جداسازی استافیلوکوکوس آرئوس کوآگولاز مثبت از گوشت و روده اردک‌های بومی اطراف تبریز

محورهای موضوعی : علوم و صنایع غذایی

افشین جوادی ¹ (- دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانشیار گروه بهداشت مواد غذایی، تبریز، ایران)
سیروس رفیعی اصل ² (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دکترای حرفه‌ایی دامپزشکی، تبریز، ایران)
فرهاد شاهیان ³ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دکترای حرفه‌ایی دامپزشکی، تبریز، ایران)
حامد قاضی هشترودی ⁴ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دکترای حرفه‌ایی دامپزشکی، تبریز، ایران)

تاریخ دریافت : 1391/03/28 تاریخ پذیرش : 1392/12/07 تاریخ انتشار : 1392/12/01

کلید واژه: PCR, گوشت, روده, استافیلوکوکوس آرئوس, اردک,

چکیده مقاله :

استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبتبه عنوان سومین عامل مهم بیماری‌های با منشأ مواد غذایی مطرح می‌باشد. این باکتری بر روی مواد غذایی پروتئینی و کربوهیدراتی رشد کرده و با تولید سم باعث ایجاد مسمومیت غذایی می‌شود. هدف از این مطالعه جداسازی، شناسایی و شمارش استافیلوکوکوس آرئوس در گوشت و محتویات روده‌ای اردک های بومی مناطق اطراف تبریز می‌باشد. برای این منظور، به طور تصادفی 35 قطعه اردک بومی از روستاهای اطراف تبریز خریداری و پس از کشتار مقدار 50 گرم از گوشت ران و 10 گرم از مدفوع نمونه برداری و مطابق با روش استاندارد ملی ایران مورد آزمایش قرار گرفتند. برای تأیید جدایه‌های استافیلوکوکوس آرئوس از تکنیک PCR استفاده گردید. نتایج نشان داد که 14/17% نمونه‌های گوشت و محتویات روده‌ای آلوده به استافیلوکوکوس آرئوس بودند. میانگین بار آلودگی استافیلوکوکوس آرئوس در گوشت و مدفوع به ترتیبCFU 87 وCFU 64 به ازای هر گرم برآورد گردید. به نظر می‌رسد آلودگی گوشت با استافیلوکوکوس آرئوسمی‌تواند از طریق دستکاری غیربهداشتی در حین کشتار و یا تماس لاشه‌ها با پوست و محتویات روده‌ صورت گرفته باشد.

چکیده انگلیسی:

Coagulase-positive Staphylococcus aureus is introduced as the third major source of animal origin food borne disease. This bacterium can proliferate and produce toxin in protein and carbohydrate foods leading to food-poisoning. The aim of this study was isolation, identification and enumerating of S. aureus in meat as well as intestinal contents of native duck around Tabriz area. For this purpose, a total number of 35 native ducks randomly was purchased in the nearby villages of Tabriz. Fifty g of thigh meat together with 10 g of intestinal content of each carcass were sampled and analyzed according to the ISIRI protocols. The isolates were confirmed by PCR technique. Results showed that 17.14% of meat and fecal samples were found contaminated with S. aureus. Mean values of S. aureus load in meat and feces were estimated at 87 CFU/g and 64 CFU/g, respectively. It was assumed that contamination of duck meat with S. aureus can be occurred through non-hygienic practices during slaughter as well as contamination with intestinal contents and/or skin of the carcass.

منابع و مأخذ:

مقدمه

   استافیلوکوک‌ها در میان باکتری های فاقد هاگ بسیار مقاوم‌اند (Bergdoll et al., 1989). استافیلو کوکوس آرئوس سابقـاً معیاری برای تعیین وضعیت میکروبی گوشت و محصولات طیور در جریان سلامت بهداشتی و خصوصیات محصولات انبار شده بوده و همچنین این باکتری در بین عوامل بیماری‌زای مهم، به دلیل افزایش روزافزون مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی مورد توجه بیشتری قرار گرفته است (Capita et al., 2002؛ پورمند، 1389).

   استافیلو کوکوس آرئوس به عنوان دومین و یا گاهی سومین علت مهم بیماری‌های مننتقله از راه غذا محسوب می‌شود، این باکتری نقش برجسته‌ای در ایجاد شایع‌ترین نوع مسمومیت‌های غذایی را دارد که در اثر مصرف انتروتوکسین تولید شده در مواد غذایی به وجود می‌آید (Adwan et al., 2005; Baeza et al., 2007; Robinson et al., 2000 ). بیماری‌های منتقله از راه غذا به عنوان معضل اصلی سلامت و بهداشت عمومی محسوب می‌شوند (اشراقی و همکاران، 1392).

