بهینهسازی استخراج RNA از نمونههای مدفوع با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده: ارزیابی و مقایسه با کیت تجاری
محورهای موضوعی :
حنان خدائی
1
,
لیلا عظیمی
2
*
,
عباس اخوان سپهی
3
,
فاطمه اشرفی
4
,
مریم رجب نژاد
5
1 -
2 - 1. Pediatric Infections Research Center (PIRC), Research Institute for Children's Health (RICH), Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
3 - عضو هیات علمی دامشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال
4 - 1) گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران
5 - مرکز تحقیقات عفونی اطفال، پژوهشکده سلامت کودکان، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران
کلید واژه:
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: استخراج RNA از نمونههای مدفوع به دلیل وجود مهارکننده‌ها و پیچیدگی‌های ترکیب شیمیایی مدفوع، یک چالش عمده در تشخیص مولکولی عوامل بیماری‌زای دستگاه گوارش به شمار می‌رود. هدف این مطالعه، طراحی و بهینهسازی یک بافر لیز کارآمد برای استخراج RNA کامل از نمونههای مدفوع و مقایسه عملکرد آن با کیت تجاری می باشد. مواد و روش‌ها: نمونههای مدفوع از بیماران بستری در بخشهای مختلف بیمارستان کودکان مفید جمع‌آوری شد. بافر لیز بر اساس ترکیبات گوانیدینیوم تیوسیانات، Tris-HCl، EDTA و CTAB تهیه گردید. شرایط استخراج شامل تغییر در مقادیر بافر لیز، پروتئیناز K و حامل RNA در سه حالت مختلف بررسی شد. کیفیت RNA استخراج‌شده با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده و استفاده از ستون های استخراج سیلیکونی، با استفاده از دستگاه Qubit وتکنیک Real-Time PCR با کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از کیت تجاری بر پایه بید مغناطیسی، مورد مقایسه قرار گرفت. به منظور انجام Real-Time PCR از ژن کنترل داخلی RNase P ، ژنهای ویروسی E و S ویروس SARS - CoV-2 استفاده گردید. یافته‌ها: حالت بهینه استخراج در ترکیب 600 میکرولیتر بافر لیز طراحی شده، 20 میکرولیتر حامل RNA و 60 میکرولیتر پروتئیناز K به دست آمد. در این شرایط، میانگین مقادیر Ct برای ژنهای RNase P، S و E کمتر از کیت تجاری بود و غلظت RNA نیز بالاتر اندازه‌گیری شد. نتیجه‌گیری: روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده، کارایی بالاتری نسبت به کیت تجاری در استخراج RNA از نمونههای مدفوع داشت و می‌تواند به عنوان جایگزین مقرون به صرفه در تشخیص مولکولی به کار رود. کلمات کلیدی: استخراج RNA، نمونه مدفوع، SARS-CoV-2، بافر لیز
فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی
بهینهسازی استخراج RNA از نمونههای مدفوع با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده: ارزیابی و مقایسه با کیت تجاری
حنان خدائی1، لیلا عظیمی2*، عباس اخوان سپهی3، فاطمه اشرفی4، مریم رجب نژاد5
1. دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2. دانشیار، مرکز تحقیقات عفونی اطفال، پژوهشکده سلامت کودکان، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران
3. استاد، گروه میکروبیولوژی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
4. استادیار، گروه میکروبیولوژی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
5. استادیار، مرکز تحقیقات عفونی اطفال، پژوهشکده سلامت کودکان، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران
چکیده
سابقه و هدف: استخراج RNA از نمونههای مدفوع به دلیل وجود مهارکننده‌ها و پیچیدگی‌های ترکیب شیمیایی مدفوع، یک چالش عمده در تشخیص مولکولی عوامل بیماری‌زای دستگاه گوارش به شمار می‌رود. هدف این مطالعه، طراحی و بهینهسازی یک بافر لیز کارآمد برای استخراج RNA کامل از نمونههای مدفوع و مقایسه عملکرد آن با کیت تجاری می باشد.
