اثر هیدروپرایمینگ و هورمون-پرایمینگ بر سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی بذور نخود..

محورهای موضوعی : فیزیولوژی گیاهی

حمید نوری ¹ , سعید نواب پور ²

1 - گروه زراعت و اصلاح نباتات -دانشکده کشاورزی- دانشگاه یاسوج
2 - دانشگاه علوم کشاورزی گرگان

تاریخ دریافت : 1403/06/10 تاریخ پذیرش : 1403/08/01 تاریخ انتشار : 1403/04/19

کلید واژه: بذر, کاتالاز, فعال , اکسیژن ,

چکیده مقاله :

این مطالعه به منظور بررسی اثرهیدروپرایمینگ و هورمون پرایمینگ بر خصوصیات آنتی‏اکسیدانی بذور نخود اجرا شد. آزمایش به صورت طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. تیمارهای پرایمینگ شامل شاهد، پرایمینگ با آب و پرایمینگ با سالیسیلیک اسید (درسطوح 300، 600، 900، 1200، 1500 و 1800 میلی‏گرم بر لیتر) بودند. نتایج نشان داد پرایمینگ بذر با آب و سالیسیلیک اسید منجر به تغییراتی در مقدار آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی و فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت گردید. هیدروپرایمینگ منجر به افزایش میزان مالون دی آلدئید، پراکسید هیدروژن، پرولین، اسید آسکوربیک و فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پروکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز گردید. نتایج نشان داد بیشترین میزان تولید مالون دی آلدئید ( 87 نانومول برگرم) و پراکسید هیدروژن (315 نانومول برگرم) در تیمار پرایم شده با غلظت 1800 میلی‏گرم بر لیتر سالیسیلیک اسید حاصل گردید. افزایش غلشت سالیسیلیک اسید تا 600 میلی‏گرم بر لیتر منجر به افزایش مقدار پرولین و اسید آسکوربیک به ترتیب به مقادیر 39/0 و 8/9 میلی‏گرم بر گرم گردید. بالاترین میزان فعالیت این آنزیم به میزان 3777 نانومول بر دقیقه بر گرم متعلق یه تیمار پرایمینگ بذر با مقدار 900 میلی‏گرم بر لیتر سالیسیلیک اسید بود. در شرایط پرایمینگ بذر با مقدار 600 میلی‏گرم بر گرم سالیسیلیک اسید بالاترین میزان فعالیت این آنزیم به مقدار 390 نانومول بر دقیقه بر گرم به دست آمد. کمترین میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پروکسیداز در تیمار شاهد و به میزان 30 نانومول بر دقیقه بر گرم به دست آمد بالاترین میزان فعالیت آن نیز در تیمار پرایمینگ بذر با اسیدسالیسیلیک 900 میلی‏گرم بر لیتر حاصل گردید. میزان فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز در تیمار پرایمینگ بذر با سالیسیلیک اسید در غلظت 900 میلی‏گرم بر لیتر به ترتیب به مقادیر 46/1 میکرومول بر دقیقه بر گرم و 99/0 میکرومول بر دقیقه بر گرم بالاترین میزان بودن

چکیده انگلیسی:

This study was conducted to investigate the effect of hydropriming and hormone priming on the antioxidant properties of chickpea seeds. The experiment was conducted as a completely randomized design with four replications. The priming treatments included control, priming with water and priming with salicylic acid (at the level of 300, 600, 900, 1200, 1500 and 1800 mg/liter). The results showed that seed priming with water and salicylic acid led to changes in the amount of non-enzymatic antioxidants and the activity of antioxidant enzymes. Hydropriming led to an increase in the amount of malondialdehyde, hydrogen peroxide, proline, ascorbic acid and the activity of catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, superoxide dismutase and glutathione reductase enzymes. The results showed that the highest production of malondialdehyde (87 nmol bergam) and hydrogen peroxide (315 nmol bergam) was obtained in the primed treatment with a concentration of 1800 mg/l of salicylic acid. Increasing salicylic acid concentration up to 600 mg/liter led to an increase in proline and ascorbic acid amounts to 0.39 and 9.8 mg/g, respectively. The highest level of activity of this enzyme was 3777 nmol/min/g belonging to a seed priming treatment with 900 mg/l of salicylic acid. In seed priming condition with 600 mg/g of salicylic acid, the highest activity level of this enzyme was obtained as 390 nmol/min/g. The lowest level of ascorbate peroxidase enzyme activity was obtained in the control treatment at the rate of 30 nmol/min/g, and the highest level of activity was obtained in the seed priming treatment with 900 mg/l salicylic acid. The activities of superoxide dismutase and glutathione reductase enzymes were also the highest in the seed priming treatment with salicylic acid at a concentration  

