بررسی ایمنی و آلرژی‌زایی پروتئین Deeper Rooting1 در برنج اصلاح‌شده ژنتیکی با رویکرد بیوانفورماتیکی
محورهای موضوعی :مطهره محسن پور 1 * , محدثه محسن پور 2
1 - پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج
2 -
کلید واژه:
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: تضمین پایداری تولید و افزایش بهره‌وری برنج (اوريزا ساتيوا) به عنوان یکی از مهم‌ترین غلات و غذای اصلی بخش بزرگی از جمعیت جهان از اهمیت بالایی برخوردار است. در این راستا، بهره‌گیری از فناوری‌های نوین نظیر اصلاحات مولکولی، مهندسی ژنتیک و به‌ویژه ویرایش ژنوم، به‌عنوان راهکارهایی مؤثر در بهبود عملکرد و افزایش مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی مورد توجه قرار گرفته‌اند. یکی از ژن‌های مورد استفاده در بهنژادی برنج، ژن Deeper Rooting1 (DRO1) است که نقش موثري در افزایش عمق ریشه، جذب بهتر آب و عناصر غذایی، به‌ویژه در شرایط تنش خشکی دارد. انتقال این ژن به ارقام دارای ریشه‌های کم‌عمق، موجب توسعه لاین‌هایی با ریشه‌های عمیق‌تر شده و در نتیجه، عملکرد گیاه در شرایط کم‌آبی به طور قابل‌توجهی بهبود می‌یابد. با توجه به لزوم ارزیابی ایمنی زیستی در گیاهان تراریخته، به‌ویژه در خصوص پتانسیل آلرژی‌زایی یا حساسیت‌زایی پروتئین‌های نوظهور، این مطالعه به بررسی ایمنی پروتئین DRO1 اختصاص یافته است. مواد و روش ها: در این پژوهش، پس از تحلیل توالی کامل پروتئین DRO1، تعداد 172 قطعه با طول 80 اسیدآمینه و 244 پپتید 8 اسیدآمینه‌ای مورد بررسی قرار گرفت. نتیجه گیری: هیچ‌یک با توالی‌های آلرژنی شناخته‌شده مطابقت نداشتند. همچنین، بررسی هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های گوارشی و تحلیل ساختار سه‌بعدی این پروتئین نیز عدم پتانسیل آلرژی‌زایی و حساسیت‌زایی را نشان دادند. بر اساس نتایج به‌دست‌آمده، پروتئین DRO1 را می‌توان به‌عنوان ترکیبی ایمن از منظر زیستی در نظر گرفت. بهره‌گیری از این ژن در برنامه‌های اصلاحی می‌تواند گامی مؤثر در جهت افزایش تحمل برنج به خشکی، کاهش مصرف آب، ارتقای بهره‌وری و در نهایت، دستیابی به امنیت غذایی و خودکفایی در تولید این محصول راهبردی باشد. کلمات كليدي: اثرات بالقوه آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي، برنج، Deeper Rooting1، امنيت غذايي
فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی
بررسی ایمنی و آلرژی‌زایی پروتئین Deeper Rooting1 در برنج اصلاح‌شده ژنتیکی با رویکرد بیوانفورماتیکی
مطهره محسن پور1*، محدثه محسن پور2
1. پژوهشگاه بیوتکنولوژي کشاورزي (ABRII)، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزي، کرج، ايران
2.گروه میکروبیولوژی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
چکیده
سابقه و هدف: تضمین پایداری تولید و افزایش بهره‌وری برنج (اوريزا ساتيوا) به عنوان یکی از مهم‌ترین غلات و غذای اصلی بخش بزرگی از جمعیت جهان از اهمیت بالایی برخوردار است. در این راستا، بهره‌گیری از فناوری‌های نوین نظیر اصلاحات مولکولی، مهندسی ژنتیک و به‌ویژه ویرایش ژنوم، به‌عنوان راهکارهایی مؤثر در بهبود عملکرد و افزایش مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی مورد توجه قرار گرفته‌اند. یکی از ژن‌های مورد استفاده در بهنژادی برنج، ژن Deeper Rooting1 (DRO1) است که نقش موثري در افزایش عمق ریشه، جذب بهتر آب و عناصر غذایی، به‌ویژه در شرایط تنش خشکی دارد. انتقال این ژن به ارقام دارای ریشه‌های کم‌عمق، موجب توسعه لاین‌هایی با ریشه‌های عمیق‌تر شده و در نتیجه، عملکرد گیاه در شرایط کم‌آبی به طور قابل‌توجهی بهبود می‌یابد. با توجه به لزوم ارزیابی ایمنی زیستی در گیاهان تراریخته، به‌ویژه در خصوص پتانسیل آلرژی‌زایی یا حساسیت‌زایی پروتئین‌های نوظهور، این مطالعه به بررسی ایمنی پروتئین DRO1 اختصاص یافته است.
مواد و روش ها: در این پژوهش، پس از تحلیل توالی کامل پروتئین DRO1، تعداد 172 قطعه با طول 80 اسیدآمینه و 244 پپتید 8 اسیدآمینه‌ای مورد بررسی قرار گرفت.
نتیجه گیری: هیچ‌یک با توالی‌های آلرژنی شناخته‌شده مطابقت نداشتند. همچنین، بررسی هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های گوارشی و تحلیل ساختار سه‌بعدی این پروتئین نیز عدم پتانسیل آلرژی‌زایی و حساسیت‌زایی را نشان دادند. بر اساس نتایج به‌دست‌آمده، پروتئین DRO1 را می‌توان به‌عنوان ترکیبی ایمن از منظر زیستی در نظر گرفت. بهره‌گیری از این ژن در برنامه‌های اصلاحی می‌تواند گامی مؤثر در جهت افزایش تحمل برنج به خشکی، کاهش مصرف آب، ارتقای بهره‌وری و در نهایت، دستیابی به امنیت غذایی و خودکفایی در تولید این محصول راهبردی باشد.
کلمات كليدي: اثرات بالقوه آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي، برنج، Deeper Rooting1، امنيت غذايي
Evaluation of the properties and safety of Deeper Rooting 1 protein transferred to rice plant by investigating its allergenicity potential
Motahhareh Mohsenpour1*, Mohaddeseh Mohsenpour2
1. Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
2. Department of Microiology, NT.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Ensuring the sustainability of production and enhancing the productivity of rice (Oryza sativa)-one of the most important cereal crops and a staple food for a large portion of the global population-is of paramount importance. In this regard, the utilization of advanced technologies such as molecular breeding, genetic engineering, and particularly genome editing has been recognized as an effective strategy to improve yield and increase resistance to biotic and abiotic stresses. One of the genes employed in rice breeding is the Deeper Rooting 1 (DRO1) gene, which plays a significant role in increasing root depth, thereby improving water and nutrient uptake-especially under drought stress conditions. The introduction of this gene into shallow-rooted rice varieties has led to the development of lines with deeper root systems, significantly enhancing plant performance under water-limited conditions. Given the necessity of biosafety assessment in genetically modified plants, particularly concerning the allergenic or sensitizing potential of novel proteins, this study focused on evaluating the safety of the DRO1 protein.
