جداسازی، شناسایی و مقایسه اگزوزوم های استخراج شده از سلول های بنیادی عصبی و آستروسیت های مغز موش صحرایی و اهمیت پتانسیل درمانی آنها در بیماری¬های نورودژنراتیو
محورهای موضوعی : زیست شناسی سلولی تکوینی گیاهی و جانوری ، تکوین و تمایز ، زیست شناسی میکروارگانیسم
اعظم کریمی
1
,
الهام حویزی
2
*
,
لطف اله خواجه پور
3
,
زهره قطب الدین
4
1 - دانشجوی دکتری فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2 - استاد سلولی تکوین، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
3 - دانشیار فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
4 - دانشیار فیزیولوژی پزشکی، گروه فیزیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
کلید واژه: اگزوزوم, سلول های بنیادی عصبی, سلول های آستروسیت, موش صحرایی,
چکیده مقاله :
مقدمه: استفاده از اگزوزومها به عنوان رویکردی جدید بویژه برای درمان بیماری های مرتبط با سیستم عصبی بسیار مورد توجه است. نوآوری این مطالعه ارائه تحلیل مقایسه‌ای ویژگی‌های بیومولکولی و مورفولوژیک اگزوزومهای استخراج‌شده از سلولهای بنیادی عصبی (NSCs) و آستروسیت‌های مغز، که پیش‌تر در تحقیقات آزمایشگاهی به‌طور کامل مورد بررسی قرار نگرفته است، لذا هدف از این مطالعه استخراج اگزوزوم ها این سلول ها، شناسایی و مقایسه آنها جهت پیشبرد اهداف درمانی می باشد.
مواد و روشها: NSCs و آستروسیت ها از مغز نوزاد موش صحرایی استحصال شدند و مارکر های سطح آن ها به کمک ایمونوسیتوشیمی تایید شد. جداسازی اگزوزوم ها با استفاده از کیت آناسل انجام شد. جهت تایید اگزوزوم ها حضور CD مارکرها (CD9, CD63, CD81) با استفاده از وسترن بلات و تعیین غلظت اگزوزوم ها با استفاده از روش بردفورد انجام شد. بررسی های مورفولوژی و اندازه قطر اگزوزوم ها با استفاده از تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) و DLS انجام شد.
نتایج: ایمونوسیتوشیمی حضور مارکرهای Nestin، Tuj-1 و GFAP را نشان داد. غلظت اگزوزوم های استخراج شده به ترتیب در NSCs و آستروسیت ها معادل 52/330 و 19/454 میکروگرم/میلی لیتر بود. وسترن حضور مارکرهای CD9, CD63, CD81 را بر سطح اگزوزم های استخراج شده تایید کرد. میانگین قطر اگزوزوم های استخراج شده از NSCs و آستروسیت با استفاده از DLS، به ترتیب 45/50 و 61/38 نانومتر بود.
نتیجهگیری: این احتمال وجود دارد که اگزوزوم های استخراج شده از آستروسیت ها به سبب مقدار پروتئین بیشتر و اندازه کوچکتر نسبت به اگزوزوم های استخراج شده از NSCs توجه بیشتری را به عنوان یک رویکرد درمانی جدید در بیماریهای سیستم عصبی به خود جلب کنند. اگرچه مطالعات بیشتر برای تأیید و بررسی عملکرد بیولوژیکی و اثربخشی این اگزوزومها در فرآیندهای ترمیم عصبی پیشنهاد می شود.
Introduction: Exosomes are a new approach to treatment that is of great interest, especially for diseases related to the nervous system. The innovation of this study lies in providing a comparative analysis of the biomolecular and morphological properties of exosomes derived from neural stem cells (NSCs) and brain astrocytes, which have not been thoroughly investigated in previous laboratory research. This study aims to extract exosomes from this cells, identification, validate them, and compare them to advance therapeutic goals.
Materials and Methods: It seems that, probably NSCs and astrocytes were extracted from the brain of newborn rats and their surface markers were confirmed by immunocytochemistry. Exosomes were isolated using the Anacell kit. To confirm the presence of exosomes, the presence of CD markers (CD9, CD63, CD81) was confirmed by Western blotting and the concentration of exosomes was determined by the Bradford method. The morphology and diameter of exosomes were examined using transmission electron microscopy (TEM) and DLS.
Results: Immunocytochemistry showed the presence of Nestin, Tuj-1, and GFAP markers. The concentration of extracted exosomes in NSCs and astrocytes was 330.52 and 454.19 μg/ml, respectively. Western blot confirmed the presence of CD9, CD63, and CD81 markers on the surface of extracted exosomes. The average diameter of exosomes extracted from neural stem cells and astrocytes using DLS was 50.45 and 38.61 nm, respectively.
Conclusion: Astrocyte-derived exosomes will likely attract more attention as a novel therapeutic approach in nervous system diseases due to their higher protein content and smaller size than from NSCS-derived exosomes. However, further studies are suggested to confirm and investigate these exosomes' biological function and efficacy in neural repair processes.
1 Marei, H.E., et al., Human olfactory bulb neural stem cells expressing hNGF restore cognitive deficit in Alzheimer's disease rat model. Journal of cellular physiology, 2015. 230(1): p. 116-130.
2 Valenza, M., et al., Alternative targets to fight Alzheimer’s disease: focus on astrocytes. Biomolecules, 2021. 11(4): p. 600.
3 Upadhya, R., et al., Astrocyte-derived extracellular vesicles: Neuroreparative properties and role in the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Journal of controlled release, 2020. 323: p. 225-239.
4 Attili, D., et al., Astrocyte-derived exosomes in an iPSC model of bipolar disorder. Neurodevelopmental disorders: Employing IPSC technologies to define and treat childhood brain diseases, 2020: p. 219-235.
5 Cai, Z.-Y., et al., Exosomes: a novel therapeutic target for Alzheimer’s disease? Neural regeneration research, 2018. 13(5): p. 930-935.
6 Zou, Y., et al., Review on the roles of specific cell-derived exosomes in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience, 2022. 16: p. 936760.
