بررسی سمیت سیانوباکتری آنابنای جدا شده از تالاب بندر انزلی

محورهای موضوعی :

سهیلا افشاری آزاد ^{1 *} , فرزانه حسینی ² , عباس اخوان سپهی ³

1 -
2 - گروه میکروب شناسی دانشکده علوم زیستی تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - عضو هیات علمی دامشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال

تاریخ دریافت : 1404/07/18 تاریخ پذیرش : 1404/07/18 تاریخ انتشار : 1404/07/18

کلید واژه:

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: سیانوباکتری‌ها گروه میکروارگانیسمی غنی از متابولیت‌های زیستی به شمار می‌آیند و توانایی تولید ترکیبات بیواکتیو ضد‌باکتریایی، ضد قارچی، ضد‌ویروسی، ضد‌سرطان، جلبک کش و ایمونوساپرسیو را دارند. در مطالعه‌ی حاضر سنجش سمیت سیانوباکتریآنابنا واریابیلیس جدا شده از منطقه سرخانکل بر روی موش‌های نر سوری انجام گرفت. مواد و روش ها: در این تحقیق سیانوباکتری آنابنا از منطقه سرخانکل در قسمت مرکزی تالاب بندر انزلی جداسازی و شناسایی با استفاده آنالیز ملکولی SrRNA 16صورت گرفت. برای تعیین سمیت حاد، 30 سر موش سوری نر به ۶ گروه ۵ تایی تقسیم شدند، گروه ابتدایی به عنوان گروه شاهد قرار گرفتند و گروه‌های اول تا پنجم دوزهای ۵۰۰ ، ۷۰۰ و ۱۰۰۰و۱۳۰۰ و ۲۰۰۰ میلی‌گرم از پودر سیانوباکتری را به صورت تزریق داخل صفاقی و به شکل محلول در نرمال سالین، به ازای هر کیلوگرم وزن بدن، به میزان ۵/۰ میلی‌لیتر دریافت کردند، گروه شاهد ۵/۰ میلی‌لیتر نرمال سالین ۹% به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند. یافته ها: در گروه های شاهد، اول،دوم و سوم پس از تزریق مرگ مشاهده نشد، اما درگروه چهارم پس از تزریق آثار عدم تحرک مشاهده شد و ۳ عدد از موش‌های این گروه از بین رفتند، در گروه پنجم پس از تزریق آثار عدم تحرک و بی‌حالی مشاهده شد، تمام موش‌های این گروه از بین رفتند. در بررسی‌های آسیب شناسی بافتی در موش‌های گروه اول بافت کبد بزرگتر از میزان نرمال، افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده شد، در گروه دوم بافت کبد از میزان نرمال بزرگتر و دژنره ، اتساع سینوزوئیدها و دژنراتیو نکروز سلول‌ها مشاهده شد، در گروه سوم بافت کبد سگمنته، کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌ آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد و در گروه چهارم و پنجم بافت کبد بزرگ، دژنره و سگمنته، کانونی از تجمع سلول‌ها و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد. نتیجه گیری: سم موجود در این سیانوباکتری از نوع هپاتوتوکسین می‌باشد، میزان LD50، ۱۲۵۰میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تعیین شد. کلمات کلیدی: آنابنا واریابیلیس ، آسیب شناسی بافتی، هپاتوتوکسین، کبد، LD50 ، موش نر

متن کامل:



فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی

 

بررسی سمیت سیانوباکتری آنابنای جدا شده از تالاب بندر انزلی

سهیلا افشاری آزاد1* ، فرزانه حسینی2، عباس اخوان سپهی3

1. استادیار، گروه میکروب شناسی دانشکده علوم زیستی تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2. دانشیار، گروه میکروب شناسی دانشکده علوم زیستی تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3. استاد ، گروه میکروب شناسی دانشکده علوم زیستی تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

چکیده

سابقه و هدف: سیانوباکتری‌ها گروه میکروارگانیسمی غنی از متابولیت‌های زیستی به شمار می‌آیند و توانایی تولید ترکیبات بیواکتیو ضد‌باکتریایی، ضد قارچی، ضد‌ویروسی، ضد‌سرطان، جلبک کش و ایمونوساپرسیو را دارند. در مطالعه‌ی حاضر سنجش سمیت سیانوباکتریآنابنا واریابیلیس  جدا شده از منطقه سرخانکل بر روی موش‌های نر سوری انجام گرفت.