منابع و مأخذ:

پرمون، ق.، عبادی، ع.، جهانبخش گده کهریز، س. و داوری، م. 1393. تأثیر پرایمینگ با اسید سالیسیلیک بر خصوصیات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بذور پیر شده ماریتیغال. نشریه تولید گیاهان زراعی. 7(4): 223-234.
توکل افشاری، ر.، قاسم، ف.، مجنون حسینی، ن.، علیزاده، ه. و بی همتا، م.ر. 1386. تأثیر پیری بذر بر صفات جوانه‏زنی و فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت کاتالاز و پراکسیداز در ژنوتیپ‏های جو. مجله علوم کشاورزی ایران. 37(2): 337-346.
شعبان، م.، قادری فر، ف.، صادقی پور، ح.ر. و یامچی، ا. 1397. بررسی جوانه زنی و فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و غیرآنزیمی کلیدی دخیل در زوال بذر نخود در طی انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی. نشریه تولید گیاهان زراعی. 11(7): 71-51.
صورآذر، خ.، صدقی، م. و سیدشریفی، ر. 1401. تأثیر انواع پرایمینگ بر صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی لوبیا قرمز تحت تنش کلریدکبالت. پژوهشهاي بذر ایران. 9(1): 126-111.

متن کامل:



گیاه و زیست فناوری ایران Iranian Journal of Plant & Biotechnology (IJPB)

مقاله پژوهشی

 

 اثر هیدروپرایمینگ و هورمون-پرایمینگ بر سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی بذور نخود (Cicer arietinum L.)

حمید نوری (نویسنده مسئول)1* و سعید نواب‌پور2

1*- استادیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج، یاسوج، ایران، [e-mail]

2- استاد، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولیدات گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران، [e-mail]

تاریخ دریافت: شهریور 1403 تاریخ پذیرش: آبان 1403

The effect of hydropriming and hormone-priming on the antioxidant system of chickpea seeds (Cicer arietinum L.)

Hamid Nouri (Corresponding author)1* and Saeed Navabpour2

1*- Assistant Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Yasouj University, Yasouj, Iran, [e-mail]

2- Professor, Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran, [e-mail]

Received: September 2024 Accepted: November 2024

چکیده این مطالعه به منظور بررسی اثر پرایمینگ بر خصوصیات آنتی‏اکسیدانی بذور نخود به صورت طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. تیمارهای پرایمینگ شامل شاهد، پرایمینگ با آب و پرایمینگ با اسید سالیسیلیک (در سطوح 300، 600، 900، 1200، 1500 و 1800 میلی‏گرم بر لیتر) بودند. نتایج نشان داد هیدروپرایمینگ منجر به افزایش میزان مالون دی آلدئید، پراکسید هیدروژن، پرولین، اسید آسکوربیک و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پروکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز گردید. بیشترین میزان تولید مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن در تیمار پرایم شده با غلظت 1800 میلی‏گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک حاصل گردید. افزایش غلظت اسید سالیسیلیک تا 600 میلی‏گرم بر لیتر منجر به افزایش مقدار پرولین و اسید آسکوربیک گردید. بالاترین فعالیت آنزیم کاتالاز به میزان 3777 نانومول بر دقیقه بر گرم متعلق یه تیمار پرایمینگ بذر با مقدار 900 میلی‏گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک بود. در شرایط پرایمینگ بذر با مقدار 600 میلی‏گرم بر گرم اسید سالیسیلیک بالاترین فعالیت آنزیم پراکسیداز به مقدار 390 نانومول بر دقیقه بر گرم به دست آمد. بالاترین میزان فعالیت آن نیز در تیمار پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک 900 میلی‏گرم بر لیتر حاصل گردید. فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز در تیمار پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک در غلظت 900 میلی‏گرم بر لیتر به ترتیب به مقادیر 46/1 میکرومول بر دقیقه بر گرم و 99/0 میکرومول بر دقیقه بر گرم بالاترین میزان بودند. پرایمینگ بذر با آب و اسید سالیسیلیک منجر به افزایش میزان آنتی‏اکسیدانت‏های غیر آنزیمی و افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت گردید. با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک تا 1800 میلی‏گرم بر لیتر به دلیل افزایش تولید مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن از میزان و فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏ها کاسته شد. کلمات کلیدی: بذر، جوانه‏زنی، کاتالاز، گونه‏های فعال اکسیژن   فصلنامه گیاه و زیست فناوری ایران                         تابستان 1403، دوره 19، شماره 2، صص 47-30