7 Cai, Z.-Y., et al., Exosomes: a novel therapeutic target for Alzheimer’s disease? 2018. 13(5): p. 930-935.
8 You, Y., et al., Human neural cell type‐specific extracellular vesicle proteome defines disease‐related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer's disease brain. Journal of Extracellular Vesicles, 2022. 11(1): p. e12183.
9 Xiao, T., et al., The role of exosomes in the pathogenesis of Alzheimer’disease. Translational neurodegeneration, 2017. 6: p. 1-6.
10 Spinelli, M., et al., Neural stem cell-derived exosomes revert HFD-dependent memory impairment via CREB-BDNF signalling. International Journal of Molecular Sciences, 2020. 21(23): p. 8994.
11 Xu, H., et al., The functions of exosomes targeting astrocytes and astrocyte-derived exosomes targeting other cell types. Neural Regeneration Research, 2024. 19(9): p. 1947-1953.
12 Buenaventura, R.G., et al., Sequential isolation of microglia and astrocytes from young and aged adult mouse brains for downstream Transcriptomic analysis. Methods and Protocols, 2022. 5(5): p. 77.
13 Hoveizi, E. and S. Tavakol, Therapeutic potential of human mesenchymal stem cells derived beta cell precursors on a nanofibrous scaffold: an approach to treat diabetes mellitus. Journal of Cellular Physiology, 2019. 234(7): p. 10196-10204.
14 Wei, X., et al., Surface phosphatidylserine is responsible for the internalization on microvesicles derived from hypoxia-induced human bone marrow mesenchymal stem cells into human endothelial cells. PloS one, 2016. 11(1): p. e0147360.
15 Mahmoudi, M., et al., Comparison of the effects of adipose tissue mesenchymal stromal cell-derived exosomes with conditioned media on neutrophil function and apoptosis. International immunopharmacology, 2019. 74: p. 105689.
16 Jung, M.K. and J.Y. Mun, Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE, 2018(131): p. 56482.
17 Wang, J., et al., Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. International journal of clinical and experimental pathology, 2015. 8(6): p. 6135.
18 Bernal, A. and L. Arranz, Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences, 2018. 75: p. 2177-2195.
19 Ying, C., et al., Neural differentiation of rat adipose-derived stem cells in vitro. Cellular and Molecular Neurobiology, 2012. 32: p. 1255-1263.
20 Ye, Y., et al., Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) infusion restored astrocytic plasticity in the hippocampus of a rat model of depression. Neuroscience letters, 2011. 503(1): p. 15-19.
21 Zhang, W., et al., Astrocyte-derived exosomes protect hippocampal neurons after traumatic brain injury by suppressing mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Aging (Albany NY), 2021. 13(17): p. 21642.
22 Long, X., et al., Astrocyte-derived exosomes enriched with miR-873a-5p inhibit neuroinflammation via microglia phenotype modulation after traumatic brain injury. Journal of neuroinflammation, 2020. 17: p. 1-15.
23 Ma, K., et al., Insulin-like growth factor-1 enhances neuroprotective effects of neural stem cell exosomes after spinal cord injury via an miR-219a-2-3p/YY1 mechanism. Aging (Albany NY), 2019. 11(24): p. 12278.
24 Guo, M., et al., Mesenchymal stem cell-derived exosome: a promising alternative in the therapy of Alzheimer’s disease. Alzheimer's research & therapy, 2020. 12: p. 1-14.
25 Li, J., et al., Highly Sensitive Exosome Detection for Early Diagnosis of Pancreatic Cancer Using Immunoassay Based on Hierarchical Surface‐Enhanced Raman Scattering Substrate. Small Methods, 2022. 6(6): p. 2200154.
26 Derkus, B., et al., Xenogenic neural stem cell‐derived extracellular nanovesicles modulate human mesenchymal stem cell fate and reconstruct metabolomic structure. Advanced Biology, 2022. 6(6): p. 2101317.
27 Gordillo-Sampedro, S., et al., iPSC-derived healthy human astrocytes selectively load miRNAs targeting neuronal genes into extracellular vesicles. Molecular and Cellular Neuroscience, 2024. 129: p. 103933.
28 Zhang, R., et al., NSC-derived exosomes enhance therapeutic effects of NSC transplantation on cerebral ischemia in mice. Elife, 2023. 12: p. e84493.
29 Li, H., et al., Glia-derived exosomes: Promising therapeutic targets. Life sciences, 2019. 239: p. 116951.
30 Apodaca, L.A., et al., Human neural stem cell-derived extracellular vesicles mitigate hallmarks of Alzheimer’s disease. Alzheimer's Research & Therapy, 2021. 13: p. 1-18.
31 Luarte, A., et al., Astrocyte-derived small extracellular vesicles regulate dendritic complexity through miR-26a-5p activity. Cells, 2020. 9(4): p. 930.
جداسازی، شناسایی و مقایسه اگزوزوم های استخراج شده از سلول های بنیادی عصبی و
آستروسیت های مغز موش صحرایی و اهمیت پتانسیل درمانی آنها در بیماریهای نورودژنراتیو
اعظم کریمی1، الهام حویزی2*، لطف اله خواجه پور3، زهره قطب الدین4
1-دانشجوی دکتری فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2-استاد سلولی تکوین، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
3-دانشیار فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
4-دانشیار فیزیولوژی پزشکی، گروه فیزیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
نویسنده مسئول: الهام حویزی، پست الکترونیک: e.hoveizi@scu.ac.ir
چکیده
مقدمه: استفاده از اگزوزومها به عنوان رویکردی جدید بویژه برای درمان بیماری های مرتبط با سیستم عصبی بسیار مورد توجه است. نوآوری این مطالعه ارائه تحلیل مقایسه‌ای ویژگی‌های بیومولکولی و مورفولوژیک اگزوزومهای استخراج‌شده از سلولهای بنیادی عصبی (NSCs) و آستروسیت‌های مغز، که پیش‌تر در تحقیقات آزمایشگاهی به‌طور کامل مورد بررسی قرار نگرفته است، لذا هدف از این مطالعه استخراج اگزوزوم ها این سلول ها، شناسایی و مقایسه آنها جهت پیشبرد اهداف درمانی می باشد.