مواد و روش ها: در این تحقیق سیانوباکتری آنابنا از منطقه سرخانکل در قسمت مرکزی تالاب بندر انزلی جداسازی و شناسایی با استفاده آنالیز ملکولی SrRNA 16صورت گرفت. برای تعیین سمیت حاد، 30 سر موش سوری نر به ۶ گروه ۵ تایی تقسیم شدند، گروه ابتدایی به عنوان گروه شاهد قرار گرفتند و گروه‌های اول تا پنجم دوزهای  ۵۰۰ ،  ۷۰۰ و ۱۰۰۰و۱۳۰۰ و ۲۰۰۰ میلی‌گرم از پودر سیانوباکتری را به صورت تزریق داخل صفاقی و به شکل محلول در نرمال سالین، به ازای هر کیلوگرم وزن بدن،  به میزان  ۵/۰ میلی‌لیتر دریافت کردند، گروه شاهد  ۵/۰ میلی‌لیتر نرمال سالین ۹% به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند.

یافته ها: در گروه های شاهد، اول،دوم و سوم پس از تزریق مرگ مشاهده نشد، اما درگروه چهارم پس از تزریق آثار عدم تحرک مشاهده شد و ۳ عدد از موش‌های این گروه از بین رفتند، در گروه پنجم پس از تزریق آثار عدم تحرک و بی‌حالی مشاهده شد، تمام موش‌های این گروه از بین رفتند. در بررسی‌های آسیب شناسی بافتی در موش‌های گروه اول بافت کبد بزرگتر از میزان نرمال، افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده شد، در گروه دوم بافت کبد از میزان نرمال بزرگتر و دژنره ، اتساع سینوزوئیدها و دژنراتیو نکروز سلول‌ها مشاهده شد، در گروه سوم بافت کبد سگمنته، کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌ آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد و در گروه چهارم و پنجم بافت کبد بزرگ، دژنره و سگمنته، کانونی از تجمع سلول‌ها و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد.

نتیجه گیری: سم موجود در این سیانوباکتری از نوع هپاتوتوکسین می‌باشد، میزان LD50، ۱۲۵۰میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تعیین شد.

کلمات کلیدی: آنابنا واریابیلیس ، آسیب شناسی بافتی، هپاتوتوکسین، کبد، LD50 ، موش نر

 

 

 

 

Toxicity measurement of Anabaena isolated from Anzali wetland

 

Soheila AfshariAzad1*, Farzaneh Hosseini2, AbbasAkhavansepahi3

1.       Department of Microbiology, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran. Iran     

2.       Department of Microbiology, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran. Iran

3.       Department of Microbiology, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran. Iran

 

Abstract

Background: Cyanobacteria are one of the most diverse prokaryotic groups that are widely spread around the world. These microorganisms possess special metabolic pathways which make them suitable in various aspects such as having access to new compounds with various applications in pharmaceutical industry, conducting of scientific research, producing food for humans and livestock, and having other aquaculture strengthens.

Materials and Methods: For the purpose of this study, the Cyanobacteria Anabaena were separated and purified from Sorkhankol area in the central part of Anzali wetland. Valid keys and 16srRNA molecular analysis were carried out as part of the diagnosis process. The toxicity examination of the isolated cyanobacteria was conducted on 30 male mice which were divided randomly into 6 groups. The first group of mice, considered as the control group, received 0.5 ml saline solution, while the other group, considered as the experimental group, received Anabaena extract with dosages of 500, 700, 1000, 1300, and 2000 mg/ kg. The extract was dissolved in saline solution at a rate of 0.5 ml and intraperitoneally injected to the mice in the experimental group.

Result: The results obtained from histopathological examination of liver revealed that Anabaena toxin is hepatotoxin and its symptoms include; increased hepatocellular polymorphism, vesicular hepatocytes, sinusoid dilatation, degenerative cell necrosis, focal accumulation of cells, mononuclear inflammatory, and irregular hepatic plates.

Conclusion: This result show that Amount of LD50 determined 1250 mg/kg.

