سوسپانسیون باکتریایی در محلول سرم فیزیولوژی استریل تهیه شد و غلظت آن با استاندارد نیم مک فارلند (~ CFU/ml 5/1 × ۱۰8) تنظیم گردید. در این آزمایش، از میکروپلیت‌های ۹۶ خانه استفاده شد. ستون‌های ۱ تا ۶ هر یک با ۱۰۰ میکرولتر از غلظت‌های مختلف اسانس سیر، پر شدند. ستون ۷ به عنوان کنترل رشد، شامل باکتری و محیط مولر هینتون براث، قرار گرفت. ستون ۸ به عنوان کنترل منفی، شامل محیط مولر هینتون براث و دی متیل سولفوکسید یک درصد، بود. در نهایت، به ستون ۹ به عنوان کنترل مثبت، ۱۰۰ میکرولتر آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین افزوده شد. به تمام خانه‌های ستون‌های ۱ تا ۷ و ۹، µl ۱۰۰ سوسپانسیون باکتری (~ CFU/ml 5/1 × ۱۰8) اضافه شد. پلیت به مدت ۱۸-۲۴ ساعت در دمای37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. پس از فرآیند انکوباسیون، حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC¹) تعیین شد، که شامل کمترین غلظتی از اسانس است که عدم رشد باکتری را در خانه‌های پلیت نشان می‌دهد. این ارزیابی هم به صورت دیداری با چشم غیرمسلح و هم با استفاده از میکروپلیت ریدر در OD₆₀₀ انجام شد. برای تعیین حداقل غلظت کشندگی(MBC²)، از کمترین غلظت‌هایی که نشان‌دهنده عدم رشد کامل یا رشد ضعیف بودند، مقدار 10 میکرولیتر نمونه برداشته و بر روی محیط مولرهینتون آگار کشت داده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای مناسب، عدم رشد کامل به‌عنوان MBC در نظر گرفته شد. همچنین، برای بررسی فعالیت ضدباکتریایی نانوامولسیون اسانس سیر، از روش مشابه با روش مورد استفاده برای اسانس سیر بهره گرفته شد(Tao et al., 2022). 

بررسی آماری

تحلیل‌های آماری این پژوهش با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 23 انجام شد. برای مقایسه میانگین داده‌ها، از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) بهره گرفته شد و جهت بررسی تفاوت‌های معنادار بین گروه‌ها، آزمون تعقیبی توکی (Tukey’s post-hoc test) و آزمون چند دامنه‌ای دانکن (Duncan’s multiple range test) مورد استفاده قرار گرفتند. تمامی تحلیل‌ها در سطح معنی‌داری 5 ٪ (p < 0.05) انجام پذیرفتند.

نتایج

بر اساس نتایج حاصل از آنالیز ترکیبات شیمیایی اسانس سیر، در‌‌‌‌مجموع 22 ترکیب مختلف شناسایی گردید. از میان این ترکیبات، چهار ماده اصلی با بیشترین فراوانی به‌ترتیب: دی آلیل دی سولفید (60.15 ٪)، تری سولفید دی پروپیل (14.22٪)، دی پروپیل دی سولفید (9.16 ٪) و دی آلیل سولفید (5.64 ٪) بودند. این ترکیبات بخش عمده‌ای از محتوای شیمیایی اسانس را تشکیل داده و مسئول ویژگی‌های بیولوژیکی و آروما آن می‌باشند. بررسی نانوامولسیون سیر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی در بزرگنمایی 29,600 برابر و فاصله کاری 4.54 میلی‌متر، ساختارهایی در مقیاس نانومتری با وضوح بالا را به‌نمایش گذاشت. همان‌طور که در شکل(1)، مشاهده می‌شود، نانوذرات سیر عمدتاً دارای شکل کروی تا بیضوی هستند و اندازه آن‌ها در محدوده‌ای بین 50 تا 200 نانومتر قرار دارد؛ این مقادیر با گزارش‌های پیشین پیرامون نانوفرمولاسیون‌های اسانس سیر همخوانی دارند. پراکندگی ذرات نسبتاً یکنواخت است؛ با این حال، حضور تعداد اندکی تجمعات کوچک (آگلومره) قابل مشاهده است که می‌تواند ناشی از ماهیت هیدروفوب ترکیبات گوگردی موجود در اسانس باشد. سطح نانوذرات دارای ناهمواری‌های مشخصی است که احتمالاً به‌دلیل حضور ترکیبات فنولی و پلی‌ساکاریدی در ترکیب شیمیایی اسانس سیر می‌باشد. کیفیت تصاویر حاصل نیز به‌دلیل کنتراست مطلوب (B1: 7.00) و تنظیمات بهینه دستگاه (WD: 4.54 mm) بالا بوده و امکان مشاهده دقیق و واضح مرزهای میان ذرات را فراهم ساخته است.