مواد و روشها: NSCs و آستروسیت ها از مغز نوزاد موش صحرایی استحصال شدند و مارکر های سطح آن ها به کمک ایمونوسیتوشیمی تایید شد. جداسازی اگزوزوم ها با استفاده از کیت آناسل انجام شد. جهت تایید اگزوزوم ها حضور CD مارکرها (CD9, CD63, CD81) با استفاده از وسترن بلات و تعیین غلظت اگزوزوم ها با استفاده از روش بردفورد انجام شد. بررسی های مورفولوژی و اندازه قطر اگزوزوم ها با استفاده از تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) و DLS انجام شد.
نتایج: ایمونوسیتوشیمی حضور مارکرهای Nestin، Tuj-1 و GFAP را نشان داد. غلظت اگزوزوم های استخراج شده به ترتیب در NSCs و آستروسیت ها معادل 52/330 و 19/454 میکروگرم/میلی لیتر بود. وسترن حضور مارکرهای CD9, CD63, CD81 را بر سطح اگزوزم های استخراج شده تایید کرد. میانگین قطر اگزوزوم های استخراج شده از NSCs و آستروسیت با استفاده از DLS، به ترتیب 45/50 و 61/38 نانومتر بود.
نتیجهگیری: این احتمال وجود دارد که اگزوزوم های استخراج شده از آستروسیت ها به سبب مقدار پروتئین بیشتر و اندازه کوچکتر نسبت به اگزوزوم های استخراج شده از NSCs توجه بیشتری را به عنوان یک رویکرد درمانی جدید در بیماریهای سیستم عصبی به خود جلب کنند. اگرچه مطالعات بیشتر برای تأیید و بررسی عملکرد بیولوژیکی و اثربخشی این اگزوزومها در فرآیندهای ترمیم عصبی پیشنهاد می شود.
کلمات کلیدی: اگزوزوم، سلول های بنیادی عصبی، سلول های آستروسیت، موش صحرایی
Isolation, identification and comparison of exosomes extracted from neural stem cells and astrocytes of rat brain and The importance of their therapeutic potential in neurodegenerative diseases
Azam Karimi1, Elham Hoveizi2*, Lotfollah Khajehpour3, Zohreh Ghotbeddin4
1-Ph.D. Candidate of Animal Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
2-Professor of Cell and Developmental Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
3-Associate Professor of Animal Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
4-Associate Professor of Medical Physiology, Department of Physiology, Faculty of Veterinary, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
Correspondence to: Elham Hoveizi , E-mail: e.hoveizi@scu.ac.ir
Abstract
Introduction: Exosomes are a new approach to treatment that is of great interest, especially for diseases related to the nervous system. The innovation of this study lies in providing a comparative analysis of the biomolecular and morphological properties of exosomes derived from neural stem cells (NSCs) and brain astrocytes, which have not been thoroughly investigated in previous laboratory research. This study aims to extract exosomes from this cells, identification, validate them, and compare them to advance therapeutic goals.
Materials and Methods: It seems that, probably NSCs and astrocytes were extracted from the brain of newborn rats and their surface markers were confirmed by immunocytochemistry. Exosomes were isolated using the Anacell kit. To confirm the presence of exosomes, the presence of CD markers (CD9, CD63, CD81) was confirmed by Western blotting and the concentration of exosomes was determined by the Bradford method. The morphology and diameter of exosomes were examined using transmission electron microscopy (TEM) and DLS.
Results: Immunocytochemistry showed the presence of Nestin, Tuj-1, and GFAP markers. The concentration of extracted exosomes in NSCs and astrocytes was 330.52 and 454.19 μg/ml, respectively. Western blot confirmed the presence of CD9, CD63, and CD81 markers on the surface of extracted exosomes. The average diameter of exosomes extracted from neural stem cells and astrocytes using DLS was 50.45 and 38.61 nm, respectively.
Conclusion: Astrocyte-derived exosomes will likely attract more attention as a novel therapeutic approach in nervous system diseases due to their higher protein content and smaller size than from NSCS-derived exosomes. However, further studies are suggested to confirm and investigate these exosomes' biological function and efficacy in neural repair processes.
Keywords: Exosomes, neural stem cells, astrocytes, rats.
مقدمه
سلولهای بنیادی عصبی (NSCs) به عنوان سلولهای پیش‌ساز سیستم عصبی مرکزی (CNS) تعریف میشوند که ظرفیت خود نوسازی و پتانسیل چند توانی برای تبدیل شدن به سلولهای عصبی و گلیال را دارند. NSCs را می توان از بافت مغز جنین انسان و همچنین از چندین ناحیه از مغز انسان بالغ مانند پیاز بویایی، قشر مغز، هیپوکامپ یا ناحیه تحت بطنی بطن های جانبی جدا کرد. NSCها به دلیل توانایی خودتکثیری و تمایز نسبت به فنوتیپ های عصبی و گلیال، یک کاندید امیدوارکننده به جهت درمان مبتنی بر سلول برای آسیب های CNS هستند[1]. همچنین آستروسیت ها، یکی از انواع سلول های گلیال هستند و نقش مهمی در حفظ ساختار و عملکرد CNS دارند. آستروسیتها، در حمایت فیزیکی و متابولیکی از نورونها، تشکیل و نگهداری سد خونی-مغزی(BBB)، تولید عوامل نوروتروفیک و محافظت عصبی و فرآیندهای ترمیم CNS نقش دارند[2]. آستروسیتها نقش اصلی را در انتقال سیناپسی و پردازش اطلاعات توسط مدارهای عصبی دارند. با توجه به نقش حیاتی NSCs و آستروسیتها در CNS و همچنین اهمیت مبادلات بین سلولی، به ویژه آنهایی که توسط اگزوزومها واسطه میشوند، این سلولها و ترشحات آنها برای تنظیم کنترل سلولی و تقویت ارتباطات پیچیده لازم برای رشد مناسب سلولهای عصبی، عملکرد و هومئوستاز نورونها ضروری هستند[3].