   همچنین، بیشترین عامل مسمومیت غذایی، گوشت و گوشت طیور می‌باشد (Ralph and Cottie, 1998). که سالانه با صرف هزینه‌های بالا خسارات اقتصادی قابل ملاحظه‌ای ایجاد می‌کند و میلیون‌ها نفر از جمعیت جهان به آن مبتلا و بخشی نیز دچار مرگ و یا بستری در بیمارستان‌ها هستند (اشراقی و همکاران، 1392؛ شریفی و همکاران 1388). در آمریکا مسمومیت غذایی استافیلوکوکی یکی از مهمترین بیماری‌های اقتصادی بوده و سالانه 5/1میلیون دلار برای آن هزینه می‌شود (Robinson et al., 2000). انتروتوکسین‌ها و همچنین سم سندروم شوک توکسیک ((T.T.S از فاکتورهای مهم حدت این باکتری می‌باشند (Adesiyun et al., 1992؛ اشراقی و همکاران، 1392). مسمومیت غذایی در اثر خوردن یک میکروگرم از سموم آزاد شده در غذا توسط این باکتری ایجاد می‌شود (Young et al., 2007) که این سم هم مانند سم کلستردیوم بوتولینیوم و با سیلوس سرئوس خاصیت تهوع‌زایی دارد (Bergdollet al., 1989). گوشت یک ماده مغذی بوده که محیط مناسبی  برای رشد و تزاید میکروارگا نیسم‌های عامل فساد و پاتوژن‌های معمول منتقله از غذا را فراهم می‌کند (Barati et al., 2006).

   در سال 1960 ظهور سویه‌های استافیلو کوکوس آرئوس مقاوم به متی سیلین دیده شد (شریفی و همکاران، 1388) که وجود ژن mecA در این باکتری به عنوان عامل مقاومت در برابر آنتی بیوتیک بوده (کلالیان مقدم و همکاران، 2011Barati et al., 2006; ). انتقال سویه‌های مقاوم استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت از طریق مواد غذایی می‌تواند جایگزین میکروفلور حساس فردی شده و ایجاد بیماری‌های خطرناک نماید (Bania et al., 2006). آلودگی مواد غذایی می‌تواند به صورت مستقیم از طریق حیوانات آلوده به این باکتری و یا در نتیجه ی عدم رعایت بهداشت در مراحل تولید و توزیع و یا از طریق افراد شاغل در بخش مواد غذایی ایجاد شود (Robinson et al., 2000؛ سلطان دلال و همکاران، 1393).

   در غذاهایی که نیازمند دستکاری طولانی می‌باشند استافیلوکوکوس آرئوس قابل جداسازی بوده (اشراقی و همکاران، 1392) و لذا برای اطمینان بخشیدن به مواد غذایی و جلوگیری از مسمومیت استافیلوکوکی باید این محصولات را از آلودگی به استافیلوکوکوس آرئوس محافظت کرده و از ایجاد شرایطی که اجازه تکثیر به این باکتری را می‌دهند جلوگیری کرد. مثل پرداختن دقیق به بهداشت فردی، پاک‌سازی و عفونت‌زدایی وسایل و سطوح تماسی، نگه‌داری مواد غذایی در یخچال (در دمای 7 درجه سلسیوس و یا کمتر)، تغییر دادن فاکتورهای داخلی مثل pH، میزان آب فعال، غلظت نمک طعام، استفاده از پرتوی گاما، دودی کردن، تخمیرنمودن، خشک کردن و بسته‌بندی مواد غذایی ( Alonso et al., 2003-Calleja ).

   اساسی‌ترین نقش غذا کمک به حفظ سلامت و پایداری بدن است (Johnston et al., 1984). گوشت به عنوان یکی از منابع پرارزش پروتئین و به سبب غنی بودن از اسیدهای آمینه، مواد معدنی، انواع ویتامین‌ها و انرژی کافی در زمره بهترین و کامل‌ترین مواد غذایی طبقه‌بندی شده است. فلور میکروبی مولد فساد و آنزیم‌های موجود در غذا تاثیر منفی بر مدت زمان نگه‌داری مواد غذایی را دارند (Balog and Almeida Paz, 2007).

    لذا هدف این مطالعه جداسازی، تایید با تکنیک PCR و شمارش استافیلوکوکوس آرئوس در گوشت و محتویات روده اردک‌های بومی مناطق اطراف تبریز می‌باشد.