مواد و روش‌ها: نمونههای مدفوع از بیماران بستری در بخشهای مختلف بیمارستان کودکان مفید جمع‌آوری شد. بافر لیز بر اساس ترکیبات گوانیدینیوم تیوسیانات، Tris-HCl، EDTA و CTAB تهیه گردید. شرایط استخراج شامل تغییر در مقادیر بافر لیز، پروتئیناز K و حامل RNA در سه حالت مختلف بررسی شد. کیفیت RNA استخراج‌شده با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده و استفاده از ستون های استخراج سیلیکونی، با استفاده از دستگاه Qubit وتکنیک Real-Time PCR با کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از کیت تجاری بر پایه بید مغناطیسی، مورد مقایسه قرار گرفت. به منظور انجام Real-Time PCR از ژن کنترل داخلی RNase P ، ژنهای ویروسی E و S ویروس SARS - CoV-2 استفاده گردید.
یافته‌ها: حالت بهینه استخراج در ترکیب 600 میکرولیتر بافر لیز طراحی شده، 20 میکرولیتر حامل RNA و 60 میکرولیتر پروتئیناز K به دست آمد. در این شرایط، میانگین مقادیر Ct برای ژنهای RNase P، S و E کمتر از کیت تجاری بود و غلظت RNA نیز بالاتر اندازه‌گیری شد.
نتیجه‌گیری: روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده، کارایی بالاتری نسبت به کیت تجاری در استخراج RNA از نمونههای مدفوع داشت و می‌تواند به عنوان جایگزین مقرون به صرفه در تشخیص مولکولی به کار رود.
کلمات کلیدی: استخراج RNA، نمونه مدفوع، SARS-CoV-2، بافر لیز.
Optimization of RNA Extraction from Stool Samples Using a Designed Lysis Buffer: Evaluation and Comparison with a Commercial Kit
Hannan Khodaei1, Leila Azimi2*, Abbas Akhavan Sepahy3, Fatemeh Ashrafi4, Maryam Rajabnejad5
1. Ph.D. student, Department of Microbiology, NT.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
2. Associate professor, Pediatric Infections Research Center, Research Institute for children`s Health, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
3. Professor, Department of Microbiology, NT.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
4. Assistant professor, Department of Microbiology, NT.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran
5. Assistant professor, Pediatric Infections Research Center, Research Institute for children`s Health, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
Abstract
Background and Objective: Extracting RNA from stool samples poses a major challenge in the molecular diagnosis of gastrointestinal pathogens due to the presence of inhibitors and the complex chemical composition of feces. This study aimed to design and optimize an efficient lysis buffer for extracting intact RNA from stool samples and to compare its performance with that of a commercial kit.
Materials and Methods: Stool samples were collected from patients hospitalized in various wards of Mofid Children’s Hospital. The lysis buffer was prepared using guanidinium thiocyanate, Tris-HCl, EDTA, and CTAB. Extraction conditions were tested by varying the amounts of lysis buffer, proteinase K, and RNA carrier across three different setups. The quality of RNA extracted using the designed lysis buffer combined with silica spin columns was evaluated by Qubit and Real-Time PCR and compared to RNA extracted using a commercial magnetic bead-based kit. For Real-Time PCR, the internal control gene RNase P and SARS-CoV-2 viral genes E and S were employed.
Results: The optimal extraction condition consisted of 600 µL of the designed lysis buffer, 20 µL of RNA carrier, and 60 µL of proteinase K. Under these conditions, the average Ct values for RNase P, S, and E genes were lower than those obtained with the commercial kit, and RNA concentration was also higher.
Conclusion: The extraction method using the designed lysis buffer demonstrated higher efficiency than the commercial kit for RNA extraction from stool samples and can serve as a cost-effective alternative in molecular diagnostics.
Keywords: RNA extraction, stool sample, SARS- CoV-2, lysis buffer.
مقدمه
نویسنده ی مسئول: دانشیار، مرکز تحقیقات عفونی اطفال، پژوهشکده سلامت کودکان، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران ایران آدرس الکترونیک: leilaazimi1982@gmail.com تاریخ دریافت مقاله: 01/02/1404 تاریخ پذیرش مقاله: 19/06/1404 |
مواد و روش‌ها
طراحی مطالعه و جمع‌آوری نمونهها
در این مطالعه 100 نمونه مدفوع از بیماران بستری در بخشهای اورژانس، عفونی، گوارش و بخشهای ویژه نوزادان و اطفال بیمارستان کودکان مفید، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، جمع‌آوری گردید. تمامی مراحل با اخذ رضایت آگاهانه از بیماران یا والدین آنان و طبق کد اخلاق (IR.SBMU.RICH.REC.1400.038) انجام شد.