Material and metod: In this research, following the complete sequence analysis of the DRO1 protein, a total of 172 fragments of 80 amino acids in length and 244 peptides of 8 amino acids were examined.
Result: none of which showed homology with known allergenic sequences. Furthermore, enzymatic digestion using digestive enzymes and three-dimensional structural analysis of the protein also indicated no allergenic or sensitizing potential. Based on the obtained results, the DRO1 protein can be considered biologically safe. Incorporating this gene into breeding programs can serve as an effective step toward enhancing rice drought tolerance, reducing water consumption, increasing productivity, and ultimately achieving food security and self-sufficiency in the production of this strategic crop.
Keywords: Allergenicity potential, Rice, Deeper Rooting1, Food security
مقدمه
در مهندسي ژنتيک اطمينان اوليه از ايمن بودن محصول پروتئينيِ ژن انتقالي داراي اهميت است و عدم وجود اثرات بالقوه واکنش حساسيت‌زايي و آلرژي‌زايي در محصول ژن انتقالي مي‌تواند به اطمينان اوليه در عدم مشاهده اثرات جانبي در مراحل آناليز احتمال خطر و بررسي‌هاي ايمني‌زيستي منجر شود. پیش‌بینی پتانسیل آلرژی‌زایی یک پروتئین، به ویژه در غذاهای جدید یکی از چالش‌های عمده در موضوع آلرژی مولکولی است. در اين موضوع لازم است دو جنبه را از هم متمايز کرد: ایمنی‌زایی و واکنش متقابل. ایمنی‌زایی، پتانسیل یک پروتئین برای القای آنتی‌بادی‌های IgE را منعکس می‌کند، در حالی که واکنش متقابل، واکنش آنتی‌بادی‌های IgE (معمولاً از قبل موجود) با پروتئین هدف است. علاوه بر این دو موضوع، ارتباط بین پتانسیل اتصال IgE و علائم بالینی نيز مورد توجه قرار مي‌گيرد. این مورد تحت تأثیر خواص فیزیکی (به عنوان مثال، ثبات و اندازه) و ویژگی‌های ایمونولوژیک (به عنوان مثال میل و ظرفیت اپی‌توپ) است. پيش‌بيني احتمال ایمنی‌زایی و واکنش متقابل آلرژن‌ها بر ایجاد شباهت‌ها و تفاوت‌های ساختاری بین آلرژن‌ها و بین آلرژن‌ها و غیر آلرژن‌ها تکیه دارد(1). ابزارهای بیوانفورماتیک می‌توانند به پیش‌بینی و بررسی پتانسیل آلرژی‌زایی پروتئین‌ها کمک کنند.
نویسنده ی مسئول: پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی(ABRII)، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج ایران آدرس الکترونیک: mthrhm@yahoo.com تاریخ دریافت مقاله: 22/12/1403 تاریخ پذیرش مقاله: 03/06/1404 |
ساختار ریشه گیاهان در به حداقل رساندن خلأ عملکرد اهميت دارد و زیربنای دومین انقلاب سبز در جهت برآورده کردن تقاضای غذایی انسان‌ها است(5). علاوه بر عملکردهاي استقرار گياه و جذب آب و مواد مغذي توسط سیستم‌های ریشه، ذخیره‌سازی، سنتز و تجمع متابولیت‌های ثانویه در ريشه‌ها در روابط میکروب‌هاي همزیست نقش مهمي دارند(7و6). ریشه‌ها در حال تبدیل شدن به هدف اصلی برای انقلاب سبز دوم هستند و اصلاح آنها برای تولید غلات غذایی پرمحصول مانند گندم و برنج ضروری به نظر می‌رسد(8). متأسفانه، صفات ریشه در اصلاح به دلیل چالش‌های فنوتیپی بسیار نادیده گرفته می‌شوند، اما اگر بتوان از تنوع در صفات ساختار ريشه به طور کامل استفاده کرد، بسيار با ارزش خواهد بود(9). تاکنون، تعداد زیادی از ژن‌ها که داراي نقش بالقوه‌اي در بهبود ساختار ريشه هستند با جزئیات شناسايي شده‌اند. ما در گزارش‌هاي قبلي انتقال ژن DRO1 را به همراه ژن‌هاي ديگر موثر بر ساختار ريشه به رقم تجاري برنج هاشمي گزارش کرديم (12-10). ژن DRO1 در افزایش طول سلول در نوک ریشه نقش دارد که باعث رشد نامتقارن ریشه و خم شدن ریشه به سمت پایین در پاسخ به نیروی جاذبه می‌شود. انتقال اين ژن به یک رقم برنج با ریشه کم عمق، لاین حاصل را قادر مي‌کند تا از خشکی توسط افزایش عمق ریشه‌دهی خود اجتناب کند و این امر منجر به حفظ عملکرد بالا در شرایط تنش خشکی در مقایسه با رقم اولیه شاهد خواهد شد. اين ژن که به طور طبيعي در رقم وحشي برنج Kinandang patong وجود دارد، در ارقام زراعي مثل رقم هاشمي به دليل ايجاد کدون پايان زودهنگام فاقد عملکرد است. بنابراين به منظور برگرداندن اثرات مفيد اين ژن در اجتناب از خشکي، توالي ناحيه کدکننده آن پس از بهينه‌سازي کدوني، از نظر ايمني پروتئين حاصل با بررسي اثرات بالقوه آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي مورد ارزيابي قرار گرفت و سپس تحت نواحي تنظيمي گياهي به برنج رقم هاشمي منتقل شد.
مواد و روش‌ها
جستجوي منابع و بررسي‌هاي بيوانفورماتيکي براي انتخاب ژن بالقوه ايمن و موثر در بهبود ساختار ريشه و تحمل به خشکي
مقالات مرتبط با عوامل ژنتيکي دخيل در تغيير ساختار ريشه برنج و تاثير ساختار ريشه بر عملکرد و تحمل تنش‌هاي محيطي با تاکيد بر استرس خشکي بررسي و بر اين اساس ژن‌هاي کانديد مرتبط با صفات مهم ساختاري ريشه انتخاب شدند. يکي از اين ژن‌هاي موثر در تغيير زاويه رشد ريشه و اجتناب از خشکي ژن DEEPER ROOTING 1 نام داشت. اين ژن عامل به‌وجود آوردن ریشه عمیق و کنترل‌کننده زاویه رشد ریشه است که باعث طويل شدن سلول‌ها در نوک ریشه شده و با رشد نامتقارن سلول‌هاي نوک ريشه، سبب خم شدن ریشه در پاسخ به گرانش زمين خواهد شد. اين ژن به دليل وجود گزارش‌هاي معتبر از موثر بودن آن در افزايش تحمل به خشکي (16-13) به عنوان ژن کانديد براي انتقال به برنج به طور اوليه انتخاب شد تا پس از تاييد ايمني بالقوه آن، براي مهندسي ژنتيک برنج مورد استفاده قرار گيرد.