اگزوزوم ها نانو وزیکول های خارج سلولی با قطر 30-100 نانومتر هستند و تقریبا توسط تمامی سلولها ترشح میشوند[4]. این نانووزیکول ها به واسطه ی حمل اسیدهای نوکلئیک، پروتئین ها، لیپیدها و سایر مواد فعال زیستی میتوانند در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک بدن نقش داشته باشند. قابلیت اگزوزوم ها در ورود به سلول های میزبان، سبب شده تا در مقایسه با حامل های مصنوعی همچون لیپوزوم ها و نانوذرات مزایای گسترده و منحصر به فردی را در زمینه تشخیص و درمان بیماری ها داشته باشند[5, 6]. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که این نانوزیکول‌ها در بسیاری از عملکردهای بیولوژیکی مانند تکثیر سلولی، تنظیم ایمنی، بازسازی اعصاب و سرطان نقش حیاتی دارند. شواهد موجود تأیید میکنند که اگزوزومهای مشتق شده از سلولهای بنیادی، محتویات خود را از طریق سیگنال دهی پاراکرین از سلولی به سلول دیگر منتقل میکنند[7]. اگزوزومهای آزاد شده از سلولهای سیستم عصبی (نورون، آستروسیت، الیگودندروسیت، میکروگلیا) در شکل پذیری سیناپسی، رابطهی نورون-گلیا، محافظت عصبی و بازسازی عصبی نقش دارند[8, 9]. بهبود کوتاه‌مدت علائم بیماری و عوارض جانبی وابسته به دوز دارو در درمان دارویی برای بیماریهای نورودژنراتیو، جامعه پزشکی را مجبور کرده است تا به دنبال درمانی مؤثر برای این تهدید جدی سلامت جهانی باشد. پتانسیل درمانی سلولهای بنیادی برای درمان اختلالات نورودژنراتیو در سال ۱۹۸۰ شناسایی شد..سپس، مطالعات گسترده‌ای برای توسعه این استراتژی درمانی برای درمان بیماریهای عصبی انجام شد.امروزه، سلولهای بنیادی و ترشح آنها به عنوان یک محیط درمانی برای درمان بیماریهای نورودژنراتیو شناخته شده‌اند. اگزوزومهای مشتق شده از سلول های بنیادی، که بخش مهمی از ترشحات آنها هستند، به عنوان مسئول بخش مهمی از عملکرد درمانی این سلول ها هستند[10]. تعداد فزایندهای از مطالعات پیش بالینی، پیوند اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی را به عنوان یک استراتژی درمانی جدید در برابر زوال شناختی و تخریب عصبی پیشنهاد کردهاند. اگزوزومهای مشتق شده از NSC حاوی تعداد زیادی مولکول فعال زیستی هستند که به طور بالقوه به تنظیم فعالیت رونویسی و فعالیت سیناپسی در نورون ها کمک میکنند و می توانند CREB و آبشار مولکولی مرتبط با نوروتروفین در هیپوکامپ را فعال کنند[11]. آستروسیت ها به عنوان یکی از مهم ترین سلول های حمایت کننده در CNS، اگزوزوم هایی با اجزای مختلف در شرایط مختلف ترشح می کنند. اثرات اگزوزومهای مشتق شده از آستروسیت بر نورونها به فرآیندهای بیولوژیکی و پاتولوژیک در CNS مربوط میشود. طبق یک مطالعه اخیر، وزیکول‌های خارج سلولی کوچک مشتق از آستروسیت، تشکیل سیناپس را از طریق سیگنال‌دهی TGF-β با واسطه فیبولین-2 ترویج میکنند. علاوه بر این، این اگزوزوم ها عملکردهای بیولوژیکی مختلفی را در بیماری های مختلف CNS انجام می دهد[12]. هدف از این مطالعه استخراج اگزوزوم ها از محیط کشت NSCs و آستروسیت با استفاده از کیت شیمیایی، شناسایی و مقایسه آنها می باشد.
روش کار
این مقاله حاصل پایان نامه دانشجوی دکتری است که دارای تاییدیه اخلاقی با کد IR.SCU.RES.1403.071 می باشد.
استخراج سلولهای بنیادی عصبی و آستروسیت
در این پژوهش نوزاد 3-1 روزه موش صحرایی از مرکز تکثیر جندی شاپور تهیه شد. سپس به روش آسان کشی توسط کلروفرم کشته شد و سرحیوان جدا شد. پس از شکاف جمجمه در شرایط استریل، مغز حیوان جدا و به قطعات کوچک تقسیم شده و به منظور هضم اتصالات بین سلول ها، به مدت 20 دقیقه در آنزیم تریپسین %25/0 (Gibco) در دمای 37 درجه انکوبه شد. پس از آن از صافی مش عبور داده شده و محلول حاصل با دور 1000 rpm به مدت 7 دقیقه سانتریفیوژ شد. در نهایت پلت سلولی حاصل در فلاسک حاوی محیط کشت DMEM حاوی %10 سرم جنین گاو (FBS) کشت داده شد. 24 ساعت پس از کشت سلول ها، به منظور جداسازی توده های سلولی NSCs، محیط رویی از فلاسک سلولی برداشته شد و در فلاسک جداگانه کشت داده شد[13].
تایید سلول های استخراج شده با استفاده از ایمونوسیتوشیمی
به جهت تایید نشانگرهای NSCs (Nestin و Tuj-1) و آستروسیت (GFAP) از تکنیک ایمونوسیتوشیمی استفاده شد. ابتدا سلول های کشت شده با استفاده از پارافرمالدئید 4 درصد به مدت 30 دقیقه تثبیت شدند. با افزودن محلول تریتون (5/0 درصد، به مدت 5 دقیقه) سلول ها نفوذ پذیر شدند. پس از افزودن آنتی بادی اولیه (GFAP, Nestin و Tuj-1) (Abcam, Santa cruz)، پلیت به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. در روز دوم، پس از حذف آنتی بادی اولیه، آنتی بادی ثانویه اضافه شد و پلیت به مدت 60 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. سپس هسته های سلولی با استفاده از رنگ 4'،6-diamidino-2-phenylindole (0.1%) (DAPI) رنگ آمیزی شدند و برای مشاهده با میکروسکوپ فلورسانس (Olympus، BX51، ژاپن) آماده شدند[14].