آماده‌سازی نمونهها
نمونههای مدفوع پس از جمع‌آوری در ظروف استریل، بلافاصله به مرکز تحقیقات عفونی اطفال مستقر در بیمارستان کودکان مفید منتقل و تا زمان آزمایش در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در زمان استخراج، نمونهها به دمای اتاق رسانده شده و با آب استریل RNase/DNase-free به نسبت 1:5 (وزنی/حجمی) همگن‌سازی شدند. برای تعیین وزن خالص مدفوع، ابتدا میکروتیوب‌ها توزین شده، سپس مقدار مشخصی نمونه به آن‌ها اضافه و مجدداً توزین شدند.
ترکیب و تهیه بافر لیز
بافر لیز اختصاصی این مطالعه بر پایه مواد chaotropic و شوینده‌های قوی تهیه شد. ترکیب نهایی بافر در جدول 1 ذکر شده است.
جدول 1. ترکیبات بافر لیز
نام ماده | غلظت (میلی مول) | حجم/وزن (گرم) |
گوانیدینیوم تیوسیونات1 | 1016 | 120 |
Tris-Cl (0.1 M, pH = 6.4) | 10 | 567/1 |
EDTA2 (0.5 M, pH = 8.0) | 50 | 612/18 |
ستیل تری متیل آمونیوم بروماید3 | 2/4 | 48/1 |
در یک ارلن مایر ۵۷۶/۱ گرم Tris-Cl در ۶۰ میلی لیتر آب دیونیزه استریل با هم زدن مداوم حل شد. میزان pH با استفاده از محلول سدیم هیدروکساید 1/0 مولار روی ۴/۶ تنظیم و سپس با استفاده از آب دیونیزه و خالص به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسید.
۱۲۰ گرم گوانیدینیوم تیوسیانات وزن شد و به طور کامل مستقیما وارد محلول ساخته شده از Tris-Cl شد و با کمک حمام اولتراسونیک در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد حل شد. در یک ارلن مایر دیگر ۶۱۲/۱۸ گرم EDTA با ۸۰ میلی لیتر آب دیونیزه و خالص حل شد و همزمان pH محلول با استفاده از محلول سدیم هیدروکساید 1/0 مولار روی ۸ تنظیم گردید. سپس محلول را فیلتر کرده و با استفاده از آب دیونیزه و خالص به حجم ۱۰۰میلی لیتر میرسانیم، سپس 8/8 میلی لیتر از محلول EDTA به محلول گوانیدینیوم تیوسیانات اضافه گردید. در پایان 48/1 گرم از CTAB در 100 میلی لیتر آب دیونیزه مخلوط و به محلول نهایی اضافه شد و به خوبی مخلوط گردید تا محلولی کاملا یکنواخت حاصل شود. گوانیدینیوم تیوسیانات در دناتوره کردن پروتئین‌ها و غیرفعال‌سازی RNase ، EDTA در مهار یون‌های دوظرفیتی، Tris در تثبیت pH و CTAB در حذف پلی‌ساکاریدها و لیپیدها، نقش دارند.
طراحی شرایط استخراج و بهینهسازی
به منظور تعیین بهترین شرایط استخراج، مقادیر متفاوت بافر لیز، پروتئیناز K و Poly-A به عنوان حامل RNA انتخاب شد (جدول 2) و بر روی پنج نمونه با در نظر گرفتن 27 حالت مختلف مورد بررسی قرار گرفت (جدول 3).