بررسي قرابت توالي پروتئين DRO1 برنج با توالي‌هاي متناظر از گياهان تک لپه و دو لپه و کشف موتيف
توالي‌هاي متناظر با پروتئين DRO1 برنج از پايگاه NCBI دريافت و قرابت آنها بررسي شد. سپس براي جستجوي موتيف از پايگاه SMART و براي کشف موتيف از پايگاه MEME استفاده شد. موتیف یک الگوی توالی تقریبی است که به طور مکرر در گروهی از توالی‌های مرتبط رخ می‌دهد. الگوهای دارای شکاف با طول متغیر توسط MEME به دو یا چند موتیف جداگانه تقسیم می‌شوند. براي مقايسه موتيف مرتبط با آلرژن از پايگاه Tomtom (17) استفاده شد. اين پايگاه یک یا چند موتيف را با پایگاه داده‌ای از موتيف‌هاي شناخته شده (مانند JASPAR) مقایسه می‌کند. Tomtom موتیف‌ها را در پایگاه داده رتبه‌بندی می‌کند و برای هر تطابق قابل توجه یک تراز ایجاد می‌کند.
بررسي اثرات بالقوه آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي
براي بررسي اثرات بالقوه آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي پروتئين کُدشونده توسط ژن DRO1 از چندين پايگاه استفاده شد که به شرح زير هستند.
الف) پايگاهAllergenOnline (http://www.allergenonline.org) دسترسی به یک لیست آلرژن بررسی شده و پایگاه داده قابل جستجوی توالی را فراهم می‌کند که برای شناسایی خطر بالقوه واکنش متقابل آلرژیک پروتئين حاصل از بيان ژن DRO1 در نظر گرفته شد. این پايگاه برای کمک به ارزیابی ایمنی پروتئین‌هایی که ممکن است از طریق مهندسی ژنتیک یا از طریق روش‌های فرآوری مواد غذایی وارد غذاها شوند، طراحی شده است. هدف، شناسایی پروتئین‌هایی است که ممکن است به آزمایش‌های بيشتري نیاز داشته باشند، مانند اتصال IgE سرم (IgE binding)، آزادسازی هیستامین بازوفیل (Basophil histamine release) یا چالش in vivo برای ارزیابی واکنش متقابل بالقوه (In vivo challenge to evaluate potential cross-reactivity)، اين پایگاه داده سالانه به روز می‌شود. نسخه چهارم آن در یک وب سایت عمومی در سال 2004 منتشر شد. اين پايگاه در تاریخ 25 مي 2023 به نسخه 22 به روز شده است. نسخه 22 حاوی لیست جامعی از آلرژن‌هاي دريافت شده از منابع معتبر است. اين پایگاه داده با هدف ارائه یک ابزار ساده و مفید که مي‌تواند در ارزیابی ایمنی مواد غذایی مفید باشد، به صورت رایگان در دسترس است. اين ابزار به محقق اين امکان را می‌دهد تا توالی پروتئین مورد نظر خود را با توالی‌های موجود در پایگاه داده AllergenOnline، که به صورت سالانه به‌روزرسانی می‌شود، مقایسه کند. این کار برای ارزیابی پروتئین‌های جدید در محصولات اصلاح‌شده ژنتیکی یا در غذاهای جدید در نظر گرفته شده است.
حالت اول جستجوي کل توالي پپتيدي و مقايسه آن با آلرژن‌ها است. در جستجوی هم‌ترازی‌های کل طول توالي پپتيدي، تطابق بیشتر از 50 درصد، نشان‌دهنده واکنش متقابل احتمالی است.
حالت دوم که بر اساس دستورالعمل‌هاي CODEX Alimentarius (2003) طراحي شده، توالي پروتئيني مورد نظر را به بخش‌هايي شامل پپتيدهاي 80 اسيدآمينه‌اي تبديل و شباهت هر قطعه را با آلرژن‌ها جستجو مي‌کند. بر اساس دستورالعمل کدکس پپتيدهاي 80 اسيدآمينه‌اي که شباهت آنها با آلرژن‌ها بيش از 35 درصد باشد پتانسيل آلرژي‌زايي داشته و لازم است تحت آناليزهاي تکميلي آزمايشگاهي قرار بگيرند.
حالت سوم جستجو برای تطابق دقیق هشت اسید آمینه است. برخی ضوابط نظارتی دنيا نتایج این جستجوی بسیار دقيق را هم درخواست می‌کنند. به هر حال نظر مراکز علمي مرتبط با بررسي احتمال آلرژي‌زايي این است که هیچ مدرکی مبنی بر اینکه تطابق هشت اسید آمینه بتواند پروتئینی را شناسایی کند که احتمالاً واکنش متقابل دارد در حالي که تطابق 80 اسيد آمينه‌اي آن نتوانسته باشد شباهت بالاي 35 درصد با آلرژن‌ها را نشان دهد، وجود ندارد. بنابراین توصیه شده است از حالت سوم يعني بررسي توالي‌هاي کوتاه 6 تا 8 اسيدآمينه‌اي براي بررسي آلرژي‌زايي استفاده نشود، زیرا هیچ مدرک علمی مبنی بر پیش‌بینی واکنش متقاطع IgE وجود ندارد و فعالیت‌های بالینی مشترک را پیش‌بینی نمی‌کنند(18).
ب) پايگاه PeptideCutter (https://web.expasy.org/peptide_cutter) پايگاه ديگري است که محل‌های برش احتمالی توسط پروتئازها یا مواد شیمیایی را در یک توالی پروتئینی موردنظر پیش‌بینی می‌کند. در اين تحقيق محل برش آنزيم‌هاي معده از جمله پپسين، تريپسين و کيموتريپسين روي پروتئين DRO1 مورد بررسي قرار گرفت و سپس قطعات حاصل از هضم براي بررسي پتانسيل آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي در پايگاه‌هاي AllergenOnline و Allermatchtm مورد بررسي قرار گرفتند.
