مطالعات سینتیکی و پاسخ کمی لیپواکسیژناز در توت¬فرنگی در طول رشد و پس از انبارمانی در برابر اثرات محیطی
محورهای موضوعی : بیوشیمی
شهریار سعیدیان
1
,
نبی خلیلی اقدم
2
*
,
ستار قادری
3
1 - گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور، نهران، ایران،
2 - گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور، تهران، ایران،
3 - گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران،
کلید واژه: آنزیم , سوبسترا , لیپواکسیژناز, لینولئیک اسید , مدل ,
چکیده مقاله :
لیپواکسیژناز یکی از آنزیمهای مورد توجه شیمیدانها است. این آنزیم یک دیاکسیژناز بوده و اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع چندگانه را برعهده دارد. این تحقیق با هدف مطالعه اثردما (در 8 سطح)، اسیدهای آلی (در 4 سطح)، نمکهای معدنی (در3 سطح) و تعیین غلظت سوبسترای لینولئیک (در 13 سطح) روی سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده و در شرایط انبارمانی انجام شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. نتایج تحقیق نشان داد که بیشترین پاسخ آنزیم به لینولئیک اسید روی هر سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده وانبارمانی به ترتیب برابر42/9، 49/9 و10 میلیمولار لینولئیک اسید بود. نتایج اثر دما بر میزان فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیز نشان داد که برای هر سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده و انبارمانی، بیشینه فعالیت آنزیم در دمای 35 درجه سانتیگراد بود. درحالیکه کمینه فعالیت آنزیم در دمای 80 درجه سانتیگراد برای هر سه نوع توتفرنگی اتفاق افتاد. نتایج اثر اسیدهای آلی بر میزان فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیزحاکی از معنیدار بودن این اثر بود. بیشترین فعالیت آنزیم در حضور ترکیب آلی، توکروفرول در هر سه نوع توتفرنگی و کمترین فعالیت آنزیم درحضور آسکوربیک اسید بود. نتایج همچنین موید اثر معنیدار نمکهای معدنی روی فعالیت لیپواکسیژناز بود. در بین نمکها، بیشترین فعالیت آنزیم در حضور کلرید کلسیم با غلظت1/0 میلی مولار و کمترین در حضور کلرید سدیم با غلظت 1 میلی مولار بود. نتایج بطور کلی بیانگر اثر القائی بالای نمک کلرید کلسیم، دمای 35 درجه و ترکیب توکروفرول با حضور سوبسترای با غلظت 10 میلیمولار لینولئیک اسید بود.
Lipoxygenase is one of the enzymes of interest to chemists. This enzyme is a dioxygenase and is responsible for the oxidation of polyunsaturated fatty acids. With special attention to the functioning of this enzyme and its role, this research is to study the effect of temperature (on 8 levels), organic acids (on 4 levels), inorganic salts (on 3 levels) and determining the concentration of linoleic substrate (on 13 levels) on three types Strawberries were unripe, ripe and stored. The experiment was conducted as a factorial in the form of a completely random design in three replications, and for data analysis, nonlinear regression analysis and interaction effect cutting were used. The results of the research showed that the highest enzyme response to linoleic acid on all three types of unripe, ripe Anbarmani strawberries was 9.42, 9.49 and 10 mM linoleic acid respectively, and based on these results, the level of 10 mM linoleic acid as the level A suitable concentration was considered as the substrate of the enzyme. The results of the effect of temperature on the activity of lipoxygenase enzyme also showed that for all three types of unripe, ripe and stored strawberries, the maximum activity of the enzyme was at 35 degrees Celsius. While the minimum enzyme activity occurred at 80 degrees Celsius for all three types of strawberries. The results of the effect of organic acids on the activity of lipoxygenase enzyme also indicate the significance of this effect. The highest enzyme activity was in the presence of organic compound, tocroferol in all three types of strawberries and the lowest enzyme activity was in the presence of ascorbic acid. Among other two organic acids, benzoic acid had more induction effect on lipoxygenase enzyme than nicotiamine acid.
Aberomand, M., Kheirollah, A., Nikzamir, A., Malekasgar, A.M. and Alimohammadi, M. (2013). The Inhibitory Effect of KCN, NAN3 and Some Bivalent Ions on Lipoxygenase Activity of the Purified Human Placental, Iranian. Journal of Pharmaceutical Sciences. 9: 39–45.
Barrett, D. M. (1995). Theerakulkait, C. Quality indicators in blanched, frozen, stored vegetables. Food Technology. 49: 62-65.
Biacs, P.A. and Daood, H. (1987). Characterization of strawberrylipoxygenase. In: Stumpf PK, Mudd JB, Nes ND, eds. Metabolism, Structure, and Function of Plant Lipids , NY: Planum Press, pp. 425-429.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochemistry. 72: 248-254.
Cao, S., Chen, H., Zhang, C., Tang, Y., Liu, J., & Qi, H. (2016). Heterologous Expression and Biochemical Characterization of Two Lipoxygenases in Oriental Melon, Cucumis melo var. makuwa Makino. PloS one, 11(4), e0153801. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153801
Ealing, P.M. (1994). Lipoxygenase activity in ripening strawberryfruit pericarp tissue. Phytochem. 36: 547-552.
Elez-Martínez, P., Soliva-Fortuny, R.C., Gorinstein, S. and Martín-Belloso, O. (2005). Natural antioxidants preserve the lipid oxidative stability of minimally processed avocado purée. Journal of Food Science. 70(5): 325-329.
Emin Y. (1998). Kinetic Studies with Crude Tomato Lipoxygenase. Turk Journal Agriculture Forestry. 25:291-296.
Grechkin A. (1998). Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. Prog. Lipid Res. 37: 317-352.
Izumi, T., Rådmark, O., Jörnvall, H. and Samuelsson, B. (1991). Purification of two forms of arachidonate 15-lipoxygenase from human leukocytes. Europian Journal Biochemistry. 18:202(3):1231-8. Doi: 10.1111/j.1432-1033.1991.tb16495.x. PMID: 1662607.
Jacobo-Velázquez, D. A., Hernández-Brenes, C., Cisneros-Zevallos, L. and Benavides, J. (2010). Partial purification and enzymatic characterization of avocado (Persea americana Mill, cv. Hass) lipoxygenase, Food Research International. 43: 1079-1085.
Karrer, D., Gand, M., & Rühl, M. (2021). Engineering a lipoxygenase from cyclocybe aegerita towards long chain polyunsaturated fatty acids. AMB Express, 11(1), 37. https://doi.org/10.1186/s13568-021-01195-8
Lauriere, C., Droillard. M.J., Rouet-Mayer, M.A. and Bureau, J.M. (1993). Membrane-associated and soluble lipoxygenase isoforms in strawberrypericarp. Plant Physiology. 103:1211-1219.
Lončarić, M., Strelec, I., Moslavac, T., Šubarić, D., Pavić, V., & Molnar, M. (2021). Lipoxygenase Inhibition by Plant Extracts. Biomolecules, 11(2), 152. https://doi.org/10.3390/biom11020152
Marvian-Hosseini, Z., Asoodeh, A. (2017). Biochemical characterization of purified lipoxygenase from sesame (Sesamum indicum). International Journal of Food Properties, 20(1): 948–958.Marcus, L., Prusky, D. and Jacoby, B. (1998). Purification and characterization of avocado lipoxygenase, Phytochemistry, 27(2): 323-327.
Park, J. Y., Kim, C. H., Choi, Y., Park, K. M., & Chang, P. S. (2020). Catalytic characterization of heterodimeric linoleate 13S-lipoxygenase from black soybean (Glycine max (L.) Merr.). Enzyme and microbial technology, 139:109595. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109595
Richards, K. M., & Marnett, L. J. (1997). Leukocyte 12-lipoxygenase: expression, purification, and investigation of the role of methionine residues in turnover-dependent inactivation and 5, 8, 11, 14-eicosatetraynoic acid inhibition. Biochemistry, 36(22): 6692–6699. https://doi.org/10.1021/bi963051a
Riley, J.C.M., Willemot, C., Thompson, J.E. (1996). Lipoxygenase and hydroperoxide lyase activities in ripening strawberryfruit. Postharvest Biol. Technology. 7: 97-107.
Robinson, D.S., Wu, Z., Domoney, C., Casey, R. (1995). Lipoxygenases and the quality of foods. Food Chemistry. 54: 1, 33-43.
Rosahl, S. (1996). Lipoxygenases in plantss their role in development and stress responses. Z. Naturforch. 51: 123-138.
Saeidi-Sar, S., Khavari-Nejad, R. A., Fahimi, H., Ghorbanli, M. and Majd, A. (2007). Interactive effects of gibberellin A3 and ascorbic acid on lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in Glycine, Russian Hournal of Plant Physiology. 54:74-70.