جدول 2. حجم مواد متغیر استفاده شده در بهینه سازی کیت استخراج
حجم پروتئیناز K | حجم حامل RNA | حجم بافر لیز |
15 میکرولیتر | ۵ میکرولیتر | ۳۰۰ میکرولیتر |
30 میکرولیتر | ۱۰ میکرولیتر | 600 میکرولیتر |
60 میکرولیتر | ۲۰ میکرولیتر | ۹۰۰ میکرولیتر |
جدول3. حالتهای (27- 1) درنظر گرفته شده برای بهینه سازی کیت استخراج
| حامل RNA | حامل RNA
| حامل RNA
| |||||||||
| 5 میکرولیتر | 10 میکرولیتر | 20 میکرولیتر | |||||||||
| پروتئینازk 15 میکرولیتر | پروتئینازk 30 میکرولیتر
| پروتئینازk 60 میکرولیتر | پروتئینازk 15 میکرولیتر | پروتئینازk 30 میکرولیتر
| پروتئینازk 60 میکرولیتر | پروتئینازk 15 میکرولیتر | پروتئینازk 30 میکرولیتر
| پروتئینازk 60 میکرولیتر | |||
بافر ۳۰۰ میکرولیتر | 1 | 2 | 3 | 4 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | |||
بافر 600 میکرولیتر | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | |||
بافر ۹۰۰ میکرولیتر | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | |||
فرایند استخراج RNA
پس از اضافه کردن آب استریل و عاری از آنزیمهای DNase و RNase، به میکروتیوب های حاوی مدفوع، نمونه ها مخلوط و همگن شدند، سپس با سرعت ۵000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شده و در نهایت به میزان 300 میکرولیتر از مایع رویی برای انجام مراحل استخراج برداشت شد. در مرحله بعد از بافر لیز با توجه به مقادیر مختلف موجود در جدول 3 به هر نمونه اضافه شد و 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار گرفت تا محلول برداشت شده از نمونهی مدفوع با بافر لیز همراه با حامل RNA و پروتئیناز K تیمار گردند. در مرحله بعد محلول به ستون استخراج دارای فیلتر های سیلیکونی (ساخت شرکت روژه، ایران) که به صورت تجاری خریداری شد، اضافه گردید و سانتریفیوژ به مدت یک دقیقه با سرعت ۱۰000 دور بر دقیقه انجام شد. مراحل شست و شو با استفاده از الکل مطلق و طی دو مرحله انجام شد و در نهایت از 50 میکرولیتر آب گرید مولکولی به عنوان بافر حل کننده استفاده گردید. در انتها سانتریفیوژ به مدت 1 دقیقه با دور 10000 در دقیقه انجام شد. در این مرحله محلول خارج شده از ستون، حاوی RNA خالص سازی شده از نمونه مدفوع می باشد.
این روش استخراج پس از بهینه سازی نهایی مقادیر بافر لیز، پروتئیناز K و حامل RNA ، بر روی تمامی 100 نمونه تکرار و نتایج حاصل از Real-time PCR با نتایج استفاده از کیت تجاری بر پایه بیدهای مغناطیسی مورد مقایسه قرار گرفت. همچنین غلظت RNA استخراج شده بوسیله دستگاه Qubit که یک دستگاه فلورومتر برای سنجش میزان RNA با واحد میکروگرم در میلی لیتر میباشد، خوانده شد.
روش مقایسه‌ای با کیت تجاری
برای مقایسه عملکرد، استخراج RNA از همان نمونهها با استفاده از کیت تجاری استخراج کامل RNA از شرکت Tianlong (Lot No: H2219011811. PRC) انجام شد. مکانیسم این کیت بر پایهی بید های مغناطیسی و بار الکتریکی می باشد و حاوی پلیتهایی است که پس از اضافه کردن نمونه در دستگاه استخراج اتومات ( Tianlong Extraction machine Libex model) متعلق به همین شرکت قرار گرفت و فرآیند استخراج به صورت ماشینی انجام شد.
تعیین غلظت و خلوص RNA
غلظت RNA با استفاده از فلورومتر Qubit و کیت Qubit RNA HS Assay Kit اندازه‌گیری شد.
ارزیابی عملکرد روش طراحی شده با Real-Time PCR
ارزیابی کارایی استخراج بر اساس توانایی شناسایی ژن کنترل داخلی (RNase P) و دو ژن ویروسی S و E مربوط به SARS-COV-2 انجام شد به این منظور از کیت تجاری COVITECH(Lot No: COVIT-21008-1.Iran) و دستگاه Real-Time PCR برند Corbett Rotor-Gene 6000 استفاده شد. برنامه حرارتی در جدول 4 ذکر شده است.
جدول 4. برنامه دمایی Real-Time-PCR
مرحله | دما( درجه سانتیگراد) | زمان | دور |
رونویسی معکوس | 55 | 10 دقیقه | 1 |
واسرشتگی اولیه | 95 | 3 دقیقه | 1 |
واسرشتگی | 95 | 15 ثانیه | 50 |
اتصال مجدد، طویل سازی و جمع آوری داده ها | 60 | 1 دقیقه |
تحلیل آماری
برای مقایسه میانگین مقادیر Ct و غلظت RNA بین روش طراحی‌شده و کیت تجاری، از آزمون Paired t-test در نرم‌افزار SPSS نسخه 22 استفاده شد.