ج) پايگاه Allermatch (https://www.allermatch.org) براي بررسي پتانسيل آلريي‌زايي قطعات حاصل از شبيه‌سازي هضم پروتئين DRO1 با آنزيم‌هاي معده با طول بيش از 8 اسيدآمينه مورد استفاده قرار گرفت. اين پايگاه يک ابزار تحت وب است که با استفاده از آن مي‌توان پروتئین موردنظر را با توالی پروتئین‌های آلرژی‌زا مقایسه کرد. این ابزار برای پیش‌بینی حساسیت‌زایی بالقوه پروتئین‌ها با رویکردهای بیوانفورماتیک بر اساسCodex alimentarius و FAO/WHO در مورد حساسیت‌زایی مواد غذایی مشتق شده از طریق بیوتکنولوژی مدرن طراحي شده است(20و19). آخرین به روز رساني اين پايگاه در 5 سپتامبر 2022 انجام شده است و شامل 2569 توالی پلی‌پپتیدی، 2255 شناسه از UniProt، 29 شناسه از UniProt با چندین زنجیره پلی پپتیدی و 314 شناسه GenBank RefSeqProtein است. پایگاه داده Allermatchtm (AllergenDB) با استفاده از ترکیب UniProt و GenBank NCBI از COMPARE (منبع جامع پروتئین آلرژن UniProt و آلرژنWHO/IUIS) ساخته شده است.
د) وب سرور AllerCatPro 2 (21) برای پیش بینی پتانسیل حساسیت‌زایی پروتئین DRO1 مورد استفاده قرار گرفت. اين ابزار تحت وب می‌تواند برای پیش‌بینی پتانسیل حساسیت‌زایی پروتئین با دقت بهتری نسبت به سایر روش‌های محاسباتی و ویژگی‌های جدید استفاده شود که به محققان و ارزيابي‌کنندگان در تصمیم‌گیری آگاهانه کمک می‌کند. پايگاه AllerCatPro 2 با استفاده از توالی اسیدآمینه و ساختارهای سه بعدی، شباهت پروتئين‌هاي ورودي را در برابر جامع‌ترین مجموعه داده‌های پروتئین‌های قابل اعتماد مرتبط با حساسيت‌زايي پیش‌بینی می‌کند. این مجموعه داده ها در حال حاضر شامل 4979 پروتئین آلرژن، 162 پروتئین کم آلرژی‌زا و 165 آلرژن خودایمنی با نظارت دستی متخصصان از پایگاه‌های داده زير است.
نتايج
انتخاب ژن‌هاي کانديد، جداسازي ژن و طراحي سازه‌ها و انتقال ژن
توالي پروتئين مرتبط با DRO1 از منشا برنج از پايگاه NCBI دريافت شد و حضور و قرابت اين پروتئين با پروتيئن‌هايي که پيش‌بيني مي‌شد در ايجاد فنوتيپ ريشه عميق نقش دارند در چندين گياه تک لپه‌اي و دو لپه‌اي مقايسه و نتايج آن در شکل 1 نشان داده شده است. نتايج نشان مي‌داد که پروتئين DRO1 برنج بيشترين قرابت را با پروتئين مرتبط در گياه (اُ. برانچيانتا) با حدود 87 درصد مطابقت نشان مي‌دهد و سپس با توالي‌هاي پروتئين مرتبط از جنس و گونه‌هاي تريتيکوم اورارتو، آئجيلوپس تاسچي، ت. آئستيوم، هوردم ولگار و پانيکوم ويرگاتوم حدود 76-69 درصد مطابقت دارد که همانطور که انتظار مي‌رود همه آنها گياهاني تک لپه‌اي هستند. به هر حال نتايج نشان مي‌داد اين توالي با توالي مرتبط از گياهان فونيکس داکتيليفرا و ديوسکورا کايننسيز که آنها نيز گياهاني تک لپه‌اي هستند کمتر و بين 43-37 درصد است. همچنين اين بررسي نشان داد که نزديک‌ترين توالي‌هاي مرتبط با DRO1 برنج از منشأ گياهان دو لپه‌اي مربوط به گياهان کاريا ايلينويننسيز، ريسينوس کاميونيز، تريپتريگيوم ويلفوردي و جاگلانس ميکروکارپا هستند که شباهت آنها بين 36 تا 37 درصد نشان داده شد (شکل 1).
WHO اتحادیه بین المللی انجمن های ایمونولوژیک1 (IUIS)؛ منبع جامع آلرژن پروتئین2 (COMPARE)؛ برنامه تحقیقاتی و منابع آلرژی غذایی3 (FARRP)؛ UniProtKB و Allergome. وب سرور AllerCatPro 2 بصورت رایگان در آدرس https://allercatpro.bii.a-star.edu.sg در دسترس است.
[1] International Union of Immunological Societies
[2] Comprehensive Protein Allergen Resource
[3] Food Allergy Research and Resource Program
شکل 1. بررسي قرابت پروتئين DRO1 برنج مورد استفاده در اين تحقيق با پروتئين‌هاي متناظر در گياهان تک لپه و دولپه.
در شکل 2 دايره سبز توالي متناظر از منشا گياهان تک لپه و دايره زرد گياهان دولپه را نشان مي‌دهد. دايره آبي مربوط به پروتئين DRO1 مورد استفاده در اين تحقيق است
شکل 2. نتايج پايگاه SMART براي شناسايي موتيف‌هاي توالي پروتئيني DRO1 (a) و شناسايي پروتئين‌هاي مرتبط با DRO1 برنج (b).
جدول 1. پيشگويي عملکرد پروتئين DRO1 برنج مورد استفاده در اين تحقيق بر اساس ارتباطات پروتئيني
Predicted Functional Partners | Score | Neighborhood | Gene Fusion | Cooccurence | Coexpression | Experiments | Databases | Textmining | [Homology] | |
OS04T0101800-01 | Os04g0101800 protein (689 aa) | 733/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
WOX11 | WUSCHEL-related homeobox 11; Transcription factor which may be involved in developmental processes (By similarity). Promotes the development of crown roots (both initiation and elongation), main components of the fibrous root system, by regulating the expression of genes required for crown root development and hormone-responsive genes involved in cytokinin (e.g. RR1, RR2, RR3 and RR4) and auxin (e.g. IAA5, IAA11, IAA23 and IAA31) signaling; Belongs to the WUS homeobox family (262 aa) | 499/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
ARL1 | Adventitious rootless1; Expressed protein; LOB domain protein; Os03g0149100 protein (259 aa) | 495/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
C68 | Os02g0236100 protein; Putative SERK1 protein; cDNA clone-J013129G20, full insert sequence ; Belongs to the protein kinase superfamily. Ser/Thr protein kinase family (620 aa) | 495/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
OST48 | Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase 48 kDa subunit; Essential subunit of the N-oligosaccharyl transferase (OST) complex which catalyzes the transfer of a high mannose oligosaccharide from a lipid-linked oligosaccharide donor to an asparagine residue within an Asn-X-Ser/Thr consensus motif in nascent polypeptide chains (439 aa) | 491/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
OS03T0811900-01 | ADP-ribosylation factor; ADP-ribosylation factor, putative, expressed; Os03g0811900 protein ; Belongs to the small GTPase superfamily. Arf family (181 aa) | 426/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
JAZ12 | Protein TIFY 11d; Repressor of jasmonate (JA) responses (By similarity). May act on an initial response of JA-regulated gene expression toward drought tolerance as part of a BHLH148-TIFY11D/JAZ12-COI1A complex (171 aa) | 422/0 |
|
|
|
|
|
| P |
|
شناسايي موتيف DRO1
پايگاه SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) نتوانست موتيف داراي کارکردي براي توالي اسيدآمينه‌اي ژن DRO1 برنج پيدا کند (شکل 2 و جدول 1).