Singh P, Arif Y, Miszczuk E, Bajguz A, Hayat S. (2022). Specific Roles of Lipoxygenases in Development and Responses to Stress in Plants. Plants (Basel). 4; 11(7):979. Doi: 10.3390/plants11070979. PMID: 35406959; PMCID: PMC9002551.
Surrey, K. (1964). Spectrophotometric method for determination of lipoxidase activity. Plant Physiol. 39: 65-70.
Svendsen, A. (2004). Enzyme Functionality Design, Engineering, and Screening; Marcel Dekker, Inc: New York, USA.
Thompson, J.E., Todd, J.F.and Paliyath, G. (1990). Characterization of a membrane-associated lipoxygenase in strawberryfruit. Plant Physiology. 94: 1225-1232.
Veldink, G.A., Suurmeijer, C.N.S.P., Perez-Gilabert, M., van der Hijden, H.T.W.M. and Vliegenthart, J.F.G. (1998). Purification, product characterization and kinetic properties of soluble strawberry lipoxygenase. Plant Physiol. Biochemistry. 36: 657-663.
Yawer, M. A., Ahmed, E., Malik, A., Ashraf, M., Rasool, M. A. and Afza, N. (2007). New lipoxygenase-inhibiting constituents from Calligonum polygonoids. Chemistry and Biodiversity, 4: 1578-1585.
Zhang, B., Chen, M., Xia, B., Lu, Z., Khoo, K.S., Show, P.L., Lu, F. (2022). Characterization and Preliminary Application of a Novel Lipoxygenase from Enterovibrio norvegicus. Foods, 11:2864. https://doi.org/10.3390/foods11182864
Kinetic studies and quantitative response of lipoxygenase in strawberry during growth and after storage against environmental effects
Shahryar Saeydian1
, Nabi Khaliliaqdam2*, Sattar Qaderi3
1 Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran, Email: Saeedyan@pnu.ac.ir
2 Department of Agriculture, Payame Noor University, Tehran, Iran, Email: nkhaliliaqdam@pnu.ac.ir
3 Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran, Email: zagros8844@gmail.com
Article type: | Abstract | |
Research article
Article history Received: 18.03.2024 Revised: 20.06.2024 Accepted: 28.06.2024 Published:21.03.2025
Keywords Enzyme Linoleic acid Model Substrate | Lipoxygenase is one of enzymes of interest to chemists. This enzyme is a dioxygenase and is responsible for the oxidation of polyunsaturated fatty acids. With special attention to the functioning of this enzyme and its role, the purpose of this investigation is to study the effect of temperature (on 8 levels), organic acids (on 4 levels), inorganic salts (on 3 levels) and determining the concentration of linoleic substrate (on 13 levels) on three types Strawberries (unripe, ripe and stored). The experiment was conducted as a factorial in the form of a completely random design in three replications, and for data analysis, nonlinear regression analysis and interaction effect cutting were used. The results of the research showed that the highest enzyme response to linoleic acid on all three types of unripe, ripe Anbarmani strawberries was 9.42, 9.49 and 10 mM linoleic acid respectively, and based on these results, the level of 10 mM linoleic acid as the level A suitable concentration was considered as the substrate of the enzyme. The results of the effect of temperature on the activity of lipoxygenase enzyme also showed that for all three types of unripe, ripe and stored strawberries, the maximum activity of the enzyme was at 35 degrees Celsius. While the minimum enzyme activity occurred at 80 degrees Celsius for all three types of strawberries. The results of the effect of organic acids on the activity of lipoxygenase enzyme also indicate the significance of this effect. The highest enzyme activity was in the presence of organic compound, tocroferol in all three types of strawberries and the lowest enzyme activity was in the presence of ascorbic acid. The results also confirmed the significant effect of mineral salts on lipoxygenase activity. Thus, the highest enzyme activity in the presence of calcium chloride with a concentration of 0.1 mM and the lowest enzyme activity was related to the concentration of 1 mM calcium chloride. The results generally show the high induction effect of calcium chloride salt, temperature of 35 degrees and the combination of tocroferol with the presence of a substrate with a concentration of 10 mM linoleic acid.
| |
Cite this article as: Saeydian, Sh., Khaliliaqdam, N., Qaderi, S. (2025). Kinetic studies and quantitative response of lipoxygenase in strawberry during growth and after storage against environmental effects. Journal of Plant Environmental Physiology, 77(1): 107-123.
| ||
| ©The author(s) Publisher: Islamic Azad University, Gorgan branch | |
مطالعات سینتیکی و پاسخ کمی لیپواکسیژناز در توتفرنگی در طول رشد و
پس از انبارمانی در برابر اثرات محیطی
شهریار سعیدیان1، نبی خلیلی اقدم*2، ستار قادری 3
1 گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور، نهران، ایران، رايانامه: Saeedyan@pnu.ac.ir
2 گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور، تهران، ایران، رايانامه: nkhaliliaqdam@pnu.ac.ir
3 گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور، نهران، ایران، رايانامه: zagros8844@gmail.com
نوع مقاله: مقاله پژوهشی
تاریخ دریافت: 28/12/1402 تاریخ بازنگری: 01/04/1403 تاریخ پذیرش: 08/04/1403 تــاریخ چاپ:01/01/1404
واژه‌های کلیدی: آنزیم سوبسترا لیپواکسیژناز لینولئیک اسید مدل | چکيده | |
لیپواکسیژناز یکی از آنزیمهای مورد توجه شیمیدانها است. این آنزیم یک دیاکسیژناز بوده و اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع چندگانه را برعهده دارد. این تحقیق با هدف مطالعه اثردما (در 8 سطح)، اسیدهای آلی (در 4 سطح)، نمکهای معدنی (در3 سطح) و تعیین غلظت سوبسترای لینولئیک (در 13 سطح) روی سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده و در شرایط انبارمانی انجام شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. نتایج تحقیق نشان داد که بیشترین پاسخ آنزیم به لینولئیک اسید روی هر سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده وانبارمانی به ترتیب برابر42/9، 49/9 و10 میلیمولار لینولئیک اسید بود. نتایج اثر دما بر میزان فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیز نشان داد که برای هر سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده و انبارمانی، بیشینه فعالیت آنزیم در دمای 35 درجه سانتیگراد بود. درحالیکه کمینه فعالیت آنزیم در دمای 80 درجه سانتیگراد برای هر سه نوع توتفرنگی اتفاق افتاد. نتایج اثر اسیدهای آلی بر میزان فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیزحاکی از معنیدار بودن این اثر بود. بیشترین فعالیت آنزیم در حضور ترکیب آلی، توکروفرول در هر سه نوع توتفرنگی و کمترین فعالیت آنزیم درحضور آسکوربیک اسید بود. نتایج همچنین موید اثر معنیدار نمکهای معدنی روی فعالیت لیپواکسیژناز بود. در بین نمکها، بیشترین فعالیت آنزیم در حضور کلرید کلسیم با غلظت1/0 میلی مولار و کمترین در حضور کلرید سدیم با غلظت 1 میلی مولار بود. نتایج بطور کلی بیانگر اثر القائی بالای نمک کلرید کلسیم، دمای 35 درجه و ترکیب توکروفرول با حضور سوبسترای با غلظت 10 میلیمولار لینولئیک اسید بود.
| ||
استناد: سعیدیان، شهریار؛ خلیلی اقدم، نبی؛ قادری، ستار. (1402). مطالعات سینتیکی و پاسخ کمی لیپواکسیژناز در توتفرنگی در طول رشد و پس از انبارمانی در برابر اثرات محیطی. فیزیولوژی محیطی گیاهی، 77 (1)، 123-107.