 

---

[1]  Minimum inhibitory concentration

[2]  Minimum bactericidal concentration

شکل 1: تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانوامولسیون سیر

 

 

بر اساس آزمایش‌های بیوشیمیایی و تشخیصی باکتری‌شناسی انجام‌شده، گونه‌های باکتریایی شامل: اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا انتریکا، و لیستریا مونوسایتوژنز از نمونه‌های مواد غذایی جداسازی گردیدند. سپس، این جدایه‌ها از نظر وجود ژن‌های هدف با استفاده از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، مورد بررسی قرار گرفتند. سویه‌هایی که در این آزمون نتیجه مثبت نشان دادند، در مراحل بعدی برای بررسی فعالیت ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن مورد استفاده قرار گرفتند.

 

 

 

شکل 2: ژل الکتروفورز محصول پی سی ار تکثیر ژن های ویرولانس باکتری های جدا شده از موادغذایی ،M: مارکر مولکولی100 جفت بازی، ژن های هدف شامل: hlyA لیستریا مونوسایتوژنز(bp ۳۰۰)، sea استافیلوکوکوس اورئوس( bp ۲۷۰)، stn سالمونلا انتریکا(bp 260)، lt اشرشیا کلی(bp ۴۵۰) و exoS  سودوموناس آئروژینوزا(bp ۴۵۰).

 

 

نتایج اثرات ضدباکتریایی اسانس و نانوامولسیون اسانس سیر بر باکتری های جدا شده از مواد غذایی

نانوامولسیون سیر، به دلیل اندازه کوچک ذرات آن (در بازه ۵۰ تا ۲۰۰ نانومتر) و افزایش نفوذپذیری، توانست در غلظت‌های بسیار پایین‌تر حتی 0.19 µg/ml برای لیستریا) اثرات مهاری قوی‌تری از خود نشان دهد. مکانیسم احتمالی این عملکرد شامل تخریب دیواره سلولی باکتری و افزایش استرس اکسیداتیو بوده که موجب مرگ سریع‌تر سلول‌های باکتریایی شده است. شاخص‌های MIC و MBC بر اساس اندازه‌گیری چگالی نوری پس از انکوباسیون با غلظت‌های معین از اسانس و نانوامولسیون سیر محاسبه گردیدند(جدول ۲). همچنین، میزان مهار نسبی رشد باکتری بر اساس فرمول ذیل محاسبه شد.

 

مهار رشد = (%) 

جدول 2: میزان بازدارندگی رشد باکتری‌ها در برابر غلظت‌های مختلف اسانس و نانوامولسیون سیر (اعداد اول و دوم به ترتیب نمایانگر درصد مهار رشد توسط اسانس سیر و نانوامولسیون سیر می باشند).

غلظت (µg/ml)	اشریشیا کلی	استافیلوکوکوس اورئوس	سودوموناس آئروژینوزا	سالمونلا انتریکا	لیستریا مونوسایتوژنز
۰.۰۹۷	۷.۶ / ۱۵.۲	۷.۴ / ۲۶.۳	۱۲.۳۵ / ۳۲.۸۵	۱۲.۰۸ / ۲۰.۸۷	۱۴.۷۲ / ۳۰.۶۸
۰.۱۹۵	۱۳ / ۲۹.۳	۲۱ / ۵۲.۶	۲۱.۳۴ / ۵۵.۱	۱۲.۰۸ / ۳۶.۲۶	۲۶.۱۳ / ۶۰.۲۲
۰.۳۹	۲۱.۷ / ۴۵.۷	۴۷.۴ / ۹۱.۵۷	۳۸.۲ / ۷۱.۹	۱۹.۷۸ / ۵۰.۵۴	۴۸.۸۷ / ۸۶.۳۷
۰.۷۸	۹۳.۴۷ / ۹۷.۸۲	۷۳.۷ / ۹۶.۷۵	۶۰.۶۷ / ۸۸.۸	۹۴.۵ / ۹۷.۸	۶۲.۵ / ۹۴.۳۲
۱.۵۶	۹۶.۷۳ / ۹۸.۹۱	۹۱.۳۷ / ۹۵.۲۶	۶۸.۵۳ / ۹۱.۵۷	۹۶.۹۳ / ۹۹.۸۹	۷۱.۶۱ / ۹۷.۷۳

 

 