Abstract This study was conducted to investigate the effect of priming on the antioxidant properties of chickpea seeds as a completely randomized design with four replications. The priming treatments included control, priming with water and priming with salicylic acid (at levels of 300, 600, 900, 1200, 1500 and 1800 mg.L-1). The results showed that hydropriming increased the amount of malondialdehyde, hydrogen peroxide, proline, ascorbic acid and the activity of catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, superoxide dismutase and glutathione reductase enzymes. The highest production of malondialdehyde (87 nmol.g-1) and hydrogen peroxide (315 nmol.g-1) was obtained in the primed treatment with a concentration of 1800 mg.L-1 of salicylic acid. Increasing the concentration of salicylic acid up to 600 mg.L-1led to an increase in the amount of proline and ascorbic acid to 0.39 and 9.8 mg.g-1, respectively. The highest level of catalase enzyme activity was 3777 nmol.min-1.g-1 belonging to a seed priming treatment with 900 mg.L-1of salicylic acid. In seed priming condition with 600 mg.g-1 of salicylic acid, the highest peroxidase enzyme activity was obtained as 390 nmol.min-1.g-1. The highest level of its activity was obtained in seed priming treatment with salicylic acid 900 mg.L-1. The activities of superoxide dismutase and glutathione reductase enzymes were also the highest in the seed priming treatment with salicylic acid at a concentration of 900 mg.L-1at 1.46 μmol.min-1.g-1 and 0.99 μmol.min-1.g-1, respectively. Seed priming with water and salicylic acid led to an increase in the amount of enzymatic antioxidants and an increase in the activity of antioxidant enzymes. By increasing the concentration of salicylic acid up to 1800 mg.L-1, the amount and activity of antioxidants decreased due to the increased production of malondialdehyde and hydrogen peroxide. Keywords: Catalase, Germination, Reactive oxygen species, Seed Iranian Journal of Plant & Biotechnology Summer 2024, Vol 19, No 2, Pp 30-47

 

 