| ||
| ناشر: دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرگان © نویسندگان. | |
مقدمه
اکسیداسیون لیپید یک واکنش متابولیکی رایج در تمام سیستمهای بیولوژیکی است که در فرآیندهای تنظیم‌شده رشد و به عنوان پاسخ به تنش‌های غیرزیستی و زیستی ظاهر میشود. محصولاتی که از فرآیندهای اکسیداسیون لیپید به دست می‌آیند در مجموع اکسی‌لیپین نامیده می‌شوند. اکسیداسیون اولیه لیپید ممکن است توسط واکنش‌های شیمیایی رخ دهد یا از عمل آنزیم ها به دست می آید. در گیاهان، این واکنش عمدتاً توسط آنزیمهای لیپوکسیژناز LOXs) کاتالیز میشود. لیپواکسیژناز (LOX ,EC 1.13.11.12، لینولئات: اکسیژن اکسیدوردوکتاز) دی‌اکسیژناسیون اسیدهای چرب را با استفاده از اکسیژن مولکولی کاتالیز میکنند (Riley et al. 1996; Veldink et al. 1998; Carrer et al., 2021). نقش فیزیولوژیکی لیپواکسیژناز در گیاهان مشخص نیست، اگرچه شواهد قابل توجهی وجود دارد که نشان دهنده دخالت آن در زخم و سایر پاسخ های استرسی است.(Rosahl, S. 1996; Singh et al., 2022) فعالیت لیپوکسیژناز همچنین اولین گام در مسیری است که منجر به تشکیل تعدادی از ترکیبات طعم و عطر میشود و نشان داده شده است که در ایجاد طعم‌های غیرعادی در بسیاری از سبزیجات در طول ذخیره‌سازی کمک می‌کند (Barrett, 1995; Lončarić et al., 2021 ). اشکال یا ایزوآنزیم‌های متعددی در بسیاری از بافت‌ها وجود دارد که تفاوت‌هایی را در ویژگی‌های منطقه‌ای، pH بهینه، pI و خواص آنزیمی نشان می‌دهند. بیشتر آنها از یک زنجیره پلی‌پپتیدی منفرد از تقریباً 850 اسیدآمینه با وزن مولکولی متوسط 96 کیلودالتون تشکیل شده‌اند Grechkin, 1998; Cao et al., 2016)). اگرچه نقش عملکردی LOX گیاه هنوز تا حد زیادی ناشناخته است، متابولیت‌های اسیدهای چرب غیراشباع در رشد و نمو، پیری گیاه و پاسخ به بیماری‌ها و زخم‌ها نقش دارند. علاوه بر این، LOX در میوه‌ها و سایر محصولات غذایی گیاهی، در تشکیل ترکیبات طعمی فرار نقش دارد (Veldink et al., 1998; Riley et al., 1996; Ealing, 1994) فعالیت LOX در میوه توتفرنگی هم در سیستمهای غشایی (Thompson et al. 1990, Riley et al., 1996) و هم به صورت محلول (Veldink et al., 1998; Ealing, 1994) گزارش شده است. فعالیت آنزیم توسط سنجش‌های رنگ‌سنجی، مانومتری، پلاروگرافی، اسپکتروفتومتری و نظارت بر بستر نشاندار شده مورد سنجش قرار گرفته است Thompson et al. 1990, Surrey., 1964 Veldink et al. 1998; Shi et al., 2020)). مقادیر متفاوت Km و Vmax به دلیل خلوص و تفاوت های سنجش است.(Thompson et al. 1990; Veldink et al. 1998) در مطالعه حاضر از توتفرنگی LOX خام برای بررسی اثر اشکال مختلف سوبسترا و بافرهای سنجش بر فعالیت آنزیم و همچنین پایداری حرارتی آنزیم در طول رشد و پس از شرایط انبارمانی استفاده شد.
مواد و روش‌ها
توتفرنگی خام و توتفرنگی رسیده رقم کردستان در همان روز برداشت (اردیبهشت 1401) و برای مطالعه به دانشگاه پیام نور کردستان منتقل شد. مقداری از توتفرنگی رسیده قبل از همگن شدن (7 روز) در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) تا مرحله رسیده روی میز نگهداری شد. Tween 20، EGTA (اتیلن گلیکول تترااستیک اسید)، لینولئیک اسید، سوربیتول، MgCl2، PVPP (پلی وینیل پیرولیدون)، DTT (دی تیوتریتول)، PMSF (فنیل متیل سولفونیل فلوراید)، بنزامیدین و اسید آمینوکاپروئیک از سیگما خریداری شد. گلیسرول، اسید بوریک، سدیم فسفات، KOH، NaOH و گلیسین از شرکت بیکر (فیلیپسبورگ، نیوجرسی). تریس (N-trishydroxymethylmethyl glycine)، MES (مورفولینواتان سولفونیک اسید)، EPPS (N-2-Hydroxyethylpiperazine-NÕ-3-propanesulfonic acid)، MOPS (3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid)، Hepes (N-2) – هیدروکسیاتیل‌پیپرازین‌اتان سولفونیک اسید و سدیم استات از آلدریچ شیمی (شرکت میلواکی آمریکا) خریداری شد.
استخراج آنزیمی: توتفرنگی با آب لوله کشی و سپس آب مقطر شسته شد. چند حلقه ضخیم به صورت عرضی در وسط هر میوه بریده شد. این حلقه‌ها بلافاصله در محلول 50 میلی مولار فسفات پتاسیم، pH 7.0، حاوی 1/0 درصد آسکوربات غوطه ور شدند تا از قهوه‌ای شدن بافت جلوگیری شود. در مجموع 500 گرم توتفرنگی در حالت خام، رسیده و پس از ذخیره‌سازی توسط فرآیند آسیاب به طور جداگانه مخلوط شدند. مخلوط حاصل با 800 میلی‌متر بافر فسفات سدیم 50 میلیمولار با pH 7.5 مخلوط شد. هموژن خام تحت همزن مکانیکی در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت با استفاده از پنج پالس (هر کدام 30 ثانیه) از دستگاه سونیکاتور (Qsonica، LLC series XL-2000، (USA)، که در تنظیم توان 5 وات تنظیم شده بود، قرار گرفت. از طریق چهار لایه پنیر فیلتر شده است. سوسپانسیون حاصل در 7000 × گرم به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب دور ریخته شد و مایع رویی دوباره با سولفات آمونیوم جامد تا 60 درصد اشباع تیمار شد و سپس مایع رویی غیرفعال با سانتریفیوژ در 7000 × گرم به مدت 20 دقیقه جداسازی گردید. رسوب حاصل در حداقل مقدار محلول بافر سدیم فسفات (50 میلی مولار) با pH 7.5 که دو بار در برابر همان بافر به مدت 20 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد دیالیز شده بود، مجدداً معلق شد. عصاره دیالیز شده از نظر محتوای پروتئین با روش Bradford (1976) مورد سنجش قرار گرفت. آلبومین سرم گاوی (BSA) بهعنوان استاندارد استفاده شد. هموژن حاصله برای ارزیابی فعالیت لیپواکسیژناز توتفرنگی خام (RW-LOX)، توتفرنگی رسیده(RP-LOX) و فعالیت LOX توتفرنگی پس از ذخیره‌سازی (ST- LOX) استفاده شد.
تعیین پروتئین: تعیین پروتئین عصاره بر اساس روش Bradford (1976) انجام شد. منحنی کالیبراسیون با IgG (گاما گلوبولین پلاسما گاوی) به عنوان استاندارد تعیین شد.
اسیدیته بهینه: pH بهینه برای اسید لینولئیک در 5/6 رخ می‌دهد، در حالی که برای اسید لینولنیک 75/6 است. pH بهینه آنزیم LOX از منابع دیگر در محدوده وسیع pH 5.5 - 9.5 برآورد شده است. تعیین pH بهینه آنزیم در حضور بافر استات 1/0 مولار در pH های مختلف محلول ها انجام شد (Elez-Martínez, et al., 2005; Zhang et al., 2022; Marcus et al. 1988).
دمای مطلوب: اثرات دما (20 - 75 درجه سانتیگراد) بر فعالیتهای LOX نیز تعیین شد. با توجه به اینکه توتفرنگی در آب و هوای معتدل و معتدل رشد می‌کند، دمای مطلوب برای فعالیت LOX بین 30 درجه سانتیگراد تا 40 درجه سانتیگراد، همانطور که در کار حاضر یافت شد، انتظار می‌رفت. از آنجایی که پردازش حرارتی یا قرار گرفتن طولانی مدت در معرض دماهای بالا احتمالاً تغییرات ارگانولپتیکی نامطلوب را در توتفرنگی ایجاد می‌کند، استفاده از دمای بالا یک استراتژی موثر برای غیرفعال کردن جزئی LOX است.
آماده سازی بستر: بستر لینولئیک اسید به سه شکل مختلف تهیه شد. در اولین آماده سازی، 5/0 میلی‌متر تویین 20 در 10 میلی لیتر بافر بورات 1/0 مولارpH=9 حل شد. سپس 5/0 میلی‌متر اسید لینولئیک در حین اختلاط قطره به قطره اضافه شد. با بستن فلاسک از هوای اضافی جلوگیری شد. در نهایت، 3/1 میلی‌متر NaOH 1 N اضافه شد و تا زمانی که یک محلول شفاف به دست آمد، هم زده شد. 90 میلی‌متر بافر بورات اضافه شد و حجم کل با آب به 200 میلی‌متر رسید. آماده سازی سوبسترای دوم بر اساس حل کردن مقدار مساوی اسید لینولئیک (5/0 میلی‌متر) در 200 میلی لیتر متانول بدون افزودن مواد شوینده یا بافر بود. در آماده سازی سوم، 5/0 میلی‌متر اسید لینولئیک در 20 میلی‌متر متانول حل شد و به 180 میلی‌متر مخلوط بافر بورات تویین 20 با همین نسبت‌ها اضافه شد. همچنین، برای تهیه بستر اول، نسبت اسید لینولئیک به توئین 20 (1:0، 1:1، 1:1.5 و 1:2) ارزیابی شد.