یافته‌های حاصل از ارزیابی فعالیت ضدباکتریایی اسانس سیر و نانوامولسیون آن علیه پنج گونه از باکتری‌های بیماری‌زای غذایی، نشان‌دهنده برتری قابل توجه نانوفرمولاسیون نسبت به فرم خام اسانس است. بر پایه نتایج ارائه‌شده در جدول(۲)، نانوامولسیون سیر در کلیه غلظت‌های مورد آزمایش در بازه 0.097 تا µg/ml 1.56، میزان بالاتری از مهار رشد باکتریایی را نسبت به اسانس خام نشان داد. در میان باکتری‌های مورد بررسی، سالمونلا انتریکا بیشترین حساسیت را نسبت به تیمارها از خود نشان داد. در این باکتری، نانوامولسیون سیر در غلظت 1.56 µg/ml موفق به مهار رشد باکتری به میزان 99.89٪ شد که به‌عنوان MIC نانو در نظر گرفته شد؛ در حالی‌که همین میزان مهار در اسانس سیر تنها در غلظت 3.12 µg/ml حاصل شد. همچنین در غلظت 0.78 µg/ml، میزان مهار رشد توسط نانوامولسیون 97.5٪ و در اسانس خام 94.5٪ گزارش گردید. این تفاوت‌ها بیانگر عملکرد بهبود یافته نانوفرمولاسیون در افزایش اثربخشی ضدباکتریایی اسانس سیر می‌باشد. در غلظت‌های پایین (0.097 و 0.195 µg/ml)، باکتری اشریشیا کلی مقاومت نسبی در برابر هر دو ترکیب نشان داد ، به‌طوری‌که مهار رشد با اسانس 7.6٪ و با نانوامولسیون 13٪ بود. با افزایش غلظت به 0.39 µg/ml، این مقدار به‌ترتیب به 21.7٪ و 45.7٪ رسید که بیانگر اثربخشی بالاتر نانوامولسیون است. در غلظت‌های 0.78 و 1.56 µg/ml، باکتری کاملاً حساس شد و مهار رشد به‌طور چشمگیری افزایش یافت. برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، نیز روند مشابهی مشاهده شد. در غلظت‌های پایین، مقاومت نسبت به هر دو ترکیب وجود داشت. اما در غلظت 0.39 µg/ml، مهار رشد با اسانس به 47.4٪ و با نانوامولسیون به 91.57٪ رسید. در غلظت‌های بالاتر، نانوامولسیون همچنان عملکرد قوی‌تری داشت؛ به‌طوری‌که در حالی‌که اسانس 91.37٪ مهار رشد ایجاد کرد، نانوامولسیون به 95.26٪ رسید. سودوموناس آئروژینوزا در برابر هر دو ترکیب، به‌ویژه در غلظت‌های پایین، مقاومت نشان داد. با افزایش غلظت به 0.78 µg/ml، مهار رشد با اسانس به 60.67٪ و با نانوامولسیون به 88.8٪ رسید، که برتری چشمگیر نانوامولسیون را نشان می‌دهد. در غلظت 1.56 µg/ml، نانوامولسیون به مهار 91.57٪ دست یافت و اثربخشی قوی‌تری را نسبت به اسانس نشان داد. در مورد سالمونلا انتریکا نیز در غلظت‌های پایین مقاومت مشاهده شد، اما با افزایش غلظت به 0.78 و 1.56 µg/ml، میزان مهار رشد به‌ترتیب به 94.5٪ (اسانس) و 96.93٪ (نانوامولسیون) افزایش یافت. این یافته‌ها گویای اثربخشی بالای نانوامولسیون در کنترل این پاتوژن غذایی هستند. لیستریا مونوسایتوژنز نیز در غلظت‌های پایین مقاومت نشان داد، اما با افزایش غلظت، مهار رشد به 62.5٪ برای اسانس و 94.32٪ برای نانوامولسیون رسید. در غلظت 1.56 µg/ml، نانوامولسیون توانست مهار رشد 93.73٪ ایجاد کند. شکل (۳)، حداقل غلظت بازدارندگی رشد (MIC) اسانس و نانوامولسیون سیر را برای پنج باکتری بررسی‌شده نمایش می‌دهد. نتایج به‌روشنی نشان می‌دهد که نانوامولسیون سیر در تمامی موارد عملکرد مؤثرتری نسبت به اسانس خام دارد. به‌طور خاص، در اشریشیا کلی و  سالمونلا انتریکا،MIC نانوامولسیون به 1.56 µg/ml کاهش یافته که نسبت به MIC اسانس به‌معنای بهبود دوبرابری اثر مهاری است. این کاهش در  لیستریا مونوسایتوژنز نیز دیده می‌شود، جایی که MIC از 6.25 به 3.12 µg/ml رسید. اثربخشی نانوفرمولاسیون در استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا،  حتی چشمگیرتر بود؛ به‌گونه‌ای که MIC اسانس به ترتیب از 12.5 و 25 µg/ml به 3.12 و 6.25 µg/ml کاهش یافت، که حاکی از افزایش چهار برابری قدرت مهاری نانوامولسیون است.

 

 

 

 

شکل 3: مقایسه حداقل غلظت بازدارندگی از رشد (MIC) بین اسانس سیر و نانوامولسیون آن در برابر باکتری‌های مورد مطالعه

 

 

نتایج حاصل از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی(جدول 3)، نشان‌دهنده تفاوت‌های معنادار آماری در اثرات مهاری نانوامولسیون سیر بر رشد پنج باکتری پاتوژن غذایی در غلظت‌های مختلف بود. برای تمامی باکتری‌های مورد مطالعه، شامل اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا انتریکا و لیستریا مونوسایتوژنز، مقادیر p-value کمتر از 0.001 به دست آمد که بیانگر وجود تفاوت‌های بسیار معنادار بین گروه‌های تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوامولسیون سیر بود.