نتایج
ویژگی‌های جمعیت‌شناختی نمونهها
در این مطالعه از 100 نمونه مدفوع استفاده شد. علایم شایع در بیماران تب (74%) و دل درد (65%) بود، متوسط سنی بیماران 64/2 سال بود. بیماران شامل60% پسر و %40 دختر بودند. این بیماران در بخشهای مختلف بیمارستان مانند اورژانس، ریه، عفونی، گوارش، مراقبتهای ویژه نوزادان ، بخش مراقبتهای ویزه اطفال بستری بودند. بیشترین درصد نمونهها به ترتیب مربوط به بخش عفونی با %8/35 و بخش گوارش با %5/32 بودند.
بهینهسازی بافر لیز
نتایج بهینهسازی در 27 حالت مختلف، نشان داد که حالت شماره 18 ( 600 میکرولیتر بافر لیز، 20 میکرولیتر RNA حامل و 60 میکرولیتر Proteinase k ) و شماره 27 ( 900 میکرولیتر بافر لیز، 20 میکرولیتر RNA حامل و 60 میکرولیتر Proteinase k ) بهترین Ct را در ارتباط با ژن کنترل داخلی (IC=Ranse P) در هر پنج نمونه نشان داد که باتوجه به کمتر بودن میزان بافر لیز در حالت 18 ، به عنوان بهینه ترین روش و میزان انتخاب شد (جدول5).
جدول 5. نتایج 27 حالت مختلف بهینه سازی بر روی 5 نمونه
نتایج Ct ژن کنترل داخلی در پنج نمونه بهینهسازی شده | 27 حالت مختلف بهینهسازی | |||||
نمونه 5 | نمونه 4 | نمونه 3 | نمونه 2 | نمونه 1 |
| |
5/33 | - | - | 3/38 | - | 1 | |
1/33 | 3/36 | - | 38 | 3/34 | 2 | |
33 | 36 | 5/38 | 9/37 | 34 | 3 | |
33 | 1/36 | 3/38 | 5/37 | 9/32 | 4 | |
8/32 | 6/35 | 7/37 | 37 | 5/32 | 5 | |
6/32 | 3/35 | 5/37 | 5/36 | 3/32 | 6 | |
32 | 35 | 5/37 | 6/34 | 5/32 | 7 | |
1/32 | 35 | 2/37 | 5/34 | 3/32 | 8 | |
7/31 | 8/34 | 5/36 | 33 | 6/31 | 9 | |
7/31 | 34 | 3/36 | 5/34 | 29 | 10 | |
5/31 | 1/34 | 36 | 34 | 3/29 | 11 | |
3/31 | 6/33 | 36 | 2/34 | 5/28 | 12 | |
5/31 | 33 | 5/35 | 2/33 | 5/28 | 13 | |
31 | 8/32 | 35 | 33 | 3/28 | 14 | |
8/29 | 5/32 | 35 | 5/32 | 1/27 | 15 | |
3/29 | 31 | 34 | 8/32 | 3/26 | 16 | |
7/28 | 6/29 | 5/33 | 3/32 | 7/25 | 17 | |
5/27 | 3/28 | 3/32 | 31 | 3/25 | 18 | |
5/31 | 5/34 | 36 | 3/34 | 29 | 19 | |
3/31 | 34 | 2/36 | 5/34 | 29 | 20 | |
4/31 | 3/34 | 8/35 | 34 | 8/28 | 21 | |
31 | 5/33 | 3/35 | 6/33 | 6/28 | 22 | |
6/29 | 3/33 | 35 | 5/33 | 5/28 | 23 | |
4/29 | 6/33 | 8/34 | 33 | 27 | 24 | |
29 | 7/31 | 2/34 | 7/32 | 7/26 | 25 | |
5/28 | 2/30 | 5/33 | 3/32 | 5/25 | 26 | |
3/27 | 8/29 | 32 | 2/31 | 2/25 | 27 | |
مقایسه روش طراحی‌شده با کیت تجاری
پس از بهینهسازی، در این مطالعه به منظور استخراج RNA تمامی نمونههای مدفوع مورد مطالعه (100 نمونه) همزمان از کیت استخراج تجاری مربوط به دستگاه استخراج اتومات و بافر لیز بهینه شده همراه با ستون استخراج سیلیکونی استفاده شد و فرآیند Real-Time PCR با استفاده از کیت تجاری تشخیص SARS-COV-2 برند کوویتک انجام شد. نتایج حاصل نشان داد که روش طراحی شده جهت استخراج کامل RNA از مدفوع توانایی استخراج RNA کامل از تمامی نمونهها با حساسیت 100% با CI %95 را داشت. مقایسه نتایج Real-Time PCR انجام شده بر روی 100 نمونه مدفوع نشان داد که Ct ژنهای مورد بررسی در این مطالعه در روش استفاده از بافر لیز طراحی شده از روش کیت تجاری پایین تر بود. به این ترتیب که میانگین Ct ژن کنترل داخلی در نمونههای استخراج شده با استفاده از بافر لیز طراحی شده 42/2±04/26 و در روش استخراج با کیت تجاری و دستگاه اتومات 48/2±27/29 بود که نشان دهنده میانگین پایینتر برای روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی شده میباشد.