به دليل اينکه پايگاه SMART نتوانست موتيف‌هايي را بر اساس پروتئين‌هاي شناخته شده قبلي براي ژن DRO1 برنج شناسايي کند بنابراين به منظور پيدا کردن موتيف‌هاي کارکردي از پايگاه MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme) (22) استفاده شد که نتايج آن در شکل 3 نشان داده شده است. نتايج نشان داد از 10 موتيف پيشگويي شده در اين پايگاه، تعداد شش موتيف در 22 پروتئين DRO1 از گونه‌هاي تک‌لپه و دولپه مورد بررسي در اين تحقيق مشترک هستند.
شکل 3. نتايج پايگاه MEME در انتخاب موتيف‌هاي کارکردي پروتئين DRO1 برنج. از ده موتيف احتمالي (قسمت بالاي شکل) که بر اساس E-Value مرتب شده‌اند تعداد شش موتيف در 22 گياه تک لپه و دولپه مورد بررسي در اين تحقيق مشترک تشخيص داده شدند.
Width: عرض موتیف الگویی با عرض ثابت را توصیف می‌کند، زیرا وجود هیچ شکافی در موتيف در پايگاه MEME مجاز نیست. Sites: تعداد سایت‌هایی که در ساخت موتیف نقش دارند را نشان مي‌دهد. نتايج نشان مي‌دهد
بررسي ايمني پروتئين حاصل از تراژن DRO1
توالي پپتيدي DRO1 مورد استفاده در اين تحقيق با طول 251 اسيد آمينه در پايگاه AllergenOnline مورد بررسي قرار گرفت. آناليز 172 قطعه 80 اسيدآمينه‌اي در کل توالي اين پروتئين شباهت بالاي 35 درصد با هيچ آلرژني نشان نداد (شکل 4-بالا). همچنين 244 قطعه پپتيد 8 اسيدآمينه‌اي کل اين توالي با هيچ توالي آلرژني منطبق نشدند (شکل 4).
شکل 4. نتايج پايگاه AllergenOnline براي بررسي احتمال آلرژي‌زايي پروتئين حاصل از تراژن DRO1. هيچ شباهتي با آلرژن‌ها در اين بررسي مشاهده نشد.
نتايج بررسي In-silico هضم DRO1 توسط آنزيم‌هاي پپسين، تريپسين و کيموتريپسين در پايگاه PeptideCutter، ايجاد 251 قطعه از اين پروتئين را نشان داد (جدول 2) که تعداد زيادي از آنها يک تا دو اسيد آمينه و بقيه قطعات داراي طول زير 8 اسيد آمينه بودند بجز دو قطعه 23 و 9 اسيدآمينه‌اي (جدول 2 - با رنگ قرمز مشخص شده است). با توجه به اينکه در آناليز پايگاه AllergenOnline تمام احتمالات آلرژي‌زايي قطعات 8 تايي اين پروتئين مورد بررسي قرار گرفته و شباهتي به آلرژن‌ها نشان داده نشده بود، بنابراين تنها پتانسيل آلرژي‌زايي اين دو قطعه 23 و 9 اسيدآمينه‌اي در پايگاه‌هاي AllergenOnline و Allermatchtm مورد بررسي قرار گرفت. توالي 23 اسيدآمينه‌اي QIEEVAQVENSSDNVQSVQDTVK حاصل از هضم DRO1 با آنزيم‌هاي معده در اين دو پايگاه هيچ شباهتي با آلرژن‌ها نشان نداد. توالي 9 اسيدآمينه‌اي PDETEINEC نيز در پايگاه AllergenOnline شباهتي به آلرژن ها نشان نداد ولي در پايگاه Allermatchtm در برش 6 تايي شباهت 25 درصدي به يک پروتئاز سرين نشان داد (شکل 5).
جدول 2. نتايج برش پروتئين حاصل از تراژن DRO1 توسط آنزيم‌هاي پپسين، تريپسين و کيموتريپسين
Position of cleavage site | Name of cleaving enzyme(s) | Resulting peptide sequence | Peptide length [aa] | Peptide mass [Da] |
1 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | M | 1 | 208/149 |
2 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
3 | Pepsin (pH1.3) | I | 1 | 175/131 |
4 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | F | 1 | 192/165 |
5 | Pepsin (pH>2) | S | 1 | 093/105 |
6 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | W | 1 | 288/204 |
10 | Trypsin | VANK | 4 | 505/430 |
14 | Trypsin | ISGK | 4 | 497/403 |
19 | Trypsin | QEANR | 5 | 632/616 |
20 | Pepsin (pH1.3) | F | 1 | 192/165 |
27 | Pepsin (pH>2) | PANSSAP | 7 | 666/642 |
28 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | Y | 1 | 191/181 |
29 | Trypsin | R | 1 | 203/174 |
37 | Trypsin | ANVSDCRK | 8 | 998/891 |
40 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | DEF | 3 | 396/409 |
43 | Pepsin (pH>2) | SDW | 3 | 395/406 |
46 | Pepsin (pH1.3) | PQS | 3 | 341/330 |
47 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
48 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
52 | Pepsin (pH1.3) | AIGT | 4 | 410/360 |
53 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | F | 1 | 192/165 |
56 | Trypsin | GNK | 3 | 345/317 |
79 | Pepsin (pH1.3) | QIEEVAQVENSSDNVQSVQDTVK | 23 | 684/254 |
89 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | F | 1 | 192/165 |
87 | Trypsin | TEEEVDK | 7 | 862/848 |
89 | Trypsin | IR | 2 | 362/287 |
90 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
92 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | EF | 2 | 307/294 |
94 | Pepsin (pH1.3) | ET | 2 | 236/248 |
95 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
96 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
99 | Trypsin | AIK | 3 | 428/330 |
106 | Trypsin | DQAEAQR | 7 | 826/816 |
114 | Pepsin (pH1.3) | SHDDDQVG | 8 | 816/871 |
115 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
117 | Trypsin | QK | 2 | 320/274 |
118 | Trypsin | R | 1 | 203/174 |
126 | Trypsin | ADGEDNEK | 8 | 832/876 |
127 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | H | 1 | 156/155 |
129 | Trypsin | IR | 2 | 362/287 |
130 | Pepsin (pH1.3) | Q | 1 | 146/146 |
131 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
134 | Trypsin | INK | 3 | 453/373 |
135 | Trypsin | R | 1 | 203/174 |
140 | Trypsin | IIVSK | 5 | 719/558 |
142 | Trypsin | SK | 2 | 268/233 |
145 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | NSL | 3 | 357/332 |
147 | Trypsin | GK | 2 | 241/203 |
148 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
151 | Pepsin (pH1.3) | GNT | 3 | 276/290 |
152 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