نتایج آزمون توکی برای مقایسه‌های چندگانه نشان داد که در تمام گونه‌های باکتریایی مورد بررسی، افزایش غلظت نانوامولسیون سیر به‌طور معنادار و تصاعدی موجب افزایش میزان مهار رشد شد. در این میان، سالمونلا انتریکا بیشترین حساسیت را نسبت به نانوامولسیون از خود نشان داد، در حالی که سودوموناس آئروژینوزا کمترین حساسیت را داشت. همچنین، در مورد استافیلوکوکوس اورئوس، غلظت 0.78 µg/ml باعث مهار رشدی برابر با 73.7٪ گردید. این نتایج به‌وضوح بیانگر آن‌اند که نانوفرمولاسیون اسانس سیر نسبت به فرم خام آن، به دلیل افزایش سطح تماس و نفوذ بهتر ذرات در غشای سلولی باکتری‌ها، از اثربخشی ضدباکتریایی بالاتری برخوردار است. این تأثیرات از نظر آماری کاملاً معنادار بوده و شواهد محکمی برای پشتیبانی از کاربردهای بالقوه بالینی و صنعتی نانوامولسیون سیر به‌عنوان یک عامل ضد میکروبی طبیعی فراهم می‌آورد.

 

جدول3: نتایج تحلیل  آماری اثرات اسانس سیر و نانوامولسیون آن بر هر باکتری

باکتری	F-value	p-value	نتایج Tukey (غلظت‌های متفاوت)
اشریشیا کلی	45.6	<0.001	0.097≠ 0.78 ≠ 1.56
استافیلوکوکوس اورئوس	62.3	<0.001	0.097 ≠ 0.195 ≠ 0.78
سودوموناس ائروژینوزا	38.9	<0.001	0.097≠ 0.78 ≠ 1.56
سالمونلا انتریکا	51.2	<0.001	0.195 ≠ 0.78 ≠ 1.56
لیستریا مونوسایتوژنز	75.8	<0.001	0.097≠ 0.39≠ 0.78

* 0.05 p -value <  نشان‌دهنده تفاوت معنادار بین غلظت‌هاست.

** نتایج Tukey: غلظت‌هایی که حروف متفاوت دارند (≠)، از نظر آماری تفاوت معنادار دارند.

 