استخراج نانووزیکولهای اگزوزوم
استخراج اگزوزوم ها مطابق با دستورالعمل کیت آناسل انجام شد. پس از اینکه فلاسک محتوی NSCs و آستروسیت به پاساژ سوم رسید، محیط کشت فلاسک هر 72 ساعت یکبار برداشته شد و به منظور جداسازی قطعات درشت، سانتریفیوژ شد. سپس محیط رویی فیلتر شد و به همراه معرف A کیت، مدت 12 ساعت در دمای 4 درجه انکوبه شد. سپس به منظور جداسازی اگزوزوم ها، محلول حاصل به مدت 40 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ(3000rpm) شد. به منظور افزایش ماندگاری پلت حاصل از سانتریفیوژ (اگزوزوم ها)، معرف B اضافه شد. تمامی مراحل استخراج اگزوزوم مطابق با دستورالعمل کیت شرکت آناسل انجام شد.
تایید مارکرهای سطح اگزوزوم ها با استفاده از وسترن بلات
پروتئین کل از اگزوزوم با استفاده از بافر RIPA (Assay Radioimmuno-Percipitation) استخراج شد و توسط ژل PAGE (Sodium Dodecyle Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) جداسازی شد. سپس لکه ها به غشای نیتروسلولزی منتقل شدند و با انکوبه کردن غشاء در محلول مسدود کننده به مدت 2 ساعت در دمای اتاق، مهار واکنش های غیر اختصاصی انجام شد. پس از آن، غشا با یک آنتی بادی اختصاصی علیه تتراسپانین‌های CD9، CD63 و CD81 ((Santa Crus Company) به مدت 5 ساعت و یک آنتی‌بادی ثانویه متصل HRP(horseradish peroxidase) به مدت یک ساعت انکوبه شد. لکه ها با استفاده از کیت ECL (Enhanced chemiluminescence) تشخیص داده شدند[15].
سنجش قطر اگزوزوم ها با استفاده از Dynamic Light Scatterin (DLS)
اندازه گیری قطر ذرات در محدوده 1 نانومتر تا 6 میکرومتر با استفاده از پراکندگی دینامیکی نور (DLS) اندازه گیری می شود. بدین منظور اگزوزوم های استخراج شده با افزودن PBS به حجم 300 میکرولیتررسانده شد. سپس قطر اگزوزوم ها با استفاده از دستگاه Zetasizer Nano ZS (ساخت آمریکا) اندازه گیری شد[16].
تصوبرداری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره(TEM)
تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی اگزوزوم ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری انجام شد. برای آمادهسازی نمونه جهت مشاهده توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری، ابتدا یک قطره از سوسپانسیون اگزوزوم را روی شبکه ای با پوشش کربن قرار داده و پس از خشک شدن در دمای اتاق، با PBS استریل شسته و با یورانیل استات 1% به مدت 1 دقیقه انکوبه شد و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (مدل 906E، شرکت LEO) تصویر برداری شد[17].
اندازه گیری غلظت اگزوزوم ها با استفاده از تست بردفورد
به منظور سنجش میزان پروتئین استخراج شده در محلول حاصل حاوی اگزوزوم، از پروتئین سنجی به روش بردفورد استفاده شد. بدین منظور 60 میکرولیتر از محلول اگزوزوم در پلیت ریخته شد و به ترتیب 40 میکرولیتر آب مقطر و محلول بردفورد به هر چاهک اضافه شد. یک نمونه هم به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. سپس خوانش OD توسط دستگاه الایزا ریدر (Bio tek) در طول موج 595 انجام شد[18].
نتایج
بررسی مورفولوژی سلول های آستروسیت و NSCs
تشکیل توده های نوروسفر که حاصل تجمع NSCs هستند و وجود ضمائم ستاره ای شکل که از جمله ویژگی های سلول های آستروسیت است در تصاویر تهیه شده از سلول ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس به خوبی نشان داده شد. در ابتدای کشت، NSC ها در کنار هم تجمع می یابند و توده هایی ایجاد می کنند که برخلاف سلول های آستروسیت به کف فلاسک نمیچسبند و حالت شناور دارند. به مرور، در صورت وجود فاکتور های رشد کافی در محیط کشت، NSC ها تکثیر شده و از حالت توده ای شکل خارج می شوند. زوائد سلولی کشیده شده و با NSC های مجاور سیناپس برقرار می کنند(تصویر1-a و b). وجود زوائد بلند، نازک و منشعب، ظاهری ستاره ای شکل به آستروسیت ها می دهد. در ابتدای کشت که تعداد سلول ها کم است، به جهت برقراری ارتباط میان سلول ها، زوائد، رشد زیادی دارند ولی بتدریج که تراکم سلولی افزایش یافت، فضای بین سلول ها کمتر شده، زوائد کوتاه تر شده و ظاهر ستاره ای شکل سلول ها به خوبی نمایان می شود(تصویر2-a و b).
بررسی مارکرهای سلول های NSCs و آستروسیت با استفاده از ایمونوسیتوشیمی
بیان مارکرهای Nestin، Tuj-1 (تصویر1c و dو e و f) و GFAP (تصویر2-c و d) با استفاده از ایمونوسیتوشیمی نشان داده شد که به ترتیب تایید کننده هویت سلول های استخراج شده NSCs و آستروسیت بود.
نتایج بررسی فراساختار اگزوزوم های استخراج شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره
همانگونه که در تصویر3 نشان داده شده است، تصاویر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره علاوه بر نشان دادن محدوده قطر اگزوزوم ها در محدوده نانو، نشان دهنده یکنواختی و ظاهر فنجانی این نانووزیکول ها بود.
تایید اگزوزوم های استخراج شده با استفاده از تکنیک وسترن بلات، DLS
غلظت اگزوزوم های استخراج شده توسط بردفورد ارزیابی شد، این غلظت به ترتیب برای اگزوزوم های استخراج شده از NSCs و آستروسیت ها معادل 52/330 و 19/454 میکروگرم/میلی لیتر بود. حضور سه مارکر CD9, CD63, CD81 توسط تست وسترن بلات تایید شده و نشانگر این است که نانووزیکول های استخراج شده اگزوزوم هستند. میانگین قطر اگزوزوم های استخراج شده از NSCs و آستروسیت با استفاده از DLS، به ترتیب 45/50 و 61/38 نانومتر بود (تصویر4).