155 | Trypsin | KPR | 3 | 494/399 |
159 | Pepsin (pH1.3) | SVAS | 4 | 383/362 |
160 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
161 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
162 | Pepsin (pH1.3) | K | 1 | 189/146 |
163 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
164 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | F | 1 | 192/165 |
165 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | M | 1 | 208/149 |
167 | Trypsin | CK | 2 | 328/249 |
170 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | GGF | 3 | 296/279 |
187 | Trypsin | TSVVPEPR | 8 | 000/884 |
181 | Pepsin (pH1.3) | NTF | 3 | 401/380 |
185 | Trypsin | PQSR | 4 | 528/486 |
186 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | M | 1 | 208/149 |
188 | Pepsin (pH1.3) | EK | 2 | 305/275 |
189 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
190 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
191 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
194 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | AIL | 3 | 413/315 |
196 | Trypsin | QK | 2 | 230/274 |
197 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
205 | Pepsin (pH1.3) | IHPQNSST | 8 | 928/882 |
206 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
209 | Trypsin | VAK | 3 | 401/316 |
210 | Trypsin | R | 1 | 203/174 |
211 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | H | 1 | 156/155 |
212 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
214 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | DW | 2 | 317/319 |
215 | Trypsin | K | 1 | 189/146 |
224 | Pepsin (pH1.3) | PDETEINEC | 9 | 074/1049 |
225 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
228 | Pepsin (pH1.3) | EDA | 3 | 298/333 |
229 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
230 | Trypsin | R | 1 | 203/174 |
231 | Pepsin (pH1.3) | D | 1 | 104/133 |
232 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
238 | Pepsin (pH>2) | DDDGAK | 6 | 586/619 |
239 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | W | 1 | 228/204 |
241 | Trypsin | VK | 2 | 322/245 |
245 | Pepsin (pH>2) | TDSE | 4 | 403/450 |
246 | Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) | Y | 1 | 191/181 |
248 | Pepsin (pH1.3) | IV | 2 | 307/230 |
249 | Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) | L | 1 | 175/131 |
251 | end of sequence | EM | 2 | 323/287 |
|
|
|
|
|
شکل 5. نتيجه بررسي شباهت قطعه 9 اسيدآمينه‌اي (PDETEINEC) حاصل از هضم پروتئين DRO1 با آنزيم‌هاي پپسين، تريپسين و کموترپسين در پايگاه Allermatchtm
بررسي ما نشان داد توالي 6 تايي مرتبط با آلرژن مربوط به اسيدهاي آمينه 218 تا 223 در موتيف هشتم کشف شده توسط پايگاه MEME از پروتيئن DRO1 بوده (شکل 3 بالا) و در 14 توالي از 22 توالي انتخاب شده ما حضور دارد. بررسي بيشتر اين موتيف در شکل 6 و جدول 3 نشان داده شده است. محل اين شش اسيدآمينه (ETEINE) در اين موتيف 15 اسيدآمينه‌اي نشان مي‌دهد سه اسيدآمينه آن در اين 14 توالي DRO مشترک و در سه اسيدآمينه بين اين توالي ها اختلاف است که بيشترين اختلاف مربوط به حضور اسيدآمينه ترئونين (دومين اسيدآمينه مچ شده با آلرژن) نشان داده شده است. بر اساس جدول 3 حضور اين موتيف با بيشترين مطابقت بين توالي‌هاي DRO1 انتخاب شده مربوط به H. vulgare و با P- value ي 2/49e-19 بوده است.
شکل 6. الگوي تشخيص داده شده توسط پايگاه MEME براي توالي ETEINE حاصل از هضم شبيه‌سازي شده پروتئين DRO1 برنج با آنزيم‌هاي معده
اين الگو که در موتيف هشتم معرفي شده در اين تحقيق براي پروتئين DRO1 برنج وجود دارد نشان داد شباهت آن به آلرژن پروتئاز سرين بسيار ناچيز است به ويژه اينکه اسيد آمينه ترئونين با حداقل تعداد در الگوي اين موتيف (جايگاه ششم) وجود دارد.
جدول 3. سایت موتیف (موتيف هشتم معرفي شده براي پروتئين DRO1 برنج) با 10 اسيدآمينه کناری در دو طرف (SALAPRRHLDWKPDEQEINECLEDALRDLDDDGAK) در 14 توالي متناظر با DRO1 از گياهان مختلف
ترتيب قرابت به DRO1 برنج | Name | Start | p-value |
10 | XP_044949098.1 | 214 | 2.49e-19 |
9 | XP_044388791.1 | 213 | 2.49e-19 |
7 | XP_040246316.1 | 214 | 2.49e-19 |
6 | XP_044949099.1 | 214 | 2.49e-19 |
5 | XP_044388792.1 | 213 | 2.49e-19 |
4 | XP_020188438.1 | 214 | 2.49e-19 |
3 | XP_048530259.1 | 214 | 2.49e-19 |
1 | XP_025876116.1 | 214 | 1.36e-18 |
11 | XP_039795347.1 | 212 | 1.61e-17 |
8 | XP_039817506.1 | 212 | 1.61e-17 |
2 | XP_006660662.1 | 214 | 2.32e-17 |
14 | XP_047050258.1 | 203 | 3.21e-16 |
13 | XP_047052322.1 | 203 | 3.21e-16 |
12 | XP_051187618.1 | 203 | 3.21e-16 |
موتيف داراي توالي حاصل از هضم شبيه‌سازي شده پروتئين DRO1 برنج با آنزيم‌هاي معده در برش 6 تايي در پايگاه Tomtom نيز بررسي شد. نتايج مربوط به سه موتيف شناخته شده پيدا شده توسط اين پايگاه بر اساس رتبه‌بندي E-value نسبت به موتيف شماره 8 در شکل 7 نشان داده شده است و نشان دهنده اين است که شش اسيدآمينه مرتبط با آلرژن در موتيف‌هاي شناخته شده توسط اين پايگاه وجود ندارد.
شکل 7. نتيجه بررسي موتيف هشتم معرفي شده براي پروتئين DRO1 برنج در پايگاه Tomtom
با توجه به اينکه نتايج ما ايمن بودن بالقوه پروتئين DRO1 را نشان مي‌داد ساختار سه بعدي اين پروتئين نيز براي اطمينان بيشتر از عدم مشابهت با پروتئاز سرين که در برش 6 تايي به دست آمده بود در پايگاه Phyre2 (23) به دست آمد و مقايسه شد و عدم مشابهت ساختار سه بعدي آنها تاييد شد (شکل 8).