بحث

با توجه به ضرورت حفظ کیفیت و افزایش پایداری محصولات فسادپذیر در طول نگهداری، استفاده از سامانه‌های طبیعی مانند نانوامولسیون‌ها و هیدروژل‌ها به‌عنوان رویکردهای نوین و مؤثر برای بهبود پایداری میکروبی مورد توجه روزافزون قرار گرفته است. در این پژوهش، اسانس سیر حاوی ۲۲ ترکیب شیمیایی شناسایی‌شده بود که ترکیبات غالب آن شامل دی‌آلیل دی‌سولفید (60.15٪)، تری‌سولفید دی‌پروپیل (14.22٪)، دی‌سولفید دی‌پروپیل (9.16٪) و دی‌آلیل سولفید (5.64٪)، بودند. در پژوهش دهاریا و همکاران (2021)، مشخص گردید که بیشترین ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس سیر به ترتیب شامل دی آلیل دی سولفید(48.42٪)، دی آلیل سولفید(7.64٪)، آلیل متیل دی‌سولفید(7.27٪)، دی.2.پروپنیل و تری سولفید(3.46٪) می‌باشند(Dehariya et al., 2021). همچنین آنالیز اسانس سیر توسط سینجو و همکاران(2021)، نشان داد که فراوان‌ترین ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس سیر به ترتیب: آلیل متیل تری سولفید(23.10٪) و دی آلیل سولفید(19.47٪) هستند(Sindhu et al., 2023). مقایسه ترکیبات اصلی متشکله اسانس سیر در تحقیق حاضر و تحقیقات مشابه بیانگر آن است که ترکیبات آلیل به ویژه آلیل تری سولفات از ترکیبات مشترک و شاخص اسانس سیر به شمار رفته و دلیل خاصیت ضد میکروبی اسانس سیر نیز به همین ترکیبات مربوط می باشد. محققین دیگری خواص ضد میکروبی برخی از ترکیبات آلیل را مورد بررسی و این موضوع را مورد تایید قرار داده اند. ترکیبات گوگردی موجود در اسانس سیر مانند: آلیل متیل سولفید، دی آلیل سولفید، آلیل متیل دی‌سولفید، دی آلیل دی سولفید، آلیل متیل تری سولفید و دی آلیل تری سولفید، نقش اصلی در خواص ضدمیکروبی آن دارند. این ترکیبات گوگردی(به‌ویژه آلیل متیل تری سولفید)، فعالیت رادیکال‌زدایی بالایی دارند و می‌توانند از تشکیل ترکیبات سرطان‌زا مانند بنزوپیرن در فرآورده‌های گوشتی جلوگیری کنند. این خاصیت به مکانیسم ضدباکتری آن‌ها مرتبط است(Hu et al., 2021). وو و همکاران (2023)، در مطالعه‌ای به مقایسه ویژگی‌های ضدباکتریایی دو ترکیب آلیل‌متیل‌دی‌سولفید و دی‌متیل‌تری‌سولفید با ترکیبات فعال موجود در اسانس سیر پرداختند. در این تحقیق، فعالیت ضد میکروبی این ترکیبات در برابر اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسیتوژنز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاکی از آن بود که هر دو ترکیب دارای اثر مهاری قابل‌توجهی بر رشد باکتری‌ها بوده و از پتانسیل بالایی برای کاربرد به‌عنوان عوامل ضدباکتریایی طبیعی در سیستم‌های زیستی برخوردار هستند(Wu et al., 2023). در پژوهش دیگری اثربخشی فعالیت فوق العاده ضدمیکروبی دی‌آلیل دی سولفید، دی‌آلیل تری‌سولفید، دی‌آلیل تترا‌سولفید، در مدل غذایی و آزمایشگاهی بر اشریشیا کلی بررسی شد(Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn, 2008). تفاوت در نوع و میزان ترکیبات موجود در اسانس‌های گیاهی مانند اسانس سیر در مطالعات مختلف، به عوامل گوناگونی وابسته است. عواملی نظیر روش‌های کشت، ارتفاع از سطح دریا، شرایط آب‌و‌هوایی، نوع خاک، و زمان برداشت می‌توانند نقش مهمی در این تفاوت‌ها داشته باشند. افزون بر این، شیوه‌های استخراج اسانس نظیر تقطیر با بخار آب، استفاده از حلال‌های آلی یا روش فشردن، روش‌های مختلف آنالیز شیمیایی (کروماتوگرافی گازی یا طیف‌سنجی جرمی)  هم می‌توانند به‌طور مستقیم بر نوع و نسبت ترکیبات استخراج‌شده در اسانس تأثیر بگذارند(Satyal et al., 2017; Vaičiulytė et al., 2022). در این مطالعه، نانوامولسیون سیر در اغلب موارد اثربخشی ضدباکتریایی بالاتری نسبت به اسانس سیر از خود نشان داده است. به‌عنوان نمونه، در غلظت 0.097 µg/ml، میزان مهار رشد اشریشیا کلی توسط نانوامولسیون 15.2٪ و توسط اسانس 7.6٪ بود. این تفاوت در غلظت‌های بالاتر نیز حفظ شده است. به‌طور کلی، اشریشیا کلی و سالمونلا انتریکا مقاومت بالاتری نسبت به سایر باکتری‌ها در برابر هر دو نوع فرمولاسیون نشان دادند، در حالی که استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا مونوسایتوژنز حساسیت بیشتری به اسانس و به‌ویژه نانوامولسیون سیر داشتند. در مورد سودوموناس آئروژینوزا نیز نانوامولسیون توانست در غلظت‌های پایین‌تر از اسانس، مهار رشد قوی‌تری ایجاد کند. در مجموع، نانوامولسیون سیر در مقایسه با اسانس خام، در بیشتر غلظت‌ها عملکرد ضدباکتریایی مؤثرتری نشان داده است. مقایسه نتایج اثرات ضدباکتریایی، می‌توان نتیجه گرفت که نانوامولسیون سیر نسبت به اسانس سیر عملکرد قوی‌تری دارد و باکتری‌های گرم‌مثبت حساسیت بیشتری نسبت به باکتری‌های گرم‌منفی نشان داده‌اند. در مطالعه‌ای دیگر، اثر عصاره سیر پایدارشده با سورفکتانت و نانوامولسیون آب در روغن از نظر ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی و فعالیت ضد‌میکروبی در کاربردهای غذایی بررسی شد. نتایج نشان داد که این نوع نانوامولسیون در غلظت‌های بالای عصاره سیر دارای خواص ضدباکتریایی