سنجش LOX: برای تعیین فعالیت LOX از اسپکتروفتومتر جنوی (محدوده 190-820 نانومتر با پهنای باند 2 نانومتر) استفاده شد. روش سنجش از رایلی و همکاران (1996) اقتباس شده است. افزایش جذب در 234 نانومتر به مدت 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد به دنبال افزودن 1 میلی‌متر محلول سوبسترا به یک کووت حاوی 1 میلی‌متر عصاره آنزیمی خام و 1 میلی‌متر بافر سنجش (1/0 مولار سدیماستات، pH=5.0؛ 150 میلیمولار (MES) دنبال شد. pH=6.0، 50 میلیمولار MOPS، pH=7.0؛ 2/0 میلیمولار Hepes-KOH، pH=7.5، 150 میلیمولار EPPS-KOH، pH=8.0، 150 میلیمولار Tris-HCl، pH=8.5؛ 1/0 مولار بورات، pH=9و 50 میلیمولار گلیسین-KOH، pH=9.6)). فعالیت اختصاصی آنزیم به عنوان مقدار آنزیمی که در یک دقیقه یک واحد تغییر جذب می کند تعریف میشود. با استفاده از همان روش سنجش با تهیه بستر اول با نسبت LA:Tween 20:1:1.5، مقادیر Vmax و Km نیز با غلظت‌های مختلف بستر (6/4-1/72 میلیمولار) تعیین شد.
فعالیت دما و تعیین پایداری حرارتی: برای تعیین دمای بهینه برای فعالیت آنزیم، سنجش LOX در دمای 80-25 درجه سانتیگراد در بافر50 میلی مولار Tris-HCL، (pH 8.0) با فواصل 5 درجه سانتیگراد انجام شد. برای ارزیابی پایداری حرارتی، محلول آنزیم به مدت 30 دقیقه در حمام آب از 25 درجه سانتیگراد تا 80 درجه سانتیگراد انکوبه شد و سپس واکنش مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. در نهایت فعالیت LOX باقی مانده اندازه‌گیری شد. آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد. برای تعیین نیمه عمر(t1/2)، محلول آنزیمی حاوی 220 U/mg تا 60 دقیقه در شرایط بهینه در دماهای 25 درجه سانتیگراد، 30 درجه سانتیگراد، 35 درجه سانتیگراد، 40 درجه سانتیگراد و 45 درجه سانتیگراد انکوبه شد. برای هر بازه 30 دقیقهای، 20 میکرولیتر از نمونه برای بررسی فعالیت باقیمانده گرفته شد. میزان فعالیت در شروع سنجش 100% در نظر گرفته شد. در نهایت، نتایج فعالیت باقیمانده در برابر زمان انکوباسیون به تصویر کشیده شد.
آزمایش مهاری لیپوکسیژناز در شرایط آزمایشگاهی: مهار فعالیت لیپوکسیژناز با روش اسپکتروفتومتری گزارش شده توسط Yawer و همکاران تعیین شد (2007). مخلوط واکنش، حاوی محلول ترکیب آزمایشی (محلول مهار)، محلول لیپوکسیژناز در بافر فسفات 1/0 مولار (pH 8.0) به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس واکنش با افزودن سوبسترا آغاز شد. پس از 6 دقیقه، مقدار جذب در طول موج 234 نانومتر اندازه‌گیری شد. از کوئرستین به عنوان مهارکننده استاندارد استفاده شد. درصد مهار فعالیت لیپوکسیژناز به صورت زیر محاسبه شد:
مهار (%) = (1-A/B) x 100
در جایی که A فعالیت آنزیم بدون بازدارنده است، B فعالیت در حضور بازدارنده است. IC50 به عنوان غلظت عصاره های گیاهی و داروهای شیمیایی مورد نیاز برای مهار فعالیت لیپوکسیژناز تا 50٪ تعیین شد.
محلی‌سازی بافت فعالیت LOX: عصاره آنزیمی خام از بافت پریکارپ تهیه شد و برای تمام سنجش‌های فوق استفاده شد. علاوه بر این، از پوست توتفرنگی ، ماده ژل موضعی و میوه کامل برای مقایسه توزیع فعالیت بافت استفاده شد. تجزیه و تحلیل آماری روشهای آماری با استفاده از سیستم تجزیه و تحلیل آماری (SAS Institute، Cary، (NC انجام شد. اثر فعالیت ویژه LOX توسط آماده‌سازی‌های زیرلایه‌های مختلف با استفاده از ANOVA با جداسازی میانگین‌ها توسط آزمون چند دامنه‌ای DuncanÕs تعیین شد. تجزیه و تحلیل رگرسیون در نمودار دوگانه متقابل بهترین خط مستقیم برازش را تعیین کرد. همه اندازه‌گیری‌ها دو بار انجام شد و نتیجه گزارش‌شده میانگین آن دو بود. سطح معنی‌داری برای همه آزمون‌ها 5 درصد بود.
اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم: بررسی اثرات یونهای فلزی بر فعالیت لیپواکسیژناز RW-LOX، RP-LOX و ST-LOX، برخی از ترکیبات شیمیایی مانند یون تکظرفیتی(NaCl)، یونهای دوظرفیتی (ZnCl2، CaCl2، FeCl2 و MgCl2) و یون سهظرفیتی (Fecl3) انتخاب شدند. غلظت‌های اعمال شده این یون‌ها در بافر 50 میلیمولار Tris-HCL در pH 7.5 تهیه شدند. غلظت یونهای فلزی تهیه شده 1/0، 5/0 و 1 میلیمولار بود. مخلوط مورد سنجش به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و در نهایت فعالیت RW-LOX، RP-LOX و ST-LOX به طور جداگانه اندازه‌گیری شد. سنجش مخلوط بدون یونهای فلزی به عنوان 100 درصد فعالیت در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج برازش سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله نارس توتفرنگی نشان داد که روند اثر لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز از یک تابع دو تکهای تبعیت می‌کند. بدین ترتیب که با افزایش سطوح لینولئیک اسید، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز تا حد 10 میلیمولار اسید لینولئیک افزایش و پس از آن یک روند نزولی بهخود می‌گیرد. میزان فعالیت متناظر آنزیم لیپوکسیژناز درنقطه x0=10، 9/0 درونیابی شد (جدول 1). شیب افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در قسمت اول مدل، 082/0 و در قسمت دوم مدل، 019/0 واحد پروتئین بر میلیمولار لینولئیک اسید بدست آمد. تغییر روند منحنی برازش سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله نارس حاکی از پاسخ متفاوت سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز است و با این تفاسیر بیشینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در غلظت 10 میلیمولار لینولئیک اسید بود (شکل 1).
|
شکل 1: برازش اثر سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مرحله نارس.
تجزیه رگرسیون غیرخطی سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله رسیدگی توتفرنگی نیز با توجه به کمی بودن سطوح لینولئیک اسید نشان داد که روند اثر لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله رسیدگی پیرو یک تابع دو تکهای است. بدین ترتیب که با افزایش سطوح لینولئیک اسید، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز تا حد 49/9 میلیمولار اسید لینولئیک افزایش و پس از آن تغییرات بصورت کاهشی است. میزان فعالیت متناظر آنزیم لیپوکسیژناز در نقطه x0=9.49، 894/0 درونیابی شد (جدول 1). شیب افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در قسمت اول مدل، 091/0 و در قسمت دوم مدل، 006/0 واحد پروتئین بر میلیمولار لینولئیک اسید بدست آمد. تغییر روند منحنی برازش سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله رسیدگی نیز حاکی از پاسخ متفاوت سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز است و با این تفاسیر بیشینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در غلظت 49/9 میلیمولار لینولئیک اسید درونیابی گردید (شکل 1)
.
شکل 2: برازش اثر سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مرحله رسیدگی.
تجزیه رگرسیون غیرخطی سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله انبارمانی توتفرنگی نیز با توجه به کمی بودن سطوح لینولئیک اسید، نشان داد که روند اثر لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله رسیدگی از یک تابع غیرخطی (دوتکه‌ای) پیروی می‌کند. بدین ترتیب که با افزایش سطوح لینولئیک اسید، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز تا حد 42/9 میلیمولار اسید لینولئیک افزایش و پس از آن تغییرات بصورت کاهشی است. میزان فعالیت متناظر آنزیم لیپوکسیژناز درنقطه x0=9.49، 894/0 درونیابی شد (جدول 1). شیب افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در قسمت اول مدل، 109/0 و در قسمت دوم مدل، 014/0 واحد پروتئین بر میلیمولار لینولئیک اسید بدست آمد. تغییر روند منحنی برازش سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله انبارمانی نیز حاکی از پاسخ متفاوت سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز است و با این تفاسیر بیشینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در غلظت 42/9 میلیمولار لینولئیک اسید درونیابی گردید (شکل 1).
شکل 3: برازش اثر سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز اکسیداز در مرحله انبارمانی.