بنابراين نتايج اين تحقيق نشان داد شواهدي مبني بر آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي پروتئين DRO1 برنج به صورت بالقوه وجود ندارد. براي اطمينان بيشتر از عدم پتانسيل آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي اين پروتيئن، از پايگاه AllerCatPro 2.0 نيز که يک وب سرور جديد برای پیش بینی پتانسیل حساسیت‌زایی است (21) استفاده شد. اين پايگاه که اخيرا توسعه داده شده پیش‌بینی پتانسیل آلرژی‌زایی توالی‌های پروتئین را هم بر اساس شباهت توالی اسید آمینه و هم بر اساس شباهت ساختارهای سه بعدی آنها بررسي کرده و از مجموعه داده‌های جامع براي اين منظور استفاده مي‌کند. نتايج اين پايگاه نه تنها به طور 100 درصد عدم وجود شواهدي دال بر آلرژين بودن اين پروتئين را نشان داد بلکه حتي عدم شباهت DRO1 به پروتئين‌هايي با آلرژي‌زايي کم و نيز عدم شباهت به آلرژن‌هاي خودايمني را نيز نشان داد. نتايج اين پايگاه در شکل 8 نشان داده شده و هيچ شواهدي مبني بر شباهت به آلرژن‌ها و پتانسيل آلرژي‌زايي در آن يافت نشده است.
شکل 8. تاييد ايمن بودن پروتئين DRO1 برنج در پايگاه AllerCatPro 2.0 وب سروري برای پیش‌بینی پتانسیل حساسیت‌زایی پروتئین (21)
بحث و نتيجه‌گيري
برنج غذای اصلی بیش از نیمی از جمعیت جهان است. این محصول در بیش از 100 کشور کشت می‌شود و 90 درصد تولیدات جهاني آن در آسیا است. به دليل مصرف زياد آب در کشت برنج ارائه راهکارهايي که بتوانند ميزان مصرف آب را در کشت برنج کاهش دهند در جهت دستيابي به امنيت غذايي اين محصول موثر خواهند بود. در اين تحقيق پروتئين DRO1 از منشا يک گونه وحشي برنج به منظور استفاده اثرات مفيد آن در بهبود ساختار ريشه در جهت تحمل به خشکي و افزايش عملکرد گياه بررسي شد. پس از شناسايي پروتئين‌هاي متناظر آن در گياهان تک لپه و دولپه و شناسايي موتيف‌ها، ارزيابي پتانسيل آلرژي‌زايي و ايمني‌زايي آن نشان داد که فاقد هر گونه شباهت توالي و ساختار سه بعدي با آلرژن‌هاي شناخته شده بوده و مي‌توان آن را به طور بالقوه ايمن در نظر گرفت و با انتقال اين ژن به صورت بيش بيان و نيز مختص ريشه در برنج تجاري رقم هاشمي به لاين‌هايي دست يافت که در شرايط کم‌آبي عملکرد مناسبي از خود نشان دهند. در سیستم‌های تولید دیم، ظرفیت گیاهان زراعی برای جذب آب از حجم بیشتری از خاک برای پایداری عملکرد بسیار مهم است و تا حد زیادی به سیستم ریشه عمیق بستگی دارد. در این زمینه، ژن DRO1 در برنج به عنوان یک تنظیم کننده زاویه ریشه شناسایی شده است(25و24). رقم برنج کيناندانگ پاتانگ (KP) با یک نسخه کامل از DRO1 ریشه‌اي عمودي با زاويه تند را نشان می‌دهد، در حالی که رقم برنج IR64 دارای ریشه‌های کم عمق‌تری است که به یک نسخه ناقص از آلل DRO1 نسبت داده می‌شود(25). تحقيقات ما نيز نشان داد رقم هاشمي که در بين مردم کشور ما از بازارپسندي خوبي برخوردار است به دليل وجود نسخه ناقص اين ژن نمي‌تواند از مزاياي آن در بهبود ساختار ريشه، تحمل خشکي و بهبود عملکرد استفاده کند(12-10). ریشه‌زایی عمیق در برنج برای تحمل به خشکی، جذب نیتروژن، جريان سیتوکینین بیشتر در طول پر شدن دانه و عملکرد بیشتر محصول مرتبط است(14). ارقام مختلفي از برنج وجود دارند که داراي سیستم ریشه‌اي متفاوتي هستند(26). ارقام زراعي مانند IR64 که‌به‌طور وسیعی در آسیا کشت می‌شود دارای ریشه سطحی هستند، در حالی‌که رقم KP، ریشه‌دهی عمیق را نشان داده است(13). ژن مسئول این صفت، DRO1 است(25). بیان بالای DRO1 سبب تغيير زاويه رشد ريشه شده، منجر می‌شود که ریشه‌ها به سمت عمق خاک رشد کنند(27). ریشه عمیق، صفتي پیچیده و ترکیبی از اثرات زاویه رشد ریشه، طول ریشه اولیه و ریشه‌هاي گره‌ای است(28). ژن DRO1 رابطه‌اي عکس با اکسین دارد که در طویل‌شدن سلول‌ها در راس ریشه که سبب رشد نامتقارن ریشه و گره‌خوردگی انتهای ریشه در پاسخ به جاذبه زمین می‌شود، دخالت دارد(28). این ژن در شرایط خشکی نقش مناسبي در افزایش طول ریشه و افزایش جذب آب و مواد غذایی دارد. انتقال DRO1 به یک رقم برنج با ریشه کم عمق، لاین حاصل را قادر ساخت تا از خشکی توسط افزایش عمق ریشه‌دهی خود اجتناب کند و این امر منجر‌به حفظ عملکرد بالا در شرایط تنش خشکی در مقایسه با رقم اولیه شاهد شد(13). در تحقیق مذکور، بیوماس و طول ریشه تغییر چندانی نداشت ولی میزان محصول نهایی (دانه‌های پر شده) در تنش خشکی متوسط و شدید حدود 30 درصد افزایش نشان داد(15). مطالعات نشان دادند که ژن DRO1 توانایی افزایش جذب نیتروژن را داشته و همچنین با تنظیم جریان سیتوکنین، نقش مهمی را در پر شدن دانه‌ها را در شرایط مزرعه ایفا مي‌کند(14). در اين تحقيق علاوه بر تاييد ايمني بالقوه پروتئين DRO1 که بيان دائمي آن را در لاين‌هاي حاصل فاقد احتمال خطر آلرژي‌زايي و حساسيت‌زايي پيش‌بيني مي‌کند، بيان مختص ريشه و عدم حضور پروتئين حاصل در بذر نيز مي‌تواند در اطمينان بيشتر از ايمني محصولات غذايي حاصل موثر باشد. بررسي‌هاي ايمني زيستي تضمین بهره‌برداری از فواید قطعی بیوتکنولوژی مدرن و مدیریت آثار جانبی احتمالی کاربرد این فناوری را دربرداشته و استفاده از مزاياي مهندسي ژنتيک در جهت امنيت غذايي را در پي خواهد داشت(29). همچنين در اين تحقيق منشا ژن DRO1 از يکي از گونه هاي برنج بوده و انتقال ژن‌هاي مفيد از گونه‌هاي قابل تلاقي از طريق مهندسي ژنتيک به گياه هدف که به سيس‌ژنسيس و اينتراژنسيس معروف است در برخي کشورها با قوانين کمتر سختگيرانه‌اي مواجه هستند. بديهي است آزمايشات تکميلي ايمني‌زيستي و فيزيولوژي در مراحل بعدي پژوهشي مورد نياز خواهند بود.