Key word: Anabaena, histopathologic,hepatotoxin, liver, LD50 , male mice

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

 

سیانوباکتریهای آبزی  قادر به سنتز متابولیت های متنوع فعال ثانویه هستند(1). این میکروارگانیسمها به عنوان یکی از مهمترین و قدیمی ترین موجودات پروکاریوتی شناخته شده در زمین به شمار می آیند(2). فعالیت این ترکیبات با آنچه در ویروسها، باکتریها، قارچها و سایر گونه های جلبکی مشاهده میشود متفاوت است.(3،4،5،6). به همین دلیل، سیانوباکتریها پتانسیل زیادی برای تولید داروهای جدید، ساختارهای تازه و متابولیت های دارای فعالیت زیستی دارند(7). این میکروارگانیسمها متابولیت های اولیه یا ثانویه ای تولید میکنند که به عنوان ترکیبات زیست فعال میتوانند در صنعت استفاده شوند(8). سیانوتوکسین ها میتوانند حیوانات و انسانها را از طریق تماس با آب (حاوی شکوفایی جلبکی) مسموم کنند. همچنین ممکن است باعث مسمومیت غیرمستقیم از طریق مصرف غذای آلوده شوند(9،10). مرگ‌ومیر حیات وحش در پستانداران خشکی‌زی نیزمی تواند تحت تأثیر سموم سیانوباکتریایی قرار می‌گیرد که قادرند در اکوسیستم تجمع پیدا کنند. از جمله سیانوباکتریهای مولد سیانوتوکسین‌ها می‌توان به میکروسیستیس آئروژینوزا، آفانیزومنون فلوس آکوآ، پلنکتوتریکس آگاردی ای، لینگبیا، نودولاریا، آنابنا و اوسیلاتوریا اشاره کرد(11،12،13). سمیت سیانوباکتری‌ها را می‌توان با روش‌های مختلفی تعیین کرد. یکی از این روش‌ها، اندازه‌گیری سطح سمیت در موش‌هاست. معمولاً برای ارزیابی سمیت سیانوباکتری‌ها از موش‌های نرسوری به‌عنوان حیوان آزمایشگاهی استفاده می‌شود. در این روش، سلول‌های سیانوباکتری به محلول نمکی اضافه و به صورت داخل صفاقی تزریق می‌شوند. پس از ۲۴ ساعت مشاهده موش‌ها، آن‌ها تشریح شده و بافت‌های آسیب‌دیده برای تحلیل نتایج بررسی می‌شوند(14،15).

 

مواد و روش‌ها

نویسنده مسئول: استادیار، گروه میکروب شناسی دانشکده علوم زیستی تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران آدرس الکترونیک: [e-mail] تاریخ دریافت مقاله: 15/01/1404 تاریخ پذیرش: 17/05/1404

نمونه آب از منطقه سرخانکل تالاب انزلی برداشت شد. جهت جداسازی سیانوباکتریهای دریایی، حجم ۵۰۰ میلی لیتر نمونه آب از صافی میلی پور با قطر منافذ ۴۵/۰میکرون عبور داده شد. سپس کاغذ صافی به ارلن حاوی  ۵۰۰ میلی لیتر از محیط کشت BG11 انتقال داده شد (Merck Co Germany) (16،17). نمونه‌ها در دمای ۲۵درجه سانتیگراد به عنوان دمای بهینه رشد، شدت نور ۲۵۰۰ لوکس با تناوب نوری ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی وpH  معادل 5/7 قرار گرفتند. به منظور هوادهی محیط کشت مایع از شیکر با دورrpm ۱۵۰ و پمپ های هوا استفاده شد (18). آزمون رقتهای سریالی انجام شد. سپس  محیط کشت BG11 جامد ساخته شد و سپس آنتی‌‌بیوتیک نيستاتين به منظور حذف آلودگی‌های قارچی و نيز آنتی‌‌بیوتیک سيكلوهگزاميد براي حذف آلودگی‌های باکتریایی به محیط کشت اضافه شدند. درون ۱۰ پلیت استریل ۱ میلی‌لیتر از هرکدام از رقت‌‌‌های مربوطه ریخته و به هرکدام ۱۵میلی‌‌لیتر محیط کشت BG11 به پلیت‌‌‌ها اضافه شد و سپس پلیت‌‌‌‌ها با حرکت دورانی تکان داده شد و در حالت ساکن قرار داده شدند تا خنک شده و سپس در دمای ۲۵درجه سانتی‌‌گراد و تناوب نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی و شدت نوری ۲۵۰۰ لوکس قرار‌گرفتند(19). شناسایی سیانوباکتری با استفاده از کلیدهای معتبر و آنالیز ملکولی SrRNA 16 و ويژگيهاي مورفولوژي يا ظاهري آن انجام شد(20،21).  بعد از رشد سیانوباکترها در محیط کشت BG11 ، برای مشاهده مستقیم سیانوباکتر‌ی‌ها‌ی رشد کرده درون ارلن‌ها، لام تهیه گردید و با روش رنگ آمیزی ساده رنگ شدند و در زیر میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی ۱۰۰X بررسی شدند. آنالیز مولکولی با روش Marmur انجام شد(22).

