بهینه‌سازی استخراج RNA از نمونه‌های مدفوع با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده: ارزیابی و مقایسه با کیت تجاری

محورهای موضوعی :

حنان خدائی ¹ , لیلا عظیمی ^{2 *} , عباس اخوان سپهی ³ , فاطمه اشرفی ⁴ , مریم رجب نژاد ⁵

1 -
2 - 1. Pediatric Infections Research Center (PIRC), Research Institute for Children's Health (RICH), Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
3 - عضو هیات علمی دامشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال
4 - 1) گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران
5 - مرکز تحقیقات عفونی اطفال، پژوهشکده سلامت کودکان، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

تاریخ دریافت : 1404/07/18 تاریخ پذیرش : 1404/07/18 تاریخ انتشار : 1404/07/18

کلید واژه:

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: استخراج RNA از نمونه‌های مدفوع به دلیل وجود مهارکننده‌ها و پیچیدگی‌های ترکیب شیمیایی مدفوع، یک چالش عمده در تشخیص مولکولی عوامل بیماری‌زای دستگاه گوارش به شمار می‌رود. هدف این مطالعه، طراحی و بهینه‌سازی یک بافر لیز کارآمد برای استخراج RNA کامل از نمونه‌های مدفوع و مقایسه عملکرد آن با کیت تجاری می باشد. مواد و روش‌ها: نمونه‌های مدفوع از بیماران بستری در بخش‌های مختلف بیمارستان کودکان مفید جمع‌آوری شد. بافر لیز بر اساس ترکیبات گوانیدینیوم تیوسیانات، Tris-HCl، EDTA و CTAB تهیه گردید. شرایط استخراج شامل تغییر در مقادیر بافر لیز، پروتئیناز K و حامل RNA در سه حالت مختلف بررسی شد. کیفیت RNA استخراج‌شده با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده و استفاده از ستون های استخراج سیلیکونی، با استفاده از دستگاه Qubit وتکنیک Real-Time PCR با کیفیت RNA استخراج ‌شده با استفاده از کیت تجاری بر پایه بید مغناطیسی، مورد مقایسه قرار گرفت. به منظور انجام Real-Time PCR از ژن کنترل داخلی RNase P ، ژن‌های ویروسی E و S ویروس SARS - CoV-2 استفاده گردید. یافته‌ها: حالت بهینه استخراج در ترکیب 600 میکرولیتر بافر لیز طراحی شده، 20 میکرولیتر حامل RNA و 60 میکرولیتر پروتئیناز K به دست آمد. در این شرایط، میانگین مقادیر Ct برای ژن‌های RNase P، S و E کمتر از کیت تجاری بود و غلظت RNA نیز بالاتر اندازه‌گیری شد. نتیجه‌گیری: روش استخراج با استفاده از بافر لیز طراحی‌شده، کارایی بالاتری نسبت به کیت تجاری در استخراج RNA از نمونه‌های مدفوع داشت و می‌تواند به عنوان جایگزین مقرون به صرفه در تشخیص مولکولی به کار رود. کلمات کلیدی: استخراج RNA، نمونه مدفوع، SARS-CoV-2، بافر لیز