مؤثری بوده و در برابر باکتری‌های گرم‌مثبت اثربخشی بیشتری داشته است(Hassanzadeh et al., 2022). در مطالعه دیگری از نانوامولسیون اسانس سیر در سیستم‌های پوشش‌دهی غذایی مانند گوشت، سوسیس و روغن زیتون طعم‌دار جهت بررسی اثرات ضدمیکروبی استفاده شده است. نانوامولسیون‌های اسانس سیر به کمک صمغ عربی باعث افزایش پایداری ترکیبات فرار و مؤثر موجود در اسانس سیر شدند و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بیشتری نسبت به حالت آزاد اسانس نشان دادند. در محصولاتی نظیر گوشت سرد، نانوامولسیون اسانس سیر توانست رشد باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی را مهار کند و ماندگاری را تا یک هفته افزایش دهد. در محصولات گوشتی بسته‌بندی شده، فیلم‌های خوراکی حاوی نانوامولسیون اسانس سیر توانستند میزان بار میکروبی را به طور قابل‌توجهی کاهش دهند. این نتایج نشان‌دهنده اثر ماندگار و مؤثر ترکیبات سیر در جلوگیری از فساد مواد غذایی می‌باشد(Farazi et al., 2023). در مطالعه لیو و همکاران(2024)، فعالیت‌های ضدباکتری، ضدبیوفیلم و مکانیزم اثر نانوامولسیون آبی اسانس سیر علیه باکتری لیستریا مونوسیتوژنز مورد بررسی قرار گرفت. نانوامولسیون اسانس سیر با اندازه ذره‌ای متوسط 136.43 نانومتر توانست رشد باکتری‌های پلانکتونی لیستریا را به طور قابل توجهی مهار کند. حداقل غلظت مهاری اسانس سیر در نانوامولسیون برابر با 512 µg/ml بود. اثر ضدمیکروبی این نانوامولسیون وابسته به زمان و غلظت بود، به این معنا که با افزایش مدت تماس یا غلظت، تأثیر آن تقویت می‌شد. همچنین، این اسانس توانست تشکیل بیوفیلم توسط لیستریا مونوسیتوژنز را به طور قابل توجهی کاهش دهد. نتایج این تحقیق نشان داد که نانوامولسیون اسانس سیر تأثیر قابل توجهی بر باکتری لیستریا مونوسیتوژنز جداشده از شیر خام دارد و یافته‌ها با تحقیق حاضر، هم‌راستا هستند(Liu et al., 2024). لیو و همکاران(2022)، تاثیر نانوامولسیون سیر در آب تهیه‌شده با امواج فراصوت با توان بالا را بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین  جداشده از گوشت خوک بررسی نمودند. استفاده از امواج فراصوت با توان بالا اندازه ذرات اسانس سیر را از 820.3 نانومتر به 215 نانومتر کاهش داد. نانوامولسیون بیشترین اثر ضد میکروبی با حداقل غلظت مهاری 1.25 mg/ml را نشان داد . این نانوامولسیون باعث مهار رشد سلولی باکتری و آسیب جدی به ساختار سلول شد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان دادند که غشای سلولی به شدت آسیب دیده و ساختار سلول به‌کلی تخریب شده است. در تحقیق حاضر نیز نانوامولسیون سیر اثر ضدمیکروبی قابل توجهی بر سویه های استافیلوکوکوس اورئوس استاندارد و جدا شده از گوشت نشان داد(Liu et al., 2022). بررسی نتایج تحقیقات انجام شده بر روی اسانس­های گیاهان نشان می­دهد که هم اسانس و هم نانوامولسیون اسانس سیر دارای اثرات ضدباکتریایی بر علیه باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی مرتبط با موادغذایی می باشند. اسانس‌ها به فرم کپسوله و نانو یا نانوامولسیون نسبت به اسانس‌های خام دارای اثرات ضدمیکروبی و پایداری بیشتری هستند. اسانس‌های خام به دلیل فرار بودن و حساسیت به شرایط محیطی مانند: نور، دما و اکسیژن، ممکن است سریعاً از بین بروند یا خواص خود را از دست بدهند. در مقابل، اسانس‌های کپسوله‌شده و نانوامولسیون‌شده به دلیل محافظت توسط غلاف‌ها یا پوشش‌ها، مقاوم‌تر هستند و به راحتی تخریب نمی‌شوند. این پایداری بیشتر باعث می‌شود که این فرم‌های اسانس‌ها مدت زمان بیشتری موثر واقع شوند و از این رو می‌توانند در نگهداری موادغذایی به عنوان نگهدارنده‌های طبیعی استفاده شوند. در فرم نانوامولسیون، اسانس‌ها قادرند به طور مؤثرتری وارد سلول‌های میکروارگانیسم‌ها شوند و اثرات ضدمیکروبی خود را نشان دهند. اندازه نانو آن‌ها باعث می‌شود که بتوانند از طریق غشاء سلولی میکروارگانیسم‌ها عبور کنند و تأثیرات ضدمیکروبی بیشتری ایجاد کنند(Paolino et al., 2021; Sharma et al., 2022). بررسی نتایج پژوهش‌های پیشین و تحقیق حاضر نشان می‌دهد که اثرات ضدمیکروبی اسانس‌ها در مقابل باکتری‌های گرم مثبت بیشتر از باکتری‌های گرم منفی است. دلیل این تفاوت در ساختار دیواره سلولی این دو گروه قرار دارد. باکتری‌های گرم مثبت دارای دیواره‌ای ضخیم‌تر و عمدتاً متشکل از لایه‌ای پپتیدوگلیکان هستند که ممکن است جذب اسانس‌های ضد میکروبی را تسهیل کند. در مقابل، باکتری‌های گرم منفی دارای دیواره‌ای پیچیده‌تر هستند که شامل غشای خارجی حاوی لیپیدها و پروتئین‌ها است. این غشا مانع نفوذ اسانس‌ها و ترکیبات ضد میکروبی به داخل سلول می‌شود. علاوه بر این، این باکتری‌ها سیستم‌های پمپ بیرون‌بر دارند که قادرند ترکیبات خارجی را از داخل سلول خارج کنند، و در نتیجه اثرات ضدمیکروبی اسانس‌ها کاهش می‌یابد. بنابراین، برای اثربخشی بیشتر اسانس‌ها بر باکتری‌های گرم منفی، نیاز به غلظت‌های بالاتری از این ترکیبات است(Angane et al., 2022; Seow et al., 2014).