جدول 1: نتایج برازش مدل دوتکه ای بر اثر سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز در مراحل مختلف رسیدگی.
|
|
|
| تیمار | مدل دو تکه ای |
9/0 | 019/0 | 082/0 | 10 | خام | Y=a+b1 |
894/0 | 006/0 | 091/0 | 49/9 | رسیده | /Y=a+b2x |
15/1 | 014/0 | 109/0 | 24/9 | انبار |
|
بررسی پاسخ فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز به سطوح کمی لینولئیک اسید در هر سه مرحله نارس، رسیدگی و انبارمانی، حاکی از پاسخ متفاوت فعالیت این آنزیم به سطوح مختلف لینولئیک اسید در سه مرحله نارس، رسیدگی و انبارمانی بود (جدول 1). بدین مضمون که در بخش افزایشی مدل (Y=a+b1
)، شیب افزایش فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز درمرحله انبارمانی بیشتر از دو مرحله نارس و رسیدگی بود (b1=0.109). اما در بخش دوم مدل (Y=a+b2x) که بصورت یک روند نزولی بود، شیب کاهش فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز با افزایش سطوح غلظت لینولئیک اسید در مرحله نارس بیشتر از دو مرحله دیگر بود (b2=0.019). برپایه نتایج این بخش از تحقیق، در بخشهای دیگر آزمایش از سطح غلظتی 10 میلیمولار لینولئیک اسید بهعنوان بهترین غلظت لینولئیک اسید و همچنین بعنوان سوبسترا استفاده شد.
جدول 2: تجزیه واریانس اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
منابع تغییرات |
| درجه آزادی |
| میانگین مربعات |
| Pmodel |
تکرار |
| 2 |
| 1422 |
| 07/0 |
دما |
| 7 |
| 61/18491 |
| 001/0 |
سطوح انبار |
| 2 |
| 26/156 |
| 001/0 |
سطوح انبار ×دما |
| 14 |
| 75/135 |
| 001/0 |
خطا |
| 46 |
| 0068/0 |
|
|
جدول 3: مقایسه میانگین اثر متقابل اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
سطوح دما (درجه سانتیگراد) | انبار | رسیده | خام |
25 | 70/106 d | 33/103 d | 33/105 c |
30 | 7/120 b | 119 b | 3/116 b |
35 | 141 a | 66/138 a | 119 a |
40 | 7/115 c | 33/110 c | 66/104 c |
50 | 91 e | 33/85 e | 33/84 d |
60 | 66/77 f | 70 f | 64 e |
70 | 7/20 g | 33/38 g | 41 f |
80 | 0 h | 1 h | 33/1 g |
LSD(0.05) | 42/1 | 68/1 | 37/1 |
نتایج تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف دمایی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در سطوح مختلف نارس، رسیدگی و انبارمانی توتفرنگی نشان داد که اثر دما و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز معنیدار بود. ضمن اینکه اثر متقابل دما و سطوح مختلف رسیدگی نیز در سطح یک درصد معنیدار گردید (جدول 2). برهمین پایه و با توجه به معنیدار شدن اثر متقابل دما و سطوح مختلف رسیدگی، نتایج برش‌دهی اثر متقابل نشان داد که در مرحله نارس، بیشینه فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز در دمای 35 درجه سانتیگراد و کمترین فعالیت آنزیم در دمای 80 درجه سانتیگراد اتفاق افتاد (جدول 3). در مرحله رسیدگی نیز مشابه با مرحله نارس، بیشترین فعالیت آنزیم مربوط به دمای 35 درجه سانتیگراد بود و به همین ترتیب در انبارمانی نیز بیشنه و کمینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز به ترتیب در دمای 35 و 80 درجه سانتیگراد بدست آمد.
نتایج تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف اسیدهای آلی (توکروفرول، بنزوئیک اسید، نیکوتامین و آسکوربیک اسید) بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در سطوح مختلف نارس، رسیدگی و انبارمانی توتفرنگی نشان داد که اثر اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز معنیدار بود. ضمن اینکه اثر متقابل اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی نیز در سطح یک درصد معنیدار شد (جدول 4). نتایج برش دهی اثر متقابل اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیز نشان دادکه توکروفرول در هر سه سطح رسیدگی دارای بیشینه تاثیر بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز بوده است (جدول 5). کمینه فعالیت آنزیم نیز در هر سه مرحله مورد بررسی مربوط به آسکوربیک اسید بود. اختلاف مقادیر بیشینه و کمینه اثر توکروفرول و آسکوربیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز بسیار زیاد و بعنوان مثال در مرحله نارس حدود 14/32 برابر بیشتر بود.
جدول 4: تجزیه واریانس اثر اسیدهای آلی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
منابع تغییرات |
| درجه آزادی |
| میانگین مربعات |
| Pmodel |
تکرار |
| 2 |
| 08/0 |
| 274/0 |
اسید آلی |
| 3 |
| 43/31 |
| 001/0 |
سطوح انبار |
| 2 |
| 555/0 |
| 001/0 |
سطوح انبار ×اسید آلی |
| 6 |
| 150/0 |
| 001/0 |
خطا |
| 22 |
| 0062/0 |
|
|
جدول 5: مقایسه میانگین اثر متقابل اثر اسیدهای آلی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
تیمارها | انبار | رسیده | خام |
توکروفرول | 7/3 a | 1/4 a | 5/4 a |
بنزوئیک اسید | 1/2 b | 46/2 b | 93/2 b |
نیکوتیامین | 393/0 c | 41/0 c | 44/0 c |
آسکوربیک اسید | 113/0 d | 12/0 d | 14/0 d |
LSD (0.05) | 152/0 | 13/0 | 16/0 |
نتایج تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف نمکهای معدنی (کلرید کلسیم، کلرید سدیم و کلرید روی، هر کدام در سه سطح غلظتی) بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در سطوح مختلف نارس، رسیدگی و انبارمانی توتفرنگی نشان داد که اثر نمکهای معدنی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز معنیدار بود. همچنین اثر متقابل نمکهای معدنی و سطوح مختلف رسیدگی نیز در سطح یک درصد معنیدار شد (جدول 6). نتایج برش دهی اثر متقابل اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیز نشان دادکه برای هر نمک آلی بیشینه اثر بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز مربوط به سطح غلظتی 1 میلیمولار نمک بود و کمینه اثر در هر سطح غلظتی از هر نمک مربوط به غلظت 1/0 میلیمولار نمک بود. بعبارت دیگر غلظت بالاتر نمک اثر بیش‌تری بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز داشته است. از طرفی در مقایسه بین نمکها، بیشترین فعالیت آنزیم در حضور کلریدکلسیم 1/0 میلیمولار و کمترین فعالیت در کلرید سدیم یک میلیمولار بدست آمد. در بین سطوح مختلف رسیدگی (نارس، رسیدگی و انبارمانی) نیز بیشترین فعالیت آنزیم در تیمار انبارمانی مشاهده شد (جدول 7).
جدول 6: تجزیه واریانس اثر نمکهای معدنی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
منابع تغییرات | درجه آزادی | میانگین مربعات | Pmodel |
تکرار | 2 | 86/1 | 134/0 |
نمکهای معدنی | 8 | 27/8078 | 001/0 |
سطوح انبار | 2 | 76/1756 | 001/0 |
سطوح انبار ×نمک معدنی | 16 | 65/20 | 001/0 |
خطا | 32 | 87/1 |
|
جدول 7: مقایسه میانگین اثر متقابل اثر نمکهای معدنی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
نمکهای معدنی در انبار | سطوح | انبار | رسیده | خام |
CaCl2 | 1/0 | 6/154 a | 6/144 a | 135 a |
5/0 | 6/135 b | 122 b | 115 b | |
1 | 3/108 c | 98 c | 92 c | |
ZnCl2 | 1/0 | 66/94 d | 88 d | 82 d |
5/0 | 33/85 e | 6/80 e | 77 e | |
1 | 66 g | 3/62 g | 54 h | |
NaCl2 | 1/0 | 3/85 e | 33/79 e | 70 f |
5/0 | 33/76 h | 33/71 f | 60 g | |
1 | 33/61 i | 33/55 h | 40 i | |
LSD (0.05) |
| 63/1 | 68/1 | 1/16 |
جدول 8: تجزیه واریانس فعالیت سینتتیکی آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
منابع تغییرات منابع تغییرات |
| درجه آزادی |
| میانگین مربعات | ||
|
|
|
| انبار | رسیده | خام |
تکرار |
| 2 |
| 0012/0** | 398/0 | 1077/0** |
تیمار |
| 2 |
| 0052/0** | 1167/0 | 617/1** |
خطا |
| 4 |
| 00004/0 | 0340/0 | 0011/0 |
جدول 9: مقایسه میانگین پارامترهای سنتتیکی آنزیم لیپوکسیژناز اکسیداز در مراحل مختلف رسیدگی.