.... جئ =تصویر1: تصاویر a) سلول های بنیادی عصبی و b) نوروسفر با استفاده از میکروسکوپ نوری فاز معکوس. تصاویر تایید نشانگرهای c) Nestin و e) Tuj1 به همراه d و f) رنگ آمیزی DAPI با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت.(بزرگنمایی100 میکرومتر)
تصویر2: تصاویر a و b) سلول های آستروسیت با استفاده از میکروسکوپ نوری فاز معکوس (بزرگنمایی4 و 10). تصاویر c) تایید نشانگر GFAP و b) رنگ آمیزی DAPI با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(بزرگنمایی 100 میکرومتر).
تصویر3: تصاویر تهیه شده از اگزوزوم های استخراج شده از سلول های a) بنیادی عصبی و b) آستروسیت با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره.
تصویر4: نتایج حاصل از بیان نشانگرهای CD(CD9,CD63,CD81) در اگزوزوم های استخراج شده از سلول های a) بنیادی عصبی و آستروسیت توسط تکنیک وسترن بلات. نمودارهای حاصل از DLS به جهت تایید نانوذره بودن اگزوزوم های استخراج شده از سلول های a) بنیادی عصبی و d) آستروسیت. e) مقایسه ی قطر اگزوزوم ها(*p<0.05).
بحث
در مطالعه حاضر ابتدا NSCs و آستروسیت ها از مغز نوزاد موش3-1روزه جداسازی و کشت داده شد. به منظور خالص سازی سلول ها، پس از اینکه سلول ها به پاساژ سوم رسیدند، مارکرهای سطح سلول به کمک تکنیک ایمونوسیتوشمی شناسایی شده و هویت آن ها تایید شد. Nestin و Tuj-1 از جمله مارکرهای عصبی هستند که حضور آن ها در سطح سلول های استخراج شده تایید شد. مارکر Nestin یک پروتئین اسکلت سلولی است که در NSC های مغز در حال رشد و بالغ مشاهده می شود[19]. مارکر Tuj-1 نشانگر نورون ها در سیستم عصبی مرکزی و محیطی در مراحل اولیه تمایز عصبی می باشد[20]. GFAP نوعی رشته اسکلت سلولی میانی است که عمدتاً در آستروسیت ها یافت می شود و شکل سلولی، ساختار سیستم عصبی مرکزی، عملکرد سیناپسی و ثبات مکانیکی را حفظ می کند[21].
همچنین در این مطالعه اگزوزوم ها از محیط کشت NSCs و آستروسیت ها با استفاده از کیت جداسازی شد. پس از جداسازی به منظور تایید هویت نانووزیکول های استخراج شده از تکنیک وسترن بلات، DLS و TEM استفاده شد. حضور مارکرهای تتراسپانین (,CD9 CD63, CD81) در نتایج حاصل از تکنیک وسترن بلات، تایید کرد که نانووزیکول های استخراج شده اگزوزوم هستند. مشابه با نتایج ما، در مطالعه Long و همکاران (2020)، حضور مارکرهای CD9 و CD63 در تست وسترن اگزوزوم های مشتق شده از سلول های آستروسیت تایید شد. همچنین در کار Zhang و همکاران (2021)، تایید سه مارکر CD9, CD63 و CD81 در اگزوزوم های استخراج شده از سلول های آستروسیت با استفاده از وسترن بلات تایید شد[22, 23]. در مطالعه Ma و همکاران (2019) نیز حضور مارکرهای CD9 و CD63 در اگزوزوم های استخراج شده از NSC های ناحیه قشر مغز با استفاده از تکنیک وسترن بلات تایید شد[24]. نشانگرهای شناسایی اگزوزوم ها شامل Alix، ،flotillin-1 و CD9، CD63 و CD81 می باشند. تتراسپانین ها، به عنوان مهمترین نشانگرهای سطحی که معمولاً در میکرووزیکول ها و اگزوزوم ها یافت می شوند، یک بررسی قابل اطمینان برای تحقیقات زیستی در رابطه با اگزوزوم ها هستند[25]. همچنین وسترن بلات با سادگی، در دسترس بودن و توانایی تشخیص هر دو پروتئین سطحی و داخلی اگزوزومی، یک رویکرد قابل اعتماد برای شناسایی پروتئین های هدف مرتبط با اگزوزوم ها ارائه می دهد و استفاده گسترده از آن در تحقیقات اگزوزومی بر اهمیت و قابل اطمینان بودن آن تاکید دارد[26].
نتایج حاصل از DLS نشان داد که حدود 9/99 درصد از وزیکول های استخراج شده از محیط کشت NSCs و آستروسیت به ترتیب قطری حدود 45/50 و 61/38 نانومتر دارند. این نتایج حاکی از آن است که وزیکول های استخراج شده در محدوده نانو قرار دارند و مطابق با مطالعات انجام شده در گذشته، این نانووزیکول ها، در دسته ی اگزوزوم ها جای دارند. در مطالعه Derkus و همکاران (2022)، نیز میانگین قطر اگزوزوم های استخراج شده از NSC ها در ناحیه تحت بطنی، 80 نانومتر بود[27]. در نتایج حاصل از مطالعه Sampedro و همکاران (2024)، محدوده قطر اگزوزوم های استخراج شده از آستروسیت ها 250-50 نانومتر بود.[28] و این نتایج با نتایج حاصل از مطالعه ما مطابقت داشت. شایان ذکر است روش DLS در اندازه‌گیری قطر اگزوزومها با محدودیت‌هایی مانند حساسیت به ناخالصی‌ها و ذرات تجمع‌یافته، عدم توانایی در تفکیک ذرات بزرگ‌تر و کوچکتر، و تأثیر پارامترهای دستگاه مواجه است. بنابراین، استفاده از سایر تکنیک‌های مانند انواع تصویربرداری، تحلیل‌های بیولوژیکی و یا NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) پیشنهاد می گردد[29].
اگزوزوم ها به دلیل مقیاس نانو خود به راحتی می توانند از BBB عبور کرده و علاوه بر نقش درمانی خود می توانند به عنوان حامل دارو عمل کرده و در درمان بسیاری از بیماری ها به ویژه بیماری های مرتبط با سیستم عصبی مغزی نقش مهمی را ایفا کنند. تحقیقات نشان داده است که اگزوزوم های استخراج شده از NSC ها به دلیل وجود miRNA های خاص می توانند تمایز NSC را در شرایط آزمایشگاهی افزایش داده و همچنین به سبب اثرات ضد التهابی، نوروژنیک و نوروتروفیک و تعامل با ریزمحیط بافت مغز، برای درمان چندین بیماری عصبی مفید هستند[29].