واکنش PCR با استفاده ازپرایمرهای اختصاصی CYAN738 و CAYN1281R برای سیانو باکتری‌ها انجام شد.

Primer Name	Sequence 5 to 3
CYAN738F	ATACCCCWGTAGTCCTAGC
CYAN1281R	GCAATTACTAGCGATTCCTCC

 

 

به منظور لیوفیلیزه کردن توده سیانوباکتریایی به توده سیانوباکتری کشت‌‌شده گلوتامات سدیم افزوده شد، سپس به دستگاه افزوده شد و منجمد شد و سپس در خلا و در فشار پایین خشک شد، در این مرحله توده سیانوباکتریایی به حالت پودری یکنواخت درآمد.

برای آزمون سنجش حساسیت 30 سر از موش هاي نر نژاد سوري سفيد با وزن تقريبي ۲۵ گرم از خانه حيوانات دانشگاه علوم پزشکی ایران تهيه شدند، به ۶ گروه ۵ تایی تقسیم شدند، گروه ابتدایی به عنوان گروه شاهد قرار گرفتند و گروه‌های اول،دوم، سوم و چهارم و پنجم دوزهای ۵۰۰ ، ۷۰۰ و ۱۰۰۰و۱۳۰۰ و ۲۰۰۰ میلی‌گرم از پودر سیانوباکتری (تولید شده توسط عمل لیوفیلیزاسیون) را به صورت تزریق داخل صفاقی و به شکل محلول در نرمال سالین، به ازای هر کیلوگرم وزن بدن، به میزان ۵/۰ میلی‌لیتر دریافت کردند، گروه شاهد ۵/۰ میلی‌لیتر نرمال سالین ۹% به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند، موش‌ها پس از تزریق تا پایان ۲۴ ساعت از لحاظ رفتاری، میزان مصرف آب و مرگ تحت مراقبت قرار گرفتند (23). موش‌ها با قطع نخاع بی‌درد کشته شدند و کبد آن‌ها برای بررسی بافت‌شناسی جدا شد. نمونه‌ها در فرمالین ۱۰٪ ثابت شدند و سپس آبگیری، شفاف‌سازی با زایلن، قالب‌گیری با پارافین، برش‌گیری و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین انجام شد.

برای مشخص شدن میزان تلفات بین گروه های مختلف با توجه به دوز دریافتی از آزمون دقیق فیشر استفاده شد.

 

یافته ها

                                                        

                                                                                  هتروسیست

                                                                                                       آکینت تخم مرغی شکل

شکل1. تصویر میکروسکوپی سیانوباکتری: ویژگی‌های  میکروسکوپی سیانوباکتری آنابنا: سلول‌های رویشی مانند دانه‌های تسبیح به دنبال هم قرار گرفتند، آکینت‌ تخم‌مرغی و هتروسیست در لا‌به‌لای سلول‌های رویشی قرار گرفتند،تریکوم‌ها به صورت مارپیچ است.

 

نتایج حاصل از توالی خوانی ژن SrRNA 16 نشان دادند سویه مذکور با ۵۳۴ نوکلئوتید به میزان ۱۰۰% با سویه آنابنا واریابیلیس  قرابت فیلوژنی دارد(24،25).

CCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACAT GTCGCGAATCTTCTTGAAAGGGAAGAGTGCCTTAGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATG GCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG                 TTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACA ATGCTACGGACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGCAAGCAAATCCCGTAAACCGTAGCTC AGTTCAGATCGCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGGAGG

۵۳۴ نوکلئوتید توالی‌یابی شده از ژن  16SrRNA(توالی ‌یابی بر اساس روش sanger انجام گرفت)

 

 