صفات/تیمار | Catalytic efficiency | Vmax | Km |
خام | 126/0 c | 23/1 a | 636/6 a |
رسیده | 16/0 b | 94/0 a | 966/5 b |
انبار | 21/0 a | 85/0 a | 166/5 c |
LSD (0.05) | 150/0 | 418/0 | 756/0 |
نتایج تجزیه واریانس بررسی فعالیت سینتتیکی آنزیم لیپوکسیژناز براساس مدل مکائیلیس منتن نشان داد که اثر مراحل مختلف انبارمانی بر ثابت مکائیلیس منتن و کارایی کاتالیتیکی آنزیم معنی دار بود در حالیکه اثر آن بر سرعت واکنش آنزیم معنیدار نشد (جدول 8). به بیان دیگر براساس نتایج مقایسه میانگین بیشینه ضریب ثابت مدل در فرم نارس توتفرنگی و کمینه آن در زمان انبارمانی میوه توتفرنگی رخ داد (جدول 9) و بالعکس حداکثر کارائی کاتالیتیکی مدل در زمان انبارمانی میوه و کمترین مقدار کارائی کاتالیتیکی در فرم نارس میوه توتفرنگی اتفاق افتاد. این درحالی بود که با وجود اختلاف در سرعت واکنش آنزیم در سطوح مختلف انبارمانی، اما اختلاف بین سرعت واکنش آنزیم در حالت‌های مختلف انبارمانی میوه توتفرنگی، به لحاظ آماری معنیدار نشد.
بحث
لیپواکسیژناز دسته ای از آنزیمهای حاوی آهن به حساب آمده که فرایند کاتالیز اکسیژناسیون اسیدهای چرب از نوع غیراشباع را بر عهده دارند. آنزیم لیپواکسیژناز درگیاهان، جانوران و قارچ‌ها وجود دارند. بیشتر لیپواکسیژنازهای گزارش شده در جانوران، لیپواکسیژناز مختص اسیدآراشیدونیک هستند. آنزیم فسفولیپاز، فسفولیپیدهای استریفیه داخل غشای سلولی را به اسید آراشیدونیکی تبدیل نموده که خود از نوع غیراستریفیه می‌باشند. در ادامه آنزیم سیکلواکسیژناز اسید آراشیدونیک را به پروستاگلاندین تبدیل نموده که پیش‌سازی برای بیوسنتز دیگرپروستاگلاندین‌ها به حساب می‌آیند. آنزیم لیپواکسیژناز موجب تبدیل آرشیدونیک اسید به لکوترینها میشود. از این رو مطالعه در مورد جزئیات مکانیسمی این دسته از آنزیم‌ها و متابولیسم محصولات پراکسیدی آنها و همچنین بررسی مهارکننده‌های مناسب برای آنزیمهای مذکور بسیار حائز اهمیت می‌باشد. در این مطالعه، از میان بافرهای سنجش ارزیابی شده، Tris-HCl (pH 7.5) از نظر فعالیت ویژه LOX خام بهترین بود. بافرهایMOPS (pH 7.0) و MES (pH 6.0) نیز در حد مناسبی جهت انجام فعالیت آنزیمی مناسب نشان دادند، در حالی که بافرهای Borate (pH 9.0) و Glycine-KOH (pH 9.6) کمترین فعالیت آنزیم را داشتند. بررسی سینتیکی آنزیم لیپواکسیژناز به جهت خالص‌سازی انسانی از لوکوسیت‌های انسانی نیز با استفاده از بافرTris-HCl (pH 7.5) انجام شده است (Richards et al., 1997; Park et al., 2020). مقدار pH بهینه در حدود 6- 5/6 در چندین مطالعه گزارش شده است (Thomson et al. 1990, Lauriere et al. 1993, Ealing, 1994). آنالیز فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز دانه کنجد نیز نشان داد که pH بهینه آنزیم 7 است و فعالیت آنزیم در محدودهpH های اسیدی و قلیایی کاهش یافته است (Marvian-Hosseini and Asoodeh, 2014). مقدار بسیار کم فعالیت در بافر بورات ممکن است به دلیل pH (9.0) و ماهیت آن (بافر غیرآلی) باشد. پنج بافر با مقادیر pH مختلف که برای فعالیت خاص LOX ارزیابی شدند، همگی مقادیر متفاوتی را نشان دادند، و بافر Tris-HCl برای آنالیزهای بعدی انتخاب شد. اولین آماده‌سازی با نسبت 1:1 لینولئیک اسید: توئین 20 و 1:1 لینولنیک اسید:توئین 20 به ترتیب فعالیت ویژه 83/0 و 75/0 واحد بر میلی‌گرم پروتئین را نشان دادند. بنابراین از نتایج می‌توان چنین استنباط کرد که وقتی اسید لینولئیک و لینولنیک میسل‌هایی با مقدار کافی توئین 20 تشکیل می‌دهند، مناسب‌ترین آنها برای واکنش هستند، در حالی که مقادیر بسیار زیاد و کم ماده شوینده (توئین 20) می‌تواند باعث حلالیت و انتشار شود. بر اساس این نتایج، سوبستراهای با نسبت 1:1 لینولئیک اسید: توئین 20 و اسید لینولنیک: توئین 20 برای بقیه آنالیزها انتخاب شد. لیپواکسیژنازها نقش بارزی در طی جوانه زنی داشته که منجر به اکسیداسیون خاص لیپیدهای ذخیره‌ای و شروع مصرف لیپیدها به عنوان منبع انرژی و کربن مورد نیاز جهت رشد گیاه دارند. در گیاهان، اسید لینولئیک و لینولنیک به عنوان بسترهای LOX عمل میکنند. LOX واسطه بیوسنتز JA است و به عنوان بیومارکر استرس در برابر استرس‌های قارچی، باکتریایی، آفات و عوامل غیر زنده از جمله نمک، گرما، سرما، خشکسالی و تشعشع عمل می‌کند. علاوه بر این، LOX همچنین باعث جوانه زدن بذر، رشد و تشکیل گامتوفیت نر میشود (Singh et al., 2022). نتایج برازش سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله نارس توتفرنگی بیانگر این موضوع است که با افزایش سطوح غلظتی لینولئیک اسید، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز تا حد 10 میلیمولار اسید لینولئیک با افزایش همراه بوده و در ادامه یک روند نزولی را نشان می‌دهد (شکل 1). درونیابی میزان فعالیت متناظر آنزیم لیپوکسیژناز نشان‌دهنده تغییر روندی است که منحنی برازش سطوح غلظتی لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله نارس نشان می‌دهد که بیانگر پاسخ متفاوت سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در مرحله نارس بوده، به گونهای که بیشینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در غلظت 10 میلیمولار لینولئیک حاصل آمد.
همین بررسیها در مرحله پس از ذخیره سازی و انبارمانی توتفرنگی بر اساس کمی بودن سطوح لینولئیک اسید یک روند تابع غیرخطی(دو تکهای) را نشان داد که درونیابی میزان فعالیت متناظر آنزیم لیپوکسیژناز بیانگر تغییر روند منحنی برازش در مرحله انبارمانی و نیز بیانگر پاسخ متفاوت سطوح مختلف لینولئیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز می باشد. بر اساس نتایج حاصله پاسخ فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز به سطوح کمی لینولئیک اسید در هر سه مرحله نارس، رسیدگی و انبارمانی، بیانگر پاسخ متفاوت فعالیت این آنزیم به سطوح مختلف لینولئیک اسید در هر سه مرحله است به گونهای که شیب کاهش فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز با افزایش سطوح غلظت لینولئیک اسید در مرحله نارس بیشتر از دو مرحله دیگر بود (b2=0.019). برپایه نتایج این بخش از تحقیق، در بخشهای دیگر آزمایش از سطح غلظتی 10 میلیمولار لینولئیک اسید بهعنوان بهترین غلظت لینولئیک اسید و همچنین بهعنوان سوبسترا استفاده شد. در بررسی پایداری حرارتی آنزیم در دماهای مختلف در شرایط خام، لیپواکسیژناز در توتفرنگی نارس به سرعت در دمای 80-70 درجه سانتیگراد غیرفعال شد که دلیلی بر حفظ ساختار آنزیمی لیپوکسیژناز و مقاومت ساختاری آنزیم در دماهای بالا است به گونهای که در دمای 70 تا 80 درجه سانتیگراد ساختار آنزیم کامل دناتوره شده و فعالیت آنزیم از بین می‌رود. بر اساس نتایج حاصله LOX خام در محدوده دمای اتاق فعال است و فعالیت بیش‌تری تا دمای 40 درجه سانتیگراد به دست می‌آید که به طور طبیعی روی سوبستراها عمل می‌کند. با افزایش زمان نگهداری، اثر حرارتی بر ساختار LOX منجر به کاهش کم‌تری در فعالیت آنزیم در مقایسه با RP-LOX و RP-LOX شد، بنابراین با افزایش زمان نگهداری تا 7 روز، پایداری آنزیم افزایش یافت. نتایج تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف دمائی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در سطوح مختلف نارس، رسیدگی و انبارمانی توتفرنگی نشان داد که اثر دما و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز معنیدار بود. ضمن اینکه اثر متقابل دما و سطوح مختلف رسیدگی نیز در سطح یک درصد معنی‌دارگردید. برهمین پایه و با توجه به معنیدار شدن اثر متقابل دما و سطوح مختلف رسیدگی، نتایج برش‌دهی اثر متقابل، بیانگر این مساله است که در مرحله نارس، بیشینه فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز در دمای 35 درجه سانتیگراد و کمترین فعالیت آنزیم در دمای 80 درجه سانتیگراد اتفاق افتاد. در مرحله رسیدگی نیز مشابه با مرحله نارس، بیشترین فعالیت آنزیم مربوط به دمای 35 درجه سانتیگراد بود و به همین ترتیب در انبارمانی نیز بیشنه و کمینه فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز به ترتیب در دمای 35 و 80 درجه سانتیگراد بدست آمد. لذا می‌توان نتیجه گرفت که این آنزیم در برابر گرما نسبتا مقاوم است چرا که نگهداری آنزیم تا دمای 35 درجه حتی با افزایش فعالیت و افزایش مقاومت نیز همراه است و افزایش درجه حرارت محیط واکنش و محیط نگهداری در 45 درجه و به بالا باعث تخریب ساختار واکنش‌گر آنزیم شده و فعالیت آن را کاهش داده است. دمای بهینه آنزیم نیز 35 درجه سانتیگراد حاصل گردید. از آنجا که لیپواکسیژناز موجود در توتفرنگی در دماهای 30 تا 40 درجه از خود مقاومت بیشتر نشان داده به گونهای که حتی با افزایش فعالیت همراه هستند لذا در بسیاری از کارهای کاربردی در صنعت هم می تواند مورد استفاده و بهرهبرداری هم قرار گیرد.