در تصاویر بدست آمده از TEM نیز حضور اگزوزوم ها تایید شد. همانطور که در تصاویر نشان داده شد، از آنجایی که اگزوزوم ها منشاء سلولی دارند، غشای اگزوزوم ها مشابه با غشای سلول دولایه ای است. وجود غشای دولایه ای منشاء گرفته از سلول به توانایی عبور این نانووزیکول ها از BBB و همنیطور قدرت نفوذ بالا به سلول های هدف کمک می کند. مشابه با نتایج ما، نتایج حاصل از TEM اگزوزوم های استخراج شده از NSC در مطالعه Spinelli و همکاران (2020)، شکل فنجانی معمولی و توزیع اندازه با پیک متوسط در 100 نانومتر را نشان داد[11]. در مطالعه Attili و همکاران (2020) نیز شکل فنجانی اگزوزوم های استخراج شده از سلول های آستروسیت تایید شد[4]. این نتایج نشان می دهد که احتمالا اگزوزوم ها از نظر شکل ظاهری تفاوت ویژه ای با یکدیگر ندارند.
نتایج حاصل از سنجش پروتئین به روش بردفورد نشان داد که محلول استخراج شده محتوی اگزوزوم NSCs و آستروسیت به ترتیب محتوی 52/330 و 19/454 میکروگرم/ میلی لیتر پروتئین است. بنابراین مقدار پروتئین استخراج شده از محیط کشت سلول های آستروسیت در محلولی با حجم یکسان نسبت به NSCs به طور معنی داری بیشتر بود. اگزوزوم های مشتق شده از گلیا (GDEs) می توانند پروتئین ها و نوکلئوتیدها را انتقال دهند و اثرات محافظتی روی سیستم عصبی داشته باشند. GDE ها ارتباط گلیا- نورون، پاسخ های ضد استرس، ضد التهاب و رشد نیوریت را تقویت می کنند و همچنین ممکن است در بیماری های عصبی مانند گلیوما، گلیوبلاستوما، بیماری آلزایمر، پارکینسون و عفونت های عصبی نقش داشته باشند. آنها همچنین می توانند ازBBB عبور کرده و وارد گردش خون شوند، بنابراین بر عملکرد سایر اندام ها تأثیر می گذارند[30]. در مطالعهای نشان داده شد که تزریق درون وریدی اگزوزومهای مشتق از NSCs انسان در موشهای مدل آلزایمر 5xFAD باعث کاهش تجمع پلاک آمیلوئید بتا و فعالسازی میکروگلیال شد. این نتایج با ترمیم نسبی سطوح هموستاتیک سیتوکین‌های پیش التهابی در حال گردش در موشهای مدل آلزایمری مرتبط است[31]. درمان با نانو وزیکول ها از آسیب سیناپسی در مغز مدل آلزایمری محافظت میکند که موجب بهبود علائم شناختی میشود. اگزوزوم های آزاد شده توسط آستروسیت ها حاوی مواد محافظت کننده عصبی از جمله فاکتور رشد فیبروبلاست-2، فاکتور رشد اندوتلیال عروقی و آپولیپوپروتئین-D هستند[3]. به خوبی مشخص شده است که اگزوزومهای رها شده از سلول های آستروسیت در شرایط کشت خاص حامل miRNAها یا پروتئین‌های خاص هستند که می توانند نویدبخش درمان آسیب‌های مغزی و بیماریهای تخریب‌کننده عصبی باشند. آنزیم آلدولاز C در اگزوزوم های آزاد شده از آستروسیت ها، مسیر Wnt را با تشکیل کمپلکس با اکسین در نورون ها فعال می کند. تحریک مسیر سیگنال دهی Wnt با لیگاند Wnt5a منجر به تغییراتی در miRNA-26a-5p در نورون های هیپوکامپ می شود که باعث افزایش تکثیر و چگالی دندریتی می شود[32].
نتیجه گیری
پژوهش حاضر به جداسازی و شناسایی اگزوزومها از NSCs و آستروسیتها پرداخته است. نتایج نشان می‌دهند که مراحل استخراج و تأیید هویت اگزوزومها با استفاده از کیت تجاری با موفقیت انجام شده است. منشاء زیستی و اندازه کوچک اگزوزوم ها که موجب سهولت عبور آن ها از BBB می شود موجب شده تا استفاده از این نانووزیکول ها نسبت به سلول درمانی و دارو درمانی راهکاری مورد اطمینان تر به جهت درمان بیماری ها ارائه دهد. طبق نتایج بدست آمده از مقایسه اگزوزوم های استخراج شده از NSCs و آستروسیت این احتمال وجود دارد که اگزوزوم های استخراج شده از آستروسیت ها به سبب مقدار پروتئین بیشتر و اندازه کوچکتر نسبت به اگزوزوم های استخراج شده از سلول های بنیادی عصبی نقش موثر تری در درمان بیماری ها داشته باشند.
این پژوهش با هدف استخراج، تایید و مقایسه اگزوزوم های استخراج شده از NSC و آستروسیت ها انجام شد. اگزوزوم ها به سبب منشا زیستی و حمل اطلاعات ژنتیکی و انتقال آن میان سلول ها، قابلیت حمل دارو ها و مقیاس نانو خود نسبت به سلول درمانی به جهت درمان بیماری ها از اولویت بالاتری برخوردار هستند. بنابراین تحقیقات در رابطه با اگزوزوم ها و مکانیسم های عملکرد آن ها به خصوص در حوزه پزشکی و بیماری های مرتبط با سیستم عصبی می تواند آینده ای امید بخش داشته باشد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل کار پژوهشی در مقطع دکتری فیزیولوژی جانوری در قالب پایان‌نامه می‌باشد. بدین وسیله از مساعدت معاونت محترم پژوهشی دانشگاه شهیدچمران اهواز در انجام این پژوهش تشکر و قدردانی میگردد. هیچ کدام از نویسندگان این مطالعه، افراد و یا دستگاهها تعارض منافعی برای انتشار این مقاله ندارند.