 

مواد و روش‌ها

   این مطالعه به صورت توصیفی مقطعی بوده و جامعه آماری آن اردک‌های بومی اطراف تبریز می‌باشد که به طور تصادفی 35 قطعه از روستاهای اطراف تبریز خریداری و سپس به روش دستی کشتار شدند. نمونه‌برداری به مقدار 50 گرم از گوشت و10 گرم از مدفوع انجام گرفته و این نمونه‌ها در ظروف استریل و تحت شرایط سرما به آزمایشگاه مواد غذایی ارسال و مطابق روش موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران(ISIRI)  به شماره 1194، اقدام به جداسازی  استافیلوکوکوس آرئوس و سپس شمارش‌شده و میزان بار میکروبی گوشت با روده مورد مقایسه قرار گرفت. در ادامه برای تایید جدایه‌ها با تکنیک PCR و استخراج DNA از نمونه‌های‌ 24 ساعته‌ کشت داده شده در محیط کشت BHI براث و لیز بافر با محتویات جدول 1 استفاده شد (Young et al., 2007).

 

 

جدول1- غلظت مواد تشکیل دهنده لیز بافر

Volume	Component
1ml 1ml 1ml 2ml 4.6ml	تریس 1 مولار با pH=7.5 کلرید سدیم 5 مولار EDTA 5/0 مولار C-TAB 2% آب مقطر

 

 

 

 

 

 

 

   واکنش زنجیره‌ای‌ پلی مراز در حجم 25 میکرولیتر، با اجزای جدول2 و با استفاده از پرایمر طراحی شده توسط نرم افزار الیگو به اندازه  bp1500 در سطح جنس برای ژن 16s rRNA برای جدایه‌ها‌ انجام گرفت که توالی پرایمر اختصاصی در جدول3 آورده شده است.برای تایید گونه نیز جدایه‌ها به شرکت سیناژن برای توالی یابی فرستاده شدند.

 

 

جدول2- غلظت اجزای تشکیل دهنده واکنشPCR

Volume	Component
13µl 10µl .5 µl 1 µl .5 µl	Master dH2o Forward/Reverse primer Template DNA 10X Buffer
25 µl	Total Volume

 

 

 

 

 

 

 

   واکنش زنجیرۀ پلیمرازی با چرخه‌های‌ واسرشته سازی اولیه در 95 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه با مرحله واسرشته سازی در 94 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 57 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، بسط در 72 درجه سلسیوس به مدت 2 دقیقه و نهایتاً یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد.

 

 

 

جدول3- پرایمر مورد استفاده در واکنش PCR

Sequence	Primer
F:5'- TTG CTT CTC TGA TGT TAG CG-3'	ST18F
R: 5'-AAT CAT TTG TCC CAC CTT CG-3'	ST18R

 

 

   برای آنالیز آماری داده‌های کمی نیز از نرم افزار SPSS, Ver. 16 و آزمون آماری t وابسته استفاده شد.

 

 یافته‌ها

   آزمون کشت و جداسازی میکروبی نشان داد که از 35 نمونه گوشت (14/17%)6 نمونه با میانگین شمارش  CFU/g 10×7/8 و از 35 نمونه روده نیز (14/17%)6 نمونه با میانگین شمارش CFU/g 10×4/6 به استافیلوکوکوس آرئوس آلوده بودند. در آنالیز آماری با استفاده از آزمون t وابسته با دامنه اطمینان 95% (در سطح 05/0=α) اختلاف معنی‌داری از نظر بار آلودگی در گوشت و روده اردک بومی دیده نشد (05/0

 

 

 

 

 

 

 

تصویر1- نوار تکثیر یافته DNA، سمت چپ مربوط به ایزوله‌های گوشت و سمت راست ایزوله‌های روده‌ای

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

   میزان آلودگی بار میکروبی درگوشت اردک، ناشی از آلودگی لاشه‌ها توسط خود روده‌ها، وسایل و لوازم کار آلوده، عدم ملاحظات بهداشتی و همچنین دستکاری‌های طولانی مدت طی کشتار می‌باشد که باعث کاهش کیفیت بهداشتی گوشت اردک شده و خطر جدی برای سلامت عمومی و ایمنی غذایی را به دنبال دارد. این باکتری در انسان باعث اختلالات گوارشی متعددی در تمام گروه‌های سنی می‌شود (رحیمی و همکاران، 1385). لذا شناخت منابع بالقوه این آلودگی در اپیدمیولوژی بیماری ضروری به نظر می‌رسد. نتایج متفاوتی در مورد جداسازی استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت صورت گرفته که نشانگر جداسازی این باکتری با فراوانی کمتر و در برخی موارد بیشتر از تحقیق حاضر می‌باشد.    