به طور مشابه با نتایج این تحقیق، آنالیز انجام شده بر روی لیپواکسیژناز دانه کنجد نشان داد که دمای اپتیمم آنزیم با توجه به آزمایشات انجام شده 35 درجه سانتیگراد در نظر گرفته میشود. آنزیم در محدوده دمایی 20 تا 60 درجه سانتیگراد پایداری نشان داد در حالیکه کاهش شدید فعالیت آنزیم در 65 درجه سانتیگراد مشاهده شد .(Emin, 2008) مقایسه خواص بازدارندگی اسید بنزوئیک، اسید اسکوربیک و اسید نیکوتین و توکوفرول بر فعالیت لیپوکسیژناز توتفرنگی RW-LOX، RP-LOX و ST-LOX با استفاده از اسید لینولئیک به عنوان یک سوبسترا نشان داد که همه ترکیبات میل ترکیبی به کمپلکس سوبسترا-آنزیم نشان دادند. اسید اسکوربیک بالاترین فعالیت مهاری LOX را دارد. مقدار IC50 روند ST-LOX< RP-LOX<RW-LOX را نشان داد. آلفا-توکوفرول کمترین فعالیت بازدارنده لیپواکسیژناز را دارد، به ترتیب 6/4، 4 و 7/3 میلیمولار برای RW-LOX، RP-LOX و ST-LOX حاصل شد. فعالیت مهاری لیپوکسیژناز ترکیبات شیمیایی و ترکیب استاندارد به ترتیب اسید اسکوربیک > اسید نیکوتینیک > اسید بنزوئیک > DL-α- توکوفرول کاهش یافت. خطوط موازی برای مهار LOX توسط اسید آسکوربیک در
RW-LOX، RP-LOX و ST-LOX مشاهده شد. این اسید ماهیت مهارکننده‌های غیررقابتی را نشان داد. اسید بنزوئیک و اسید نیکوتین و DL-α- توکوفرولول مهارکننده‌های غیر رقابتی بودند. نتایج تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف اسیدهای آلی(توکروفرول، بنزوئیک اسید، نیکوتامین و آسکوربیک اسید) بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در سطوح مختلف نارس، رسیدگی و انبارمانی توتفرنگی نشان داد که اثر اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز معنیدار بود. ضمن اینکه اثر متقابل اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی نیز در سطح یک درصد معنیدار شد. نتایج برش‌دهی اثر متقابل اسیدهای آلی و سطوح مختلف رسیدگی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نیز نشان دادکه توکروفرول در هر سه سطح رسیدگی دارای بیشنه تاثیر بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز بوده است. کمینه فعالیت آنزیم نیز در هر سه مرحله مورد بررسی مربوط به آسکوربیک اسید بود. اختلاف مقادیر بیشینه و کمینه اثر توکروفرول و آسکوربیک اسید بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز بسیار زیاد و بعنوان مثال در مرحله نارس حدود 14/32 برابر بیشتر بود. به طور مشابه در گیاه سویای تحت تنش نیکل نیز کاربرد آسکوربیک اسید باعث کاهش فعالیت لیپوکسیژناز و در نتیجه کاهش میزان پراکسیداسیون لیپید شد (Saeidi-Sar et al., 2007). از آنجایی که برخی از یونهای فلزی به عنوان کوآنزیم یا کوفاکتور برای آنزیمهای مختلف مانند LOX شناخته شده‌اند.
نتایج بررسی اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نشان داد که یون دو ظرفیتی مانند Cacl2، فعال‌کننده لیپواکسیژناز می‌باشد و به ویژه در غلظت 1/0 میلی‌ولار Cacl2 فعالیت لیپواکسیژناز افزایش یافت و در مقایسه با شاهد (بدون یونهای فلزی) به 135، 148 و 128 درصد رسید. با افزایش غلظت Cacl2 تا 5/0 و 1 میلیمولار، فعالیت لیپواکسیژناز کاهش یافت، اما فعالیت آنها بالاتر از شاهد بود. فعالیتRW-LOX ، RP-LOX و ST- لیپواکسیژناز در حضور 1/0، 5/0 و 1 میلیمولار Nacl کاهش یافت، بنابراین برای RW-LOX به 70، 60 و 40 درصد و برای RP-LOX به 80، 71 و 55 درصد و برای ST-LOX به ترتیب به 85، 76 و 62 درصد رسید. حداکثر فعالیت لیپوکسیژناز برای توتفرنگی پس از ذخیره سازی در حضور کلرید کلسیم و حداقل فعالیت لیپوکسیژناز برای RW-LOX در حضور Nacl 1 میلیمولار به دست آمد. طبق نتایج حاصله، یونهای تک ظرفیتی و سه ظرفیتی مهارکننده‌های لیپواکسیژناز و یونهای دو ظرفیتی به‌جز Zncl2 فعال‌کننده‌های لیپواکسیژناز هستند. فعال شدن لیپوکسیژناز توتفرنگی در حضور یونهای فلزی به ترتیب Cacl2>Zncl2>Nacl بود. نتایج سایر محققان نیز موید این نتایج بود (Aberomand et al., 2013). بر اساس آنالیز لیپواکسیژناز دانه کنجد توسطMarvian-Hosseini and Asoodeh (2014) اثر یون دو ظرفیتی آهن (Fe2+) بر افزایش فعالیت آنزیم با توجه به کاهش جذب در طول موج 660 نانومتر مشاهده گردید، در حالیکه فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز در حضور کاتیون آهن (Fe3+) کاهش یافت و همچنین فعالیت آنزیم با انکوباسیون در حضور یون روی افزایش و در حضور یون کبالت کاهش یافت. در نمودار مایکلیس منتون توتفرنگی فعالیت آنزیم لیپواکسیژناز در حالت میوه نارس، داده‌ها برای تعیین بهترین برازش خط هذلولی نظری تجزیه و تحلیل شد. نتایج مقایسه، ثابت میکائیلیس آنزیم 5/6 میلیمولار با مقدار Vmax 0.9 واحد بر میلی گرم پروتئین در توتفرنگی نارس است.