نتایج حاصل از بررسی‌های سنجش سمیت نشان داد، .در گروه شاهد(گروه شاهد فقط سرم فیزیولوژی دریافت کردند و دریافت نکردند) و گروه‌های اول(با میزان دوز دریافتی ۵۰۰ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) و دوم(با میزان دوز دریافتی ۷۰۰ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) و سوم(با میزان دوز دریافتی ۱۰۰۰ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) پس از تزریق و آنابنا واریابیلیس هیچ‌گونه مرگ ومیری مشاهده نشد(در این گروه‌های تیماری فقط آثار هیستوپاتولوژیکی بافت کبدی مشاهده شد)، اما درگروه چهارم با میزان دوز دریافتی ۱۳۰۰ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) پس از تزریق آنابنا واریابیلیس ابتدا آثار عدم تحرک مشاهده شد و در عرض ۲۴ ساعت ۳ عدد از موش‌های این گروه از بین رفتند، در گروه پنجم(با میزان دوز دریافتی ۲۰۰۰ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) پس از تزریق آنابنا واریابیلیس  ابتدا آثار عدم تحرک و بی‌حالی مشاهده شد و در عرض ۲۴ ساعت تمام موش‌های این گروه از بین رفتند.

علائم آسیب شناسی بافتی در موش‌های گروه آزمایش:

 علائم در موش‌های گروه شاهد : اندازه کبد طبیعی و شکل آن نرمال است، هپاتوسیت‌های طبیعی مشاهده شدند.

علائم در موش‌های گروه اول: بافت کبد بزرگتر از میزان نرمال است، افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده شد.

علائم در موش‌های گروه دوم: بافت کبد از میزان نرمال بزرگتر و دژنره است، اتساع سینوزوئیدها و دژنراتیو نکروز سلول‌ها مشاهده شد.

علائم در موش‌های گروه سوم: بافت کبد سگمنته شده است، کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌های آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد.

علائم در موش‌های گروه چهارم  و پنجم: بافت کبد بزرگ، دژنره و سگمنته شده است، کانونی از تجمع سلول‌ها و صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد.

 

 

جدول 1. نتایج سنجش سمیت

گروه	دوز دریافتی بر حسب میلی‌گرم	تعداد تلفات	درصد وزن کبد به وزن بدن	علائم ماکروسکوپی	علائم میکروسکوپی
شاهد	سرم فیزیولوژی	-	۰۷/۰	اندازه کبد طبیعی و شکل آن نرمال است	هپاتوسیت‌های طبیعی
اول	۵۰۰	-	۰۸/۰	بافت کبد بزرگتر از میزان نرمال	افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها
دوم	۷۰۰	-	۱/۰	بافت کبد از میزان نرمال بزرگتر و دژنره است	اتساع سینوزوئیدها، دژنراتیو نکروز سلول‌ها
سوم	۱۰۰۰	-	۱۲/۰	بافت کبد سگمنته شده است	کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌های آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال، صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها
پنجم	۲۰۰۰	۵ عدد	۱۷/۰	بافت کبد بزرگ، دژنره و سگمنته شده است	کانونی از تجمع سلول‌ها، صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها

 

                                                          

                                                   تصویر مربوط به بافت کبد در موش‌های گروه شاهد

                                                   اندازه کبد طبیعی و شکل آن نرمال است

 

                                                    

الف)

                                             

ج)                                           ب)

                                                     شکل 2. نتایج آسیب شناسی بافتی

الف)  تصویر مربوط به بافت کبد در موش‌های گروه اول (بافت کبد بزرگتر از میزان نرمال است)

ب)  تصویر مربوط به بافت کبد در موش‌های گروه دوم (بافت کبد از میزان نرمال بزرگتر و دژنره است)

ج)  تصویر مربوط به بافت کبد در موش‌های گروه سوم (بافت کبد سگمنته شده است)

آسيب هاي بافت كبد در گروه هاي تحت مطالعه بصورت تصادفي انتخاب شدند و مورد بررسي قرار گرفتند.

شکل 3. رنگ آمیزی برش‌های تهیه شده از بافت کبد موش‌های مورد آزمایش

 

                                        

             تصویر مربوط به برش بافت کبد در موش‌های گروه شاهد: هپاتوسیت‌های طبیعی در شکل مشاهده می‌شوند

                                     

                                    تصویر مربوط به برش بافت کبد در موش‌های گروه اول:

v       افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم

v       وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها

 

                                    

                                  تصویر مربوط به برش بافت کبد در موش‌های گروه دوم:

v       اتساع سینوزوئیدها

v       دژنراتیو نکروز سلول‌ها

                                 

                                تصویر مربوط به برش بافت کبد در موش‌های گروه سوم:

v       کانونی از تجمع سلول‌ها

v       تراوش‌های آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال

v       صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها

 

 

میزانLD50  سیانوباکتری آنابنا واریابیلیس در تزریق داخل صفاقی موش پس از ۲۴ ساعت ۱۲۵۰میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن به دست آمد.