میانگین Ct ژن S در نمونههای استخراج شده به روش استفاده از بافر لیز طراحی شده 18/3±63/25 و در روش استخراج با کیت تجاری و دستگاه اتومات 32/4±54/28 بود که نشان دهنده میانگین پایینتر برای روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی شده میباشد. میانگین Ct ژن E در نمونههای استخراج شده به روش استفاده از بافر لیز طراحی شده 81/3±39/27 و در روش استخراج با کیت تجاری و دستگاه اتومات 73/4±23/30 بود که نشان دهنده میانگین پایینتر برای روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی شده میباشد.
غلظت RNA استخراج‌شده
خوانش RNA استخراج شده بوسیله دستگاه Qubit نشان داد که میانگین غلظت نمونههای استخراج شده به روش استفاده از بافر لیز طراحی شده 3/8 میکروگرم در میلی لیتر و در روش استخراج با کیت تجاری و دستگاه اتومات 7/6 میکروگرم در میلی لیتر بود.
شناسایی SARS-CoV-2 در نمونههای مدفوع
از 100 نمونه مدفوع بررسی شده با کیتهای طراحی شده در این مطالعه تعداد 45 نمونه کووید مثبت شناسایی شد علاوه بر آن، 5 نمونه که در روش تجاری منفی کاذب گزارش شده بودند، با روش بافر لیز مثبت شدند. این یافته‌ها حاکی از حساسیت بالاتر روش پیشنهادی در شناسایی موارد با بار ویروسی پایین است. در مجموع، تمامی نمونه های مثبت شده با استفاده از کیت تجاری و دستگاه استخراج اتومات، در روش استخراج طراحی شده نیز مثبت شدند (نتایج منفی کاذب در روش استخراج طراحی شده مشاهده نگردید).
بحث
نتایج این مطالعه نشان داد که طراحی و بهینهسازی یک بافر لیز بر پایه ترکیبات chaotropic و شوینده‌های قوی، می‌تواند کارایی استخراج RNA از نمونههای مدفوع را به‌طور معنی‌داری بهبود بخشد. مقادیر Ct پایینتر در ژن کنترل داخلی (RNase P) و ژنهای ویروسی S و E در روش طراحی‌شده نسبت به روش تجاری، نشان‌دهنده کیفیت بالاتر RNA و حذف بهتر مهارکننده‌ها است. این یافته‌ها همسو با مطالعات پیشین است که نقش کلیدی بافرهای حاوی گوانیدینیوم تیوسیانات را در غیرفعال‌سازی RNaseها و افزایش بازده استخراج RNA گزارش کردهاند(1, 8). در این پژوهش، روش طراحی‌شده با یک کیت تجاری مبتنی بر بید مغناطیسی (Tianlong) مقایسه شد. اگرچه کیتهای تجاری اغلب به‌عنوان "استاندارد طلایی" در استخراج اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شوند، اما محدودیت‌هایی مانند هزینه بالا، نیاز به تجهیزات خاص و کاهش کارایی در نمونههای پیچیده‌ای مانند مدفوع دارند(7) در مطالعه حاضر، روش طراحی‌شده توانست میانگین مقادیر Ct را در همه ژن‌ها به میزان 5/2 تا 2/3 سیکل کاهش دهد، که از نظر حساسیت واکنش PCR به معنای افزایش قابل‌توجه بازدهی استخراج است. مطالعات مشابه نیز گزارش کردهاند که اصلاح ترکیب بافر لیز و استفاده از حاملRNA ، به‌ویژه در نمونههای با غلظت پایینRNA ، می‌تواند باعث بهبود آشکار کیفیت استخراج شود(12). روش ما با افزودن RNA حامل و پروتئیناز K در مقادیر بهینه، همزمان دو مکانیسم بهبود کارایی را فعال کرده است: 1. افزایش میزان RNA بازیابی‌شده و 2. حذف پروتئین‌های مهارکننده. وجود ترکیباتی مانند اسیدهای صفراوی، پلی‌ساکاریدها، چربی‌ها و فلور میکروبی متنوع، چالش اصلی استخراج RNA از مدفوع است. مهارکننده‌ها می‌توانند