ثابت میکائیلیس آنزیم در توتفرنگی رسیده 8/5 میلیمولار با مقدار Vmax 0.95 واحد بر میلی‌گرم پروتئین به دست آمد، اما این پارامترهای سینتیکی در توتفرنگی پس از انبارمانی به ترتیب به 5 میلیمولار و 1/1 واحد بر میلی‌گرم پروتئین برای ثابت میکائیلیس و بیشینه سرعت آنزیمی در حضور اسید لینولئیک به عنوان سوبسترا رسید. پارامترهای سینتیکی در توتفرنگی نارس، توتفرنگی رسیده و پس از انبارمانی در حضور اسید لینولنیک به عنوان سوبسترای دوم برآورد شد. بنابراین، ثابت میکائیلیس آنزیم 8/6 میلیمولار با مقدار Vmax 0.81 واحد بر میلی‌گرم پروتئین در توتفرنگی نارس و ثابت میکائیلیس آنزیم در توتفرنگی رسیده 2/6 میلیمولار با مقدارVmax 0.92 واحد در میلی‌گرم پروتئین است و این پارامترهای سینتیکی در توتفرنگی انبارمانی شده به 4/5 میلیمولار و 99/0 واحد در میلی‌گرم پروتئین برای ثابت میکائیلیس و vmax رسید. تاییدیه این تحقیق این است که افزایش زمان انبارمانی موجب کاهش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز در پوست میوه‌های سه رقم انار باغملک شد (دهقانی نژاد و همکاران، 1399). مطالعات قبلی مقادیر ثابت میکائیلیس را از 015/0 تا 1/4 میلیمولار و مقادیر Vmax از 186/0 تا 4/7 واحد بر میلیمولار گزارش کرده‌اند (Thompson et al. 1990, Veldink et al. 1998, Daod19, Biacs, 1998) مقادیر با سطح خلوص آنزیم و تفاوت در روش سنجش متفاوت است.
نتیجه‌گیری نهایی
لیپواکسیژنازها آنزیمهای اکسیدوردوکتاز موجود در گیاهان و حیوانات، مجموعه‌ای از آنزیمهای ردوکس دیاکسیژناز به عنوان بیومارکر استرس در برابر استرس های قارچی، باکتریایی، آفات و غیر زنده (نمک، گرما، سرما، خشکسالی و تشعشع) بوده که در فرایند جوانه‌زنی و رشد در گیاهان نقش بسزایی دارند و بر همین اساس بررسی فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاه ضروری می‌باشد. فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز برای هر سه نوع توتفرنگی نارس، رسیده و انبارمانی، دمای اپتیمم یکسانی داشته و پایداری آنزیم تا دماهای بالا مشاهده گردید که بیانگر پایداری نسبی دمایی لیپواکسیژناز است. افزایش زمان انبارمانی موجب کاهش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز نسبت به زمانهای رسیده و نارس گردید که اهمیت لیپواکسیژناز را در مراحل رشد اولیه تا زمان رسیدگی نشان می‌دهد. اثرات مختلف مهارکنندگی و فعال‌کنندگی یونهای فلزی بر روی فعالیت لیپواکسیژناز بیانگر حساسیت ساختاری آنزیم در جهت طراحی و کنترل فعالیت لیپواکسیژناز در زمانهای مختلف رشد خواهد بود.
References
Aberomand, M., Kheirollah, A., Nikzamir, A., Malekasgar, A.M. and Alimohammadi, M. (2013). The Inhibitory Effect of KCN, NAN3 and Some Bivalent Ions on Lipoxygenase Activity of the Purified Human Placental, Iranian. Journal of Pharmaceutical Sciences. 9: 39–45.
Barrett, D. M. (1995). Theerakulkait, C. Quality indicators in blanched, frozen, stored vegetables. Food Technology. 49: 62-65.
Biacs, P.A. and Daood, H. (1987). Characterization of strawberrylipoxygenase. In: Stumpf PK, Mudd JB, Nes ND, eds. Metabolism, Structure, and Function of Plant Lipids , NY: Planum Press, 8:425-429.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochemistry. 72: 248-254.
Cao, S., Chen, H., Zhang, C., Tang, Y., Liu, J. and Qi, H. (2016). Heterologous Expression and Biochemical Characterization of Two Lipoxygenases in Oriental Melon, Cucumis melo var. makuwa Makino. PloS one, 11(4): e0153801. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153801
Ealing, P.M. (1994). Lipoxygenase activity in ripening strawberryfruit pericarp tissue. Phytochem. 36: 547-552.
Elez-Martínez, P., Soliva-Fortuny, R.C., Gorinstein, S. and Martín-Belloso, O. (2005). Natural antioxidants preserve the lipid oxidative stability of minimally processed avocado purée. Journal of Food Science. 70(5): 325-329.
Emin Y. (1998). Kinetic Studies with Crude Tomato Lipoxygenase. Turk Journal Agriculture Forestry. 25:291-296.
Grechkin A. (1998). Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. Prog. Lipid Res. 37: 317-352.
Izumi, T., Rådmark, O., Jörnvall, H. and Samuelsson, B. (1991). Purification of two forms of arachidonate 15-lipoxygenase from human leukocytes. Europian Journal Biochemistry. 18:202(3):1231-8. Doi: 10.1111/j.1432-1033.1991.tb16495.x. PMID: 1662607.
Jacobo-Velázquez, D. A., Hernández-Brenes, C., Cisneros-Zevallos, L. and Benavides, J. (2010). Partial purification and enzymatic characterization of avocado (Persea americana Mill, cv. Hass) lipoxygenase, Food Research International. 43: 1079-1085.
Karrer, D., Gand, M., & Rühl, M. (2021). Engineering a lipoxygenase from cyclocybe aegerita towards long chain polyunsaturated fatty acids. AMB Express, 11(1):37. https://doi.org/10.1186/s13568-021-01195-8
Lauriere, C., Droillard. M.J., Rouet-Mayer, M.A. and Bureau, J.M. (1993). Membrane-associated and soluble lipoxygenase isoforms in strawberrypericarp. Plant Physiology. 103:1211-1219.
Lončarić, M., Strelec, I., Moslavac, T., Šubarić, D., Pavić, V., & Molnar, M. (2021). Lipoxygenase Inhibition by Plant Extracts. Biomolecules, 11(2):152. https://doi.org/10.3390/biom11020152
Marvian-Hosseini, Z., Asoodeh, A. (2017). Biochemical characterization of purified lipoxygenase from sesame (Sesamum indicum). International Journal of Food Properties, 20(1): 948–958.
Marcus, L., Prusky, D. and Jacoby, B. (1998). Purification and characterization of avocado lipoxygenase, Phytochemistry, 27(2): 323-327.
Park, J. Y., Kim, C. H., Choi, Y., Park, K. M. and Chang, P. S. (2020). Catalytic characterization of heterodimeric linoleate 13S-lipoxygenase from black soybean (Glycine max (L.) Merr.). Enzyme and Microbial Technology, 139:109595. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109595
Richards, K. M. and Marnett, L. J. (1997). Leukocyte 12-lipoxygenase: expression, purification, and investigation of the role of methionine residues in turnover-dependent inactivation and 5, 8, 11, 14-eicosatetraynoic acid inhibition. Biochemistry, 36(22): 6692–6699. https://doi.org/10.1021/bi963051a
Riley, J.C.M., Willemot, C. and Thompson, J.E. (1996). Lipoxygenase and hydroperoxide lyase activities in ripening strawberryfruit. Postharvest Biology Technology. 7: 97-107.
Robinson, D.S., Wu, Z., Domoney, C., Casey, R. (1995). Lipoxygenases and the quality of foods. Food Chemistry. 54: 1, 33-43.
Rosahl, S. (1996). Lipoxygenases in plantss their role in development and stress responses. Z. Naturforch. 51: 123-138.
Saeidi-Sar, S., Khavari-Nejad, R. A., Fahimi, H., Ghorbanli, M. and Majd, A. (2007). Interactive effects of gibberellin A3 and ascorbic acid on lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in Glycine, Russian Hournal of Plant Physiology. 54:74-70.
Singh, P., Arif, Y., Miszczuk, E., Bajguz, A. and Hayat, S. (2022). Specific Roles of Lipoxygenases in Development and Responses to Stress in Plants. Plants (Basel). 4; 11(7):979. Doi: 10.3390/plants11070979. PMID: 35406959; PMCID: PMC9002551.
Surrey, K. (1964). Spectrophotometric method for determination of lipoxidase activity. Plant Physiology. 39: 65-70.
Svendsen, A. (2004). Enzyme Functionality Design, Engineering, and Screening; Marcel Dekker, Inc: New York, USA.
Thompson, J.E., Todd, J.F.and Paliyath, G. (1990). Characterization of a membrane-associated lipoxygenase in strawberryfruit. Plant Physiology. 94: 1225-1232.
Veldink, G.A., Suurmeijer, C.N.S.P., Perez-Gilabert, M., van der Hijden, H.T.W.M. and Vliegenthart, J.F.G. (1998). Purification, product characterization and kinetic properties of soluble strawberry lipoxygenase. Plant Physiology Biochemistry. 36: 657-663.
Yawer, M. A., Ahmed, E., Malik, A., Ashraf, M., Rasool, M. A. and Afza, N. (2007). New lipoxygenase-inhibiting constituents from Calligonum polygonoids. Chemistry and Biodiversity, 4: 1578-1585.
Zhang, B., Chen, M., Xia, B., Lu, Z., Khoo, K.S., Show, P.L. and Lu, F. (2022). Characterization and Preliminary Application of a Novel Lipoxygenase from Enterovibrio norvegicus. Foods, 11:2864. https://doi.org/10.3390/foods11182864