منابع
1. Marei, H.E., et al., Human olfactory bulb neural stem cells expressing hNGF restore cognitive deficit in Alzheimer's disease rat model. Journal of cellular physiology, 2015. 230(1): p. 116-130.
2. Valenza, M., et al., Alternative targets to fight Alzheimer’s disease: focus on astrocytes. Biomolecules, 2021. 11(4): p. 600.
3. Upadhya, R., et al., Astrocyte-derived extracellular vesicles: Neuroreparative properties and role in the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Journal of controlled release, 2020. 323: p. 225-239.
4. Attili, D., et al., Astrocyte-derived exosomes in an iPSC model of bipolar disorder. Neurodevelopmental disorders: Employing IPSC technologies to define and treat childhood brain diseases, 2020: p. 219-235.
5. Cai, Z.-Y., et al., Exosomes: a novel therapeutic target for Alzheimer’s disease? Neural regeneration research, 2018. 13(5): p. 930-935.
6. Zou, Y., et al., Review on the roles of specific cell-derived exosomes in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience, 2022. 16: p. 936760.
7. Cai, Z.-Y., et al., Exosomes: a novel therapeutic target for Alzheimer’s disease? 2018. 13(5): p. 930-935.
8. You, Y., et al., Human neural cell type‐specific extracellular vesicle proteome defines disease‐related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer's disease brain. Journal of Extracellular Vesicles, 2022. 11(1): p. e12183.
9. Xiao, T., et al., The role of exosomes in the pathogenesis of Alzheimer’disease. Translational neurodegeneration, 2017. 6: p. 1-6.
10. Fayazi, N., et al., Stem cell-derived exosomes: a new strategy of neurodegenerative disease treatment. Molecular neurobiology, 2021. 58: p. 3494-3514.
11. Spinelli, M., et al., Neural stem cell-derived exosomes revert HFD-dependent memory impairment via CREB-BDNF signalling. International Journal of Molecular Sciences, 2020. 21(23): p. 8994.
12. Xu, H., et al., The functions of exosomes targeting astrocytes and astrocyte-derived exosomes targeting other cell types. Neural Regeneration Research, 2024. 19(9): p. 1947-1953.
13. Buenaventura, R.G., et al., Sequential isolation of microglia and astrocytes from young and aged adult mouse brains for downstream Transcriptomic analysis. Methods and Protocols, 2022. 5(5): p. 77.
14. Hoveizi, E. and S. Tavakol, Therapeutic potential of human mesenchymal stem cells derived beta cell precursors on a nanofibrous scaffold: an approach to treat diabetes mellitus. Journal of Cellular Physiology, 2019. 234(7): p. 10196-10204.
15. Wei, X., et al., Surface phosphatidylserine is responsible for the internalization on microvesicles derived from hypoxia-induced human bone marrow mesenchymal stem cells into human endothelial cells. PloS one, 2016. 11(1): p. e0147360.
16. Mahmoudi, M., et al., Comparison of the effects of adipose tissue mesenchymal stromal cell-derived exosomes with conditioned media on neutrophil function and apoptosis. International immunopharmacology, 2019. 74: p. 105689.
17. Jung, M.K. and J.Y. Mun, Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE, 2018(131): p. 56482.
18. Wang, J., et al., Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. International journal of clinical and experimental pathology, 2015. 8(6): p. 6135.
19. Bernal, A. and L. Arranz, Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences, 2018. 75: p. 2177-2195.
20. Ying, C., et al., Neural differentiation of rat adipose-derived stem cells in vitro. Cellular and Molecular Neurobiology, 2012. 32: p. 1255-1263.
21. Ye, Y., et al., Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) infusion restored astrocytic plasticity in the hippocampus of a rat model of depression. Neuroscience letters, 2011. 503(1): p. 15-19.
22. Zhang, W., et al., Astrocyte-derived exosomes protect hippocampal neurons after traumatic brain injury by suppressing mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Aging (Albany NY), 2021. 13(17): p. 21642.
23. Long, X., et al., Astrocyte-derived exosomes enriched with miR-873a-5p inhibit neuroinflammation via microglia phenotype modulation after traumatic brain injury. Journal of neuroinflammation, 2020. 17: p. 1-15.
24. Ma, K., et al., Insulin-like growth factor-1 enhances neuroprotective effects of neural stem cell exosomes after spinal cord injury via an miR-219a-2-3p/YY1 mechanism. Aging (Albany NY), 2019. 11(24): p. 12278.
25. Guo, M., et al., Mesenchymal stem cell-derived exosome: a promising alternative in the therapy of Alzheimer’s disease. Alzheimer's research & therapy, 2020. 12: p. 1-14.
26. Li, J., et al., Highly Sensitive Exosome Detection for Early Diagnosis of Pancreatic Cancer Using Immunoassay Based on Hierarchical Surface‐Enhanced Raman Scattering Substrate. Small Methods, 2022. 6(6): p. 2200154.
27. Derkus, B., et al., Xenogenic neural stem cell‐derived extracellular nanovesicles modulate human mesenchymal stem cell fate and reconstruct metabolomic structure. Advanced Biology, 2022. 6(6): p. 2101317.
28. Gordillo-Sampedro, S., et al., iPSC-derived healthy human astrocytes selectively load miRNAs targeting neuronal genes into extracellular vesicles. Molecular and Cellular Neuroscience, 2024. 129: p. 103933.
29. Zhang, R., et al., NSC-derived exosomes enhance therapeutic effects of NSC transplantation on cerebral ischemia in mice. Elife, 2023. 12: p. e84493.
30. Li, H., et al., Glia-derived exosomes: Promising therapeutic targets. Life sciences, 2019. 239: p. 116951.
31. Apodaca, L.A., et al., Human neural stem cell-derived extracellular vesicles mitigate hallmarks of Alzheimer’s disease. Alzheimer's Research & Therapy, 2021. 13: p. 1-18.
32. Luarte, A., et al., Astrocyte-derived small extracellular vesicles regulate dendritic complexity through miR-26a-5p activity. Cells, 2020. 9(4): p. 930.