مقدمه و کلیات

جوانه‏زنی بذر تضمین‏کننده دوام، استقرار و عملکرد نهایی گیاهان می‏باشد (صورآذر و همکاران، 1401). جوانه‏زنی مطلوب بذر و استقرار گیاهچه‏ها اهمیت ویژه‏اي در دستیابی به رشد و به تبع آن عملکرد مطلوب دارد(Eskandari, 2012).با این حال، گیاهان اغلب در معرض تنش‏هاي غیرزنده قرار می‏گیرند که محدودیت عمده‏اي براي تولید محصولات کشاورزي در سراسر جهان است (صورآذر و همکاران، 1401). شرایط نامطلوب محیطی که گیاهان در چرخه رویشی با آنها روبرو می‏شوند، واکنش‏هاي متابولیکی آنها را مختل کرده و بر عملکرد سلول‏هاي گیاهی از قبیل فعالیت‏هاي بیوشیمیایی تأثیر منفی می‏گذارند (Aymen, 2018). از جمله این واکنش‏ها تغییر در میزان تولید مالون دی‏آلدئید، پراکسید هیدروژن، آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی و فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی می‏باشد. تغییرات پراکسیداتیو در ترکیبات اسیدهای چرب غشاها سبب تغییر در کارکرد غشاهای سلولی شده که اینها خود سبب افزایش ویسکوزیته و نفوذپذیری غشاها شده و در نهایت سبب افزایش نشت الکترولیت‏ها و میزان هدایت الکتریکی می‏گردد (شعبان و همکاران، 1397). اثرات کلي پراکسیداسیون لیپید کاهش سياليت غشا، افزايش نشت مواد از غشا، آسیب به پروتئين‏هاي غشا و در نهایت غيرفعال شدن گیرنده‏ها، آنزيم‏ها و کانال‏هاي يوني می‏باشد (Gill and Tuteja, 2010). گیاه برای مقابله و کاهش خسارات ناشی از افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن از سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی برخوردار بوده که پالایش این گونه‏های فعال اکسیژن را بر عهده دارند. سیستم آنتی‏اکسیدانی گیاهان شامل آنتی‏اکسیدان‏های غیرآنزیمی از قبیل پرولین، آسکوربیک اسید، آلفا توکوفرول و برخی از آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت شامل کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز هستند که وظیفه پالایش گونه‏های فعال اکسیژن را در شرایط مختلف بر عهده دارند (Moller et al., 2017). در اثر وقوع تنش در گیاهان تولید برخی متابولیت‏های با وزن مولکولی کم که نقش اسمولیتی حفاظتی بر عهده دارند از قبیل پرولین افزایش می‏یابد (Hoekstra et al., 2001).  به عقیده‏ی Oliveira و همکاران (2012) آنتی‏اکسیدانت‏های غیر آنزیمی سبب کاهش میزان گونه‏های فعال اکسیژن می‏شوند. عدم توانایی بذور در تولید برخی آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت ضروری از پیامدهای آنزیم سازی ناقص و ناکارا در این بذور می‏باشد (توکل افشاری و همکاران، 1386). تولید بیش از حد گونه‏های فعال اکسیژن طی تنش اکسیداتیو سبب کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز شده است (Lehner et al., 2008). در این شرایط کاهش فعالیت کاتالاز سبب تجمع پراکسید هیدروژن شده و همین امر سبب خسارت مستقیم و یا به واسطه تشکیل رادیکال‏های هیدروکسیل به بذر و می‏گردد (Goel et al., 2023). یکی از روش‏هاي بهبود بذر و جوانه‏زنی بذر، تسریع رشد و استقرار گیاهچه، یکنواختی، کاهش زمان گلدهی و تولید گیاهچه قوي پرایمینگ بذر است که موجب بهبود کیفیت و عملکرد محصول در شرایط تنش‎زا و بدون تنش در گیاهان می‏گردد (Bose et al., 2018). پرایمینگ بذر انواع مختلفی دارد که از آنها می‏توان به روش‏های اسموپرایمینگ، هیدروپرایمینگ، هالوپرایمینگ، بیوپرایمینگ، هورمون پرایمینگ و سایر روش‏های پرایمنگ بذر اشاره نمود (Singh et al., 2015). در مطالعه حاضر از روش‏های هیدروپرایمینگ و هورمون پرایمینگ استفاده شده است. در روش هیدروپرایمینگ براي بهبود تحمل تنش براي گیاهان بذرها در آب مقطر به همراه هوادهی تا مدت زمان معینی جهت القاي فعالیت‏هاي متابولیکی قبل از جوانه‏زنی و بدون اینکه جوانه‏زنی واقعی آغاز شود، خیسانده می‏شوند و در ادامه بذرها از طریق خشک کردن مناسب در زیر سایه به وزن اصلی خود برگردانیده می‏شوند (Jisha et al., 2013). هورمون پرایمینگ نیز، پیش‏تیمار بذر با هورمون‏هاي مختلف از جمله اسید سالیسیلیک، اسید آبسیزیک، اسید جیبرلیک، کینتین و غیره می‏باشد (Singh et al., 2015). اسیدسالیسیلیک یکی از مواد مهم مورد استفاده در پرایمینگ بذر بوده که از تركیبات فنلي بوده و توسط گیاهان تولید مي‏شود (پرمون و همکاران، 1393). این گروه از تركیبات مي‏توانند به عنوان تنظیم كننده رشد عمل كنند (Raskin et al., 2022). اسیدسالیسیلیک به عنوان یک سیگنال مولكولي مهم در واكنش‏های گیاهي در پاسخ به تنش‏های محیطي مورد استفاده قرار مي‏گیرد (Sairam et al., 2017). کاربرد اسیدسالیسیلیک ممكن است روی بسیاری از فرآیندهای گیاهی مانند جوانه‏زني بذور، نفوذپذیری غشاها و سرعت رشد اثر داشته باشد (Khan et al., 2023). تحقیقات نشان داد که استفاده از اسید سالیسیلیک جوانه‏زنی لوبیا را در شرایط تنش فلزات سنگین افزایش داده است، همچنین رشد ریشه گیاهچه، وزن خشک گیاهچه لوبیا نسبت به شاهد (بدون اسید سالیسیلیک) افزایش یافت و همچنین بر میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت اثر داشت(Gul et al., 2020; Nouairi et al., 2019). همچنین استفاده از اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر روی میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت اثرگذار بود (Eftekhar et al., 2019). در مطالعه صورآذر و همکاران (1401) مشخص شد که کاربرد اسید سالیسیلیک و آب در فرآیند پرایمینگ بذر منجر به افزایش میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت از قبیل کاتالاز، پلی فنول اکسیداز و پراکسیداز گردید. در مطالعه‏ای دیگر افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت از قبیل کاتالاز و پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در فرآیند پرایمینگ بذر با مواد نمکی و آب گزارش شده است (Amuaghaee, 2011). از این رو هدف از اجرای این تحقیق بررسی اثر پرایمینگ بذر با آب و اسید سالیسیلیک بر خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی در بذر نخود می‏باشد.