باعث عدم شناسایی عوامل بیماری‌زا حتی در حضور RNA ویروسی شوند. در این مطالعه، ترکیب CTAB در بافر لیز نقش ویژه‌ای در حذف پلی‌ساکاریدها و مواد آلی نامحلول داشت. این ویژگی در مطالعات گیاهی نیز اثبات شده است، جایی که CTAB توانسته به‌طور مؤثری پلی‌ساکاریدها را از عصاره‌های پیچیده حذف کند(13). همچنین، گوانیدینیوم تیوسیانات به‌عنوان یک دناتوره‌کننده قوی، علاوه بر مهار RNaseها، باعث لیز کامل سلول‌ها و آزادسازی RNA می‌شود. ترکیب این ماده با EDTA برای شلاته کردن یون‌های دوظرفیتی مورد نیاز RNaseها و Tris-HCl برای حفظ pH پایدار در روش ما، یک محیط شیمیایی بهینه برای حفاظت از RNAرا فراهم کرد(14). چندین مطالعه پیشین بر استفاده از نمونههای مدفوع برای تشخیص SARS-CoV-2 تمرکز داشته‌اند(2). Wu و همکاران (2020) نشان دادند که RNA ویروس در 53% از نمونههای مدفوع بیمارانCOVID-19 ، با وجود نتیجه منفی در نمونه های تنفسی، قابل شناسایی بودند(2). Medema و همکاران (2020) در مطالعه پایش فاضلاب، اهمیت استخراج RNA با کارایی بالا را برای تشخیص زودهنگام شیوع بیماری برجسته کردند (4). مطالعه حاضر نیز این اهمیت را تأیید کرد. روش بهینه‌شده توانست 5 نمونه مثبت SARS-CoV-2 را که در روش تجاری منفی گزارش شده بودند، شناسایی کند. این امر می‌تواند ناشی از بازیابی بیشتر RNA در نمونه های با بار ویروسی پایین باشد، موضوعی که در کاربردهای اپیدمیولوژی محیطی 4(WBE) بسیار حیاتی است. مزیت اصلی روش پیشنهادی، ترکیب ساده ولی علمی بافر لیز و انطباق آن با شرایط نمونههای مدفوع است. برخلاف بسیاری از روش‌های تجاری که فرمول بسته دارند، این روش انعطاف‌پذیری بالایی برای تغییر نسبت ترکیبات بر اساس نوع نمونه و نیاز آزمایشگاه فراهم می‌آورد. همچنین استفاده از مواد شیمیایی رایج و در دسترس، هزینه استخراج را به‌طور قابل توجهی کاهش می‌دهد. از طرفی عدم نیاز به تجهیزات خاص باعث شده تا این روش قابل اجرا در آزمایشگاه‌های پایه با سانتریفیوژ و تجهیزات استاندارد باشد. کاهش معنی‌دار Ct در همه ژن‌ها و شناسایی موارد مثبت اضافی نشان از حساسیت بالاتر این بافر لیز در مقایسه با کیت تجاری دارد و میتوان از آن برای استخراج RNA از انواع پاتوژن‌های روده‌ای و ویروسی استفاده کرد. در شرایطی که محدودیت دسترسی به کیتهای وارداتی وجود دارد (به‌ویژه در زمان همه‌گیری‌ها یا تحریم‌ها)، روش‌های بومی مقرون به‌صرفه می‌توانند ظرفیت تشخیصی کشور را به‌طور چشمگیری افزایش دهند. برآورد هزینه‌ها در این مطالعه نشان داد که بدون کاهش کیفیت و حتی با بهبود حساسیت، قیمت تمام‌شده روش طراحی شده در این مطالعه حدود %52 کمتر از کیت تجاری است. با وجود مزایای قابل توجه، این مطالعه محدودیت‌هایی نیز دارد، به طور مثال ارزیابی روش تنها بر اساس نمونههای انسانی انجام شده و نیاز به آزمایش بر روی نمونههای حیوانی یا محیطی نیز وجود دارد همچنین عملکرد روش در شرایط نگهداری طولانی‌مدت نمونهها بررسی نشده است. به طور کلی مقایسه این روش با بیش از یک کیت تجاری می‌تواند اعتبار یافته‌ها را افزایش دهد. پیشنهاد می‌شود در پژوهش‌های بعدی از این روش برای استخراج RNA از سایر نمونههای پیچیده مانند خاک، لجن فاضلاب و مواد غذایی نیز استفاده شود.