 

 

شکل4. میزانLD50  سیانوباکتری آنابنا واریابیلیس بر موش‌های سوری نر: میزانLD50   در تزریق داخل صفاقی

 

با توجه به جدول2، تفاوت آماری معناداری در میزان تلفات با توجه به میزان دوز دریافتی وجود دارد (0001/0p<). برای مشخص شدن تفاوت بین سطوح مختلف دوز دریافتی، دوزهای مختلف دو به دو با هم مقایسه شدند و آشکار گردید میزان تلفات در دوز ۲۰۰۰ به صورت معناداری بیشتر از دوزهای ۱۰۰۰و کمتر است (014/0p˂). تفاوت آماری معناداری در میزان تلفات دوز ۱۳۰۰ با دوزهای ۱۰۰۰و کمتر همچنین دوز ۲۰۰۰ مشاهده نشد (167/0p˂).

 

جدول 2. مقایسه میزان تلفات موش‌ها با توجه به میزان دوز دریافتی

گروه	تلفات ندارد		تلفات دارد		آزمون دقیق فیشر P-value
	تعداد	درصد	تعداد	درصد
شاهد	۵	۱۰۰	۰	۰	0001/0<
۵۰۰	۵	۱۰۰	۰	۰
۷۰۰	۵	۱۰۰	۰	۰
۱۰۰۰	۵	۱۰۰	۰	۰
۱۳۰۰	۲	۴۰	۳	۶۰
۲۰۰۰	۰	۰	۵	۱۰۰

 

 

نتیجه گیری

 

سیانوباکتری‌ها هنوز به طور کامل در زمینه ی فعالیت های ضد قارچی مورد مطالعه قرار نگرفته اند و مطالعات کمی در این خصوص انجام گرفته است، با توجه به فراوانی و اهمیت سیانوباکتر‌ی‌ها در میکروفلور تالاب های استان گیلان در این بررسی سیانوباکتری جنس آنابنا، بومی تالاب‌های گیلان جداسازی شد. در مطالعه‌ی انجام شده سیانوباکتری آنابنا از منطقه سرخانکل در قسمت مرکزی تالاب بندر انزلی تا عمق ۵۰ سانتی‌متری جداسازی شد، قاسمی و همکاران نیز در سال ۲۰۰۳ به منظور جداسازی سیانوباکتری‌ها از مناطق ساحلی دریای خزر نمونه‌برداری نمودند و این مناطق را مناسب تر از نواحی دور از ساحل اعلام نمودند(2). در این پژوهش جهت ازدیاد و رشد سیانوباکتری‌ها از محیط BG11 استفاده شد، اولین بار Stanier و همکاران در سال ۱۹۷۱ از این محیط برای کشت سیانوباکتری‌ها استفاده نمودند و از آن به بعد این محیط کشت بعنوان محیط مغذی جهت رشد و جداسازی سیانوباکتری‌ها معرفی و به کار گرفته شد(16). در پژوهش حاضر سیانوباکتری موجود در نمونه با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر و آنالیز ملکولی SrRNA 16 تا سطح جنس و گونه انجام شد، نتایج حاصل از توالی خوانی ژن  SrRNA 16نشان دادند سویه مذکور با ۵۳۴ نوکلئوتید به میزان ۱۰۰% با سویه آنابنا واریابیلیس قرابت فیلوژنی دارد. William و همکاران در سال ۲۰۰۶ بیان داشتند ترکیبی از روش‌های شناسایی بر مبنای خصوصیات ظاهری و روش‌های ملکولی بسیار مناسب می‌باشد، در همین راستا آنها اظهار داشتند اطلاعات ملکولی در سال‌های اخیر اعتبار برخی از جنس‌های سیانوباکتریایی نظیر سودوآنابنا، اسپیرولینا، میکروسیستیس و پلنکتوتریکس را ثابت می‌نماید(26)، درحالیکه Hongmei و همکاران در سال ۲۰۰۵ اظهار داشتند استفاده از اطلاعات ملکولی SrRNA 16 ناسازگاری بین اطلاعات مورفولوژیکی و ملکولی ایجاد می‌نماید(27). در مطالعه‌ی حاضر سنجش سمیت آنابنا واریابیلیس جدا شده از منطقه سرخانکل بر روی موش‌های نر سوری انجام گرفت، بیشترین میزان مرگ ومیر مربوط به دوز دریافتی ۲۰۰۰ میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن به‌دست آمد. تفاوت آماری معناداری در میزان تلفات با توجه به میزان دوز دریافتی وجود دارد (0001/0p<). نتایج حاصل نشان داد سم موجود در این سیانوباکتری از نوع هپاتوتوکسین می‌باشد، آسيب هاي بافت كبد در گروه هاي تیمار مورد بررسي قرار گرفتند، علائم شامل: افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها، اتساع سینوزوئیدها، دژنراتیو نکروز سلول‌ها، کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌های آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال، صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد.