فرآیند پژوهش

تحقیق حاضر به منظور بررسی اثر تیمار پرایمینگ با مقادیر مختلف اسید سالیسیلیک بر فعالیت آنتی‏اکسیدانی بذور نخود زراعی اجرا شد. در این آزمایش بذور نخود رقم آرمان استفاده گردید. آزمایش به صورت طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. برای پرایمینگ بذرها، تعداد بذر مورد نظر را در درون دو لایه كاغذ صافي قرار داده و سپس محلول های مورد نظر برای پرایمینگ را به آنها افزوده و در دمای 25 درجه سانتيگراد در تاریكي به مدت 24 ساعت قرار داده شد. تیمارهای پرایمینگ شامل شاهد، پرایمینگ با آب و پرایمینگ با اسید سالیسیلیک (در سطوح 300، 600، 900، 1200، 1500 و 1800 میلی‏گرم بر لیتر) بودند.

اندازه‏گیری پراکسیداسیون لیپید به روش Heath and Packer (1968) همراه با تغیراتی انجام شد. در این روش میزان پراکسیداسیون لیپید براساس مقدار مالون دی آلدهید (MDA) موجود در هر عصاره طبق رابطه زیر محاسبه گردید:

LP=[[(A532-A600)-[(A440 A600) (MA)]]/155000] * 106

که در این رابطه LP مقدار مالون دی‏آلدئید بر حسب نانومول بر میلی لیتر و MA جذب مولی ساکارز در غلظت‌های 10-1 میلی‌مولار در 532 و 440 نانومتر است که به‌ترتیب 4/8 و147 محاسبه شد که نسبتی معادل 0571/0 می‌باشد (Du and Bramleg, 1992). در نهایت میزان پراکسیداسیون لیپید بر اساس نانومول MDA موجود با ازای هر گرم بذر بیان گردید.

به منظور اندازه‏گیری پراکسید هیدروژن به میزان 3/0 گرم بافت بذری با 5/1 میلی لیتر تری‏کلرواستیک اسید 1/0 درصد در هاون چینی روی یخ هموژنیزه و پس از انتقال به میکروتیوب به مدت 15 دقیقه در 15000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید و از عصاره حاصله برای اندازه گیری میزان پراکسید هیدروژن در طول موج 390