   سلطان دلال و همکاران در سال 1386 با مطالعه روی تهیه فرآورده‌های گوشتی نشان داد که فرآیند تولید و حمل آن، از جمله عوامل مسبب آلودگی گوشت محسوب می‌شوند. بافت‌های دست‌نخورده حیوانات استریل بوده اما زمانی که این حیوانات کشتار می‌شوند باکتری‌های موجود در پوست، روده و یا در هنگام تهیه شدن در محیط سبب آلودگی سطح گوشت خواهند شد، همچنین غذاهایی که در حین تهیه و فرآوری زمان بیشتری با دست تهیه‌کننده غذا ارتباط دارند، آلودگی معنی‌داری با استافیلوکوکوس آرئوس نسبت به سایرغذاها نشان می‌دهند.

   جوادی و همکاران در سال 1383 بر روی 30 نمونه گوشت طیور در کشتارگاه با استفاده ازسیستم  HACCP نشان دادند که آلودگی لاشه‌ها به استافیلوکوکوس آرئوس در قبل از شستن لاشه‌ها از 7/96%  به 3/73% در بعد از شستشوی لاشه‌ها رسیده است.

   سلطان دلال، صالحی پور و اشراقی نیز در سال 2010 از 1040 نمونه مواد غذایی مختلف که از نظر وجود استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت مورد بررسی و آنالیز قرار دادند، تعداد 100 نمونه (5/9%) استافیلوکوس آرئوس کواگولاز مثبت را جدا کردند که میزان آلودگی در مواد لبنی 1/17%، در گروه مواد گوشتی 5/3% و در سایر مواد غذایی 5/4% بوده است.

   همینطور، جلالی و همکاران در سال 1386 بر روی ارتقاع کیفیت میکروبی سالاد اولویه صنعتی در شهر اصفهان مطالعه کردند که از 146 نمونه گرفته شده در مرحله قبل از شستشو، حدود 24% از نظر حضور استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت بودند. آنان نشان دادند که نتایج حاصل از بهسازی در فرآیند تولید به طور معنی‌داری باعث از بین رفتن باکتری‌های بیماری‌زای غذایی گردیده و استفاده از مواد افزودنی طبیعی یا شیمیایی مجاز امکان تولید محصول بهداشتی را فراهم می‌آورد.

   رحیمی و همکاران در سال 1385 بر روی 100 نمونه فرآورده‌های گوشتی (سوسیس، کالباس و همبرگر) مطالعه‌ای انجام دادند که از این تعداد، حدود 68% به استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت آلوده بودند.

   در مطالعه‌ای که گوون و همکاران در سال 2003 طبق روش استاندارد ترکیه بر روی 49 نمونه گوشت غاز عرضه شده در شهر کارس انجام دادند، 5 نمونه (2/10%) از گوشت غازها آلوده به استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت گزارش نمودند (Guven et al., 2003).

   هانسون در سال 2001 از کشور سوئد اعلام کرد که 9 درصد گوشت گاوهای ذبح شده در کشتارگاه‌های‌ با ظرفیت بالا و 16 درصد گوشت گاوهای ذبح شده در کشتارگاه‌های‌ با ظرفیت پایین، آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس کوآگلاز مثبت شناسایی شدند (Hansson, 2001).

   آرول کومار و همکارانش از کشور هند در سال 2011 با استفاده از روش کشت مشخص نمودند که از 210 نمونه گوشت جمع آوری شده، 14 نمونه (6.67%) از نظر وجود استافیلوکوکوس آرئوس مثبت هستند. در این گزارش، شمارش کلنی‌های استافیلوکوکی1.03±0.08 LogCFU/g  بود (Arul kumar et al., 2011).

   با توجه به این که یکی از منابع عمده استافیلوکوکوس آرئوس کواکولاز مثبت، آب، خاک، محیط، دستگاه گوارش حیوانات و همچنین به عنوان فلور پوست و دستگاه تنفس انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشد لذا مرحله کشتار یکی از نقاط عمده ایجادکننده آلودگی به این باکتری در دام و پرندگان محسوب می‌شود.

   از سوی دیگر، نظر بر اینکه مواد خام اولیه آلوده  استافیلوکوکوس آرئوس می‌باشند لذا اگر پروسه تهیه غذا به طور مناسبی صورت نگیرد می‌تواند خطر ایجاد مسمومیت غذایی استافیلوکوکی را بویژه در عمل‌آوری طولانی مدت با دست افزایش دهد (Robinson et al., 2000). بنابر این توصیه می‌گردد برای جلوگیری از ابتلای انسان به مسمومیت با این باکتری، اقدامات بهداشتی کامل در تمامی مراحل تولید مواد غذایی به خصوص غذاهای با منشا دامی به عمل آید.