تحقیقات Sivonen   در سال ۱۹۹۶ همسو با پژوهش حاضر بود، او بیان نمود سیانوباکتری ‌های جدا شده از دریاچه Ladoga  حاوی میکروسیستین با میزان سمیت بالای ۵۰ میکروگرم بر کیلوگرم هستند، همچنین او اظهار داشت اغلب میکروسیستین‌ها از نواحی کم‌عمق یوتروفیک قسمت جنوبی دریاچه جدا شده‌اند(28). در پژوهشی مشابه Abdel-raouf و Ibraheem در سال ۲۰۰۷ نشان دادن عصاره دی‌اتیل‌استات سیانوباکتری آنابنا واریابیلیس جدا شده از بیابان Koom Osheema در اطراف شهر El-Fayoum  دارای اثرات نوروتوکسیک بوده و LD50 آن ۶۷/۲۶۴ میلی‌گرم بر کیلوگرم می‌باشد(29). نتیجه پژوهش حاضر نشان داد میزان آنابنا واریابیلیس LD50 ۱۲۵۰ میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تعیین شد  که با توجه به نتایج Lawton  و همکاران غیر سمی تلقی می‌شود، Lawton  و همکاران در سال ۱۹۹۴ بیان داشتند میزان LD50 سموم سیانوباکتری به شکل زیر طبقه‌بندی می‌شود(30):

بیشتر از ۱۰۰۰ : غیر سمی

۱۰۰۰-۵۰۰: سمیت کم

۵۰۰-۱۰۰: سمیت متوسط

کمتر از ۱۰۰: سمیت بالا

نتایج حاصل از بررسی‌های هیستوپاتولوژیک نشان داد سم موجود در این سیانوباکتری از نوع هپاتوتوکسین می‌باشد، علائم شامل: افزایش هپاتوسیت‌های پلی‌مورفیسم، وزیکولار شدن هپاتوسیت‌ها، اتساع سینوزوئیدها، دژنراتیو نکروز سلول‌ها، کانونی از تجمع سلول‌ها، تراوش‌های آماسی تک‌هسته‌ای در فضای پورتال، صفحات نامنظم هپاتوسیت‌ها مشاهده شد. همچنین میزان LD50 ۱۲۵۰میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تعیین شد.

منابع

 

1.       Leflaive J, Ten-Hage L. Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters: a comparison of allelopathic compounds and toxins. Freshw Biol. 2007;52:199-214.

 

2.       Ghasemi Y, Tabatabaei Yazdi M, Shokravi S, Soltani N, Zarrini G. Antifungal and antibacterial activity of paddy-fields cyanobacteria from the north of Iran. J Sci Islam Repub Iran. 2003;14:203-9.

 

3.       Carmichael W. Cyanobacterial secondary metabolites – the cyanotoxins: a review. Freshw Biol. 1992;15:1453-63.

 

4.       Mundt S, Teuscher E. Blue–green algae as a source of pharmacologically active compounds. Pharmazie. 1988;43:809-15.

 

5.       Patterson GML, Larsen LK, Moore RE. Bioactive natural products from blue-green algae. J Appl Phycol. 1994;6(2):151-7.

 

6.       Skulberg OM. Microalgae as a source of bioactive molecules: experience from cyanophyte research. J Appl Phycol. 2000;12:341-8.

 

7.       Singh S, Bhushan K, Banerjee U. Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae: an overview. Crit Rev Biotechnol. 2005;25(3):73-95.