نتیجه‌گیری
مطالعه حاضر نشان داد که طراحی یک بافر لیز بهینه بر پایه ترکیبات موجود در بازار داخلی، می‌تواند عملکردی هم‌سطح یا حتی بالاتر از کیتهای تجاری گران‌قیمت داشته باشد. کاهش مقادیر Ct، افزایش غلظت RNA و شناسایی موارد مثبتی که در زمان استفاده از کیت تجاری استخراج، نتایج به صورت منفی کاذب مشاهده شده بود، همگی بیانگر کارایی بالای این روش است. این دستاورد نه‌تنها از نظر علمی، بلکه از نظر اقتصادی و عملیاتی نیز ارزشمند است و می‌تواند به‌عنوان یک گزینه پایدار برای آزمایشگاه‌های تشخیصی به‌ویژه در شرایط محدودیت منابع مطرح شود.
[1] Guanidinium thiocyanate
[2] Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
[3] Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)
[4] Wastewater-Based Epidemiology
منابع
1. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 1987;162(1):156-9.
2. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265-9.
3. Xiao K, Zhai J, Feng Y, Zhou N, Zhang X, Zou JJ, et al. Isolation of SARS-CoV-2-related coronavirus from Malayan pangolins. Nature. 2020;583(7815):286-9.
4. Medema G, Heijnen L, Elsinga G, Italiaander R, Brouwer A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in Sewage and Correlation with Reported COVID-19 Prevalence in the Early Stage of the Epidemic in The Netherlands. Environmental science & technology letters. 2020;7(7):511-6.
5. Ahmed W, Angel N, Edson J, Bibby K, Bivins A, O'Brien JW, et al. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of the کامل environment. 2020;728:138764.
6. Monteiro CP, Varela A, Pinto M, Neves J, Felisberto GM, Vaz C, et al. Effect of an aerobic training on magnesium, trace elements and antioxidant systems in a Down syndrome population. Magnesium research. 1997;10(1):65-71.
7. Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of applied microbiology. 2012;113(5):1014-26.
8. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 1990;28(3):495-503.
9. Adams NM, Bordelon H, Wang KK, Albert LE, Wright DW, Haselton FR. Comparison of three magnetic bead surface functionalities for RNA extraction and detection. ACS applied materials & interfaces. 2015;7(11):6062-9.
10. Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic acids research. 1980;8(19):4321-5.
11. Rattanamas K, Taesuji M, Kulthonggate U, Jantafong T, Mamom T, Ruenphet S. Sensitivity of RNA viral nucleic acid-based detection of avian influenza virus, Newcastle disease virus, and African horse sickness virus on flinders technology associates card using conventional reverse-transcription polymerase chain reaction. Veterinary world. 2022;15(11):2754-9.
12. Wei M, Yuan J, Liu Y, Fu T, Yu X, Zhang ZJ. Novel Coronavirus Infection in Hospitalized Infants Under 1 Year of Age in China. Jama. 2020;323(13):1313-4.
13. Kiss T, Karácsony Z, Gomba-Tóth A, Szabadi KL, Spitzmüller Z, Hegyi-Kaló J, et al. A modified CTAB method for the extraction of high-quality RNA from mono-and dicotyledonous plants rich in secondary metabolites. Plant Methods. 2024;20(1):62.
14. Ali N, Rampazzo RCP, Costa ADT, Krieger MA. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed research international. 2017;2017:9306564.