نتیجه‌گیری

 نانوامولسیون‌ها به عنوان سامانه‌های نوین و کارآمد، قابلیت قابل‌توجهی در افزایش ایمنی و ماندگاری مواد غذایی از طریق مهار رشد میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و فسادزا دارند. این سامانه‌ها، به واسطه‌ی پایداری فیزیکی بالا، قابلیت رهایش کنترل‌شده و فعالیت ضد میکروبی مؤثر، می‌توانند جایگزین مناسبی برای نگهدارنده‌های شیمیایی متداول در صنایع غذایی باشند. به‌ویژه، نانوامولسیون‌های حاوی اسانس سیر نسبت به اسانس خام، اثربخشی بیشتری در کنترل رشد میکروبی نشان داده‌اند. نتایج مطالعات حاکی از آن است که این ترکیبات می‌توانند به عنوان یک رویکرد طبیعی، ایمن و مؤثر برای افزایش طول عمر محصولات غذایی و کاهش وابستگی به ترکیبات نگهدارنده‌ی سنتتیک مورد استفاده قرار گیرند.

تشکر و قدردانی

این پژوهش با همکاری مرکز تحقیقات ایمن سازی مواد غذایی و کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان انجام شده است. در این راستا، نویسندگان از تمامی افرادی که در فرآیند انجام آن، همکاری و مساعدت نموده‌اند، قدردانی می‌نمایند.

تضاد منافع

نویسندگان هیچ گونه تضاد منافعی ندارند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع

 

1.       Angane, M., Swift, S., Huang, K., Butts, C. A., & Quek, S. Y. (2022). Essential oils and their major components: An updated review on antimicrobial activities, mechanism of action and their potential application in the food industry. Foods. 11(3): 464.

2.       Aranda, K. R. S., Fagundes-Neto, U., & Scaletsky, I. C. A. (2004). Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp. J Clin Microbiol. 42(12): 5849-5853. 

3.       Bantawa, K., Rai, K., Subba Limbu, D., & Khanal, H. (2018). Food-borne bacterial pathogens in marketed raw meat of Dharan, eastern Nepal. BMC Res. Notes. 11: 1-5.

4.       Chen, H., & Zhong, Q. (2022). Physical and antimicrobial properties of self-emulsified nanoemulsions containing three synergistic essential oils. Int J Food Microbiol. 365: 109557.

5.       Chen, J.-Q., Healey, S., Regan, P., Laksanalamai, P., & Hu, Z. (2017). PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources, Food Sci. Hum. Wellness. 6(2): 39-59.

6.       Confessor, M. V. A., Agreles, M. A. A., Campos, L. A. d. A., Silva Neto, A. F., Borges, J. C., Martins, R. M., Cavalcanti, I. M. F. (2024). Olive oil nanoemulsion containing curcumin: antimicrobial agent against multidrug-resistant bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 108(1): 241.

7.       Dehariya, N., Guha, P., & Gupta, R. K. (2021). Extraction and characterization of essential oil of garlic (Allium sativa L.). Int. J. Chem. Stud, 9(1): 1455-1459.

8.       Espitia, P. J., Fuenmayor, C. A., & Otoni, C. G. (2019). Nanoemulsions: Synthesis, characterization, and application in bio‐based active food packaging. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.18(1):264-85.

9.       Farazi, G., Asadi, G., & Gharachorloo, M. (2023). Investigating the effect of garlic essential oil nanoemulsion encapsulated with arabic gum on antioxidant activity, shelf life, and sensory properties of flavored olive oil. J. Food Sci. Technol. 20(140): 96-112.

10.       Hassanzadeh, H., Alizadeh, M., Hassanzadeh, R., & Ghanbarzadeh, B. (2022). Garlic essential oil‐based nanoemulsion carrier: release and stability kinetics of volatile components. Food Sci. Nutr.10(5):1613-25.

11.       Hu, G., Cai, K., Li, Y., Hui, T., Wang, Z., Chen, C., Zhang, D. (2021). Significant inhibition of garlic essential oil on benzo [a] pyrene formation in charcoal-grilled pork sausages relates to sulfide compounds. Food Res Int. 141: 110127. 

12.       Kariminik, A., Moradalizadeh, M., Foroughi, M. M., Tebyanian, H., & Motaghi, M. M. (2019). Chemical composition and antibacterial activity of the essential oils extracted from 4 medicinal plants (Labiatae) of Kerman, Iran. J. Appl. Biotechnol. Rep. 6(4): 172-179.

13.       Liu, M., Guo, W., Feng, M., Bai, Y., Huang, J., & Cao, Y. (2024). Antibacterial, anti-biofilm activity and underlying mechanism of garlic essential oil in water nanoemulsion against Listeria monocytogenes. LWT. 196: 115847.

14.       Liu, M., Pan, Y., Feng, M., Guo, W., Fan, X., Feng, L. Cao, Y. (2022). Garlic essential oil in water nanoemulsion prepared by high-power ultrasound: Properties, stability and its antibacterial mechanism against MRSA isolated from pork. Ultrason. Sonochem. 90: 106201.