منابع
1. Aalberse RC. Structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol. 2000;106(2):228–38.
2. Sarwar MH, Sarwar MF, Sarwar M, Qadri NA, Moghal S. The importance of cereals (Poaceae: Gramineae) nutrition in human health: A review. J Cereal oilseeds. 2013;4(3):32–5.
3. Mueller ND, Gerber JS, Johnston M, Ray DK, Ramankutty N, Foley JA. Closing yield gaps through nutrient and water management. Nature. 2012;490(7419):254.
4. Ray DK, Mueller ND, West PC, Foley JA. Yield trends are insufficient to double global crop production by 2050. PLoS One. 2013;8(6):e66428.
5. Luo L, Xia H, Lu B-R. Crop breeding for drought resistance. Vol. 10, Frontiers in plant science. Frontiers Media SA; 2019. p. 314.
6. Khan MA, Gemenet DC, Villordon A. Root system architecture and abiotic stress tolerance: current knowledge in root and tuber crops. Front Plant Sci. 2016;7:1584.
7. Shorinola O, Kaye R, Golan G, Peleg Z, Kepinski S, Uauy C. Genetic screening for mutants with altered seminal root numbers in hexaploid wheat using a high-throughput root phenotyping platform. G3 Genes, Genomes, Genet. 2019;9(9):2799–809.
8. Gewin V. An underground revolution: plant breeders are turning their attention to roots to increase yields without causing environmental damage. Virginia Gewin unearths some promising subterranean strategies. Nature. 2010;466(7306):552–4.
9. Maqbool S, Hassan MA, Xia X, York LM, Rasheed A. Root system architecture in cereals : progress , challenges and perspective. 2022;23–42.
10. Zandi M, Hosseini R, Mohsenpour M, HOSSEINI SG, Ghareyazie B. Transformation of DRO1, OsNAC5, OsEXPA8 genes in order to improve rice root architecture modification and improved drought tolerance in rice. 2019;
11. Ghorbanzadeh Z, Kazemi Alamouti M, Pourhang L, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Identificatioan and investigation of DRO1 gene in rice cultivar Hashemi and its simultaneous transfer with OsCKX4 gene to improve root structure. Crop Biotechnol. 2022;11(36):49–62.
12. Kazemi M, Ghorbanzadeh Z, Pourhang L, Mousavi pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Rice genetic engineering using transformation of Deeper Rooting1 and Phosphorus-Starvation Tolerance1 genes. Agric Biotechnol J. 2022;14(1):1–20.
13. Uga Y, Okuno K, Yano M. Dro1 , a major QTL involved in deep rooting of rice under upland field conditions. 2011;62(8):2485–94.
14. Arai-Sanoh Y, Takai T, Yoshinaga S, Nakano H, Kojima M, Sakakibara H, et al. Deep rooting conferred by DEEPER ROOTING 1 enhances rice yield in paddy fields. Sci Rep. 2014;4:5563.
15. Uga Y, Kitomi Y, Yamamoto E, Kanno N, Kawai S, Mizubayashi T, et al. A QTL for root growth angle on rice chromosome 7 is involved in the genetic pathway of DEEPER ROOTING 1. Rice. 2015;8(1):8.
16. Kitomi Y, Itoh J, Uga Y. Genetic Mechanisms Involved in the Formation of Root System Architecture. 2018. 241-274 p.
17. Gupta S, Stamatoyannopoulos JA, Bailey TL, Noble WS. Quantifying similarity between motifs. Genome Biol. 2007;8:1–9.
18. Goodman RE, Ebisawa M, Ferreira F, Sampson HA, van Ree R, Vieths S, et al. AllergenOnline: a peer‐reviewed, curated allergen database to assess novel food proteins for potential cross‐reactivity. Mol Nutr Food Res. 2016;60(5):1183–98.
19. Codex Alimentarius Commission. Guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-DNA plants. Vol. 45, CAC/GL. 2003.
20. FAO/WHO. Joint FAO/WHO Expert Consultation on Foods Derived from Biotechnology–Allergenicity of Genetically Modified Foods–Rome, 22–25 January 2001. Rome, Food and Agriculture Organisation of the United Nations. 2001.
21. Nguyen MN, Krutz NL, Limviphuvadh V, Lopata AL, Gerberick GF, Maurer-Stroh S. AllerCatPro 2.0: a web server for predicting protein allergenicity potential. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W36–43.
22. Bailey TL, Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in bipolymers. 1994;
23. Kelley LA, Mezulis S, Yates CM, Wass MN, Sternberg MJE. The Phyre2 web portal for protein modeling , prediction and analysis. Nat Protoc. 2015;10(6):845–58.
24. Uga Y. Quantitative measurement of root growth angle by using the basket method. Methodol root drought Stud rice Philipp Int Rice Res Inst. 2012;22–6.
25. Uga Y, Sugimoto K, Ogawa S, Rane J, Ishitani M, Hara N, et al. Control of root system architecture by DEEPER ROOTING 1 increases rice yield under drought conditions. Nat Genet. 2013;(August):1–9.
26. Uga Y, Ebana K, Abe J, Morita S, Okuno K, Yano M. Variation in root morphology and anatomy among accessions of cultivated rice (Oryza sativa L.) with different genetic backgrounds. Breed Sci. 2009;59(1):87–93.
27. Kondo M, Murty MVR, Aragones D V. Characteristics of root growth and water uptake from soil in upland rice and maize under water stress. Soil Sci Plant Nutr. 2000;46(3):721–32.
28. Araki H, Morita S, Tatsumi J, Iijima M. Physiol-morphological analysis on axile root growth in upland rice. Plant Prod Sci. 2002;5(4):286–93.
29. Mohsenpour M, Kahak S, Ghareyazie B. Genetic Engineering and Food Security. Strateg Res J Agric Sci Nat Resour. 2018;3(2):195–208.