 

8.       Tuney I, Cadirci BH, Nal D, Sukatar A. Antimicrobial activities of the extracts of marine algae from the coast of Urla. Turk J Biol. 2006;30:171-5.

 

9.       Falconer IR, Bartram J, Chorus I, Goodman T, Utkilen H, Burch M, Codd GA. Safe levels and safe practices. In: Chorus I, Bartram J, editors. Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. London: E&FN Spon; 1999. p.155-78.

 

10.       Iochimeen EM, Carmichael WW, An JS, Cardo DM, Cookson ST, Jarvis WR. Liver failure and death after exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil. N Engl J Med. 1998;338:873-8.

 

11.       Banack SA, Johnson HE, Cheng R, Cox PA. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacteria. Mar Drugs. 2007;5:180-96.

 

12.       Hitzfeld BC, Höger SJ, Dietrich DR. Cyanobacterial toxins: removal during drinking water treatment and human risk assessment. Environ Health Perspect. 2000;108 Suppl 1:113-22.

 

13.       Rao PV, Gupta N, Bhaskar AS, Jayaraj R. Toxins and bioactive compounds of cyanobacteria (blue-green algae) from rice paddy fields and their differential susceptibility to ten fungicides used in Korea. J Microbiol Biotechnol. 2002;16(2):240-6.

 

14.       Mattsson C, Puu G. Toxiska blågröna alger. FOA Rapport. 1997;C40098-Cl:8.

 

15.       Willén T, Mattsson R. Water blooming and toxin producing cyanobacteria in Swedish fresh and brackish waters, 1981-1995. Hydrobiologia. 1997;353:181-92.

 

16.       Stanier RY, Kunisawa R, Mandel M, Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriol Rev. 1971;35:171-205.

 

17.       Summers ML, Wallis JG, Campbell EL, Meeks JC. Genetic evidence of a major role for glucose-6-phosphate dehydrogenase in nitrogen fixation and dark growth of the cyanobacterium Nostoc sp. strain ATCC 29133. J Bacteriol. 1995;177(21):6184-94.

 

18.       Hanan M, El-Kassas Y. Active substances from some blue-green algal species used as antimicrobial agents. Afr J Biotechnol. 2010;9(19):2789-800.

 

19.       Andersen RA. Algal culturing techniques. Amsterdam: Elsevier Academic Press; 2005. p.589.

 

20.       Desikachary TV. Cyanophyta. New Delhi: Indian Council of Agricultural Research; 1959. p.684.

 

21.       Prescott GW. Algae of the western Great Lakes area. Dubuque: W.C. Brown; 1962. p.977-85.

 

22.       Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J Mol Biol. 1961;3:208-18.

 

23.       Underdal B. Blågrønnalgetoksin – påvisning og eigenskapar. Vann (Norsk Vannforening). 1984:359-63.

 

24.       Altsch SF, Madden TL, Schaeffer AA, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402.

 

25.       Sivonen K. Cyanobacterial toxins and toxin production. Phycologia. 1996;35:12-24.

 

26.       Kim OS, Cho YJ, Lee K, Yoon SH, Kim M, Na H, Park SC, Jeon YS, Lee JH, Yi H, Won S, Chun J. Introducing EZTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol. 2012;62:716-21.

 

27.       Williame R, Boutte CH, Grubisic S, Wilmotte A, Komárek J, Hoffmann L. Morphological and molecular characterization of planktonic cyanobacteria from Belgium and Luxembourg. Appl Phycol. 2006;42:1312-22.

 

28.       Hongmei J, Aitchison JC, Lacap DC, Peerapornpisal Y, Sompong U, Pointing SB. Community phylogenetic analysis of moderately thermophilic cyanobacterial mats from China, the Philippines and Thailand. Extremophiles. 2005;9:325-32.

 

29.       Ibraheem IBM, Abdel-Raouf N. Allelopathic activity of some local cyanobacterial extra-metabolites against some pathogenic bacteria. Egypt J Phycol. 2007;8:120-9.

 

30.       Lawton LA, Beattie KA, Hawser SP, Campbell DL, Codd GA. Evaluation of assay methods for the determination of cyanobacterial hepatotoxicity. In: Codd GA, Jefferies TM, Keevil CW, Potter E, editors. Detection methods for cyanobacterial toxins. Cambridge: Royal Society of Chemistry; 1994. p.111-6.

 

2