15.       Mehrotra, M., Wang, G., & Johnson, W. M. (2000). Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance. J Clin Microbiol. 38(3): 1032-1035.

16.       Paolino, D., Mancuso, A., Cristiano, M. C., Froiio, F., Lammari, N., Celia, C., & Fresta, M. (2021). Nanonutraceuticals: The new frontier of supplementary food. Nanomaterials, 11(3): 792.

17.       Rattanachaikunsopon, P., & Phumkhachorn, P. (2008). Diallyl sulfide content and antimicrobial activity against food-borne pathogenic bacteria of chives (Allium schoenoprasum). Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(11): 2987-2991.

18.       Satyal, P., Craft, J. D., Dosoky, N. S., & Setzer, W. N. (2017). The chemical compositions of the volatile oils of garlic (Allium sativum) and wild garlic (Allium vineale). Foods. 6(8): 63.

19.       Seow, Y. X., Yeo, C. R., Chung, H. L., & Yuk, H.-G. (2014). Plant essential oils as active antimicrobial agents. Crit Rev Food Sci Nutr. 54(5): 625-644.

20.       Sepahvand, F., Rashidian, E., Jaydari, A., & Rahimi, H. (2022). Prevalence of Listeria monocytogenes in raw milk of healthy sheep and goats. Vet. Med. Int. 2022(1):3206172.

21.       Sharma, S., Mulrey, L., Byrne, M., Jaiswal, A. K., & Jaiswal, S. (2022). Encapsulation of essential oils in nanocarriers for active food packaging. Foods. 11(15): 2337.

22.       Sindhu, M., Rajkumar, V., Annapoorani, C. A., Gunasekaran, C., & Kannan, M. (2023). Nanoencapsulation of garlic essential oil using chitosan nanopolymer and its antifungal and anti-aflatoxin B1 efficacy in vitro and in situ. Int. J. Biol. Macromol. 243:125160.

23.       Swangsri, T., Reamtong, O., Saralamba, S., Rakthong, P., Thaenkham, U., & Saralamba, N. (2024). Exploring the antimicrobial potential of crude peptide extracts from Allium sativum and Allium oschaninii against antibiotic-resistant bacterial strains. Pharm. Biol. 62(1): 666-675.

24.       Tao, J.-j., Xiang, J.-j., Jiang, M., Kuang, S.-f., Peng, X.-x., & Li, H. (2022). A microtitre plate dilution method for minimum killing concentration is developed to evaluate metabolites-enabled killing of bacteria by β-lactam antibiotics. Front. Mol. Biosci. 9: 878651.

25.       Vaičiulytė, V., Ložienė, K., & Taraškevičius, R. (2022). Impact of edaphic and climatic factors on Thymus pulegioides essential oil composition and potential prevalence of chemotypes. Plants, 11(19): 2536.

26.       Wu, C.-Y., Wang, C.-Y., Sun, G.-J., Li, Y.-Q., Liang, Y., Hua, D.-L., Mo, H.-Z. (2023). Antibacterial characteristics of allyl methyl disulfide and dimethyl trisulfide of Allium tenuissimum flower essential oil against Escherichia coli O157: H7. Ind. Crop. Prod. 202: 117058.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Evaluation of the Antimicrobial Effects of Garlic Essential Oil and Nanoemulsion on Bacteria Isolated from Food Products

Azizabadi A1,2, Kariminik A1⃰

1Department of Microbiology, Ke.C., Islamic Azad University, Kerman, Iran

2Food and Agricultural Safety Research Center, Ke.C., Islamic Azad University, Kerman, Iran

⃰Corresponding Author Email: [e-mail]

 

Abstract

Given the increasing need to preserve the quality and stability of perishable products, the use of essential oils and their nanoemulsions has emerged as a novel strategy for enhancing microbial stability in food systems. This study aimed to compare the antibacterial effects of garlic essential oil and its nanoemulsion against foodborne pathogenic bacteria, and to evaluate the potential application of garlic essential oil nanoemulsions in the food industry. Garlic essential oil was extracted via steam distillation, and its chemical composition was identified using gas chromatography. The nanoemulsion was formulated through a homogenization method. Antibacterial activity was assessed using the microtiter plate method against five bacterial species: Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes. The main components of the essential oil were diallyl disulfide, dipropyl trisulfide, dipropyl disulfide, and diallyl sulfide. The results revealed that the garlic essential oil nanoemulsion exhibited significantly stronger antibacterial activity than the crude essential oil across all tested concentrations. Salmonella enterica showed the highest sensitivity, with 99.89% growth inhibition at 1.56 µg/ml. Both MIC and MBC values were notably lower for the nanoformulation, and statistical analyses confirmed significant differences between concentrations (p < 0.001). These findings highlight the high potential of garlic essential oil nanoemulsions as a natural and effective preservative for application in the food industry.

Keywords: Garlic essential oil, nanoemulsion, antibacterial effects, food products.

17                                                                                                                     دوره 12 شماره 1 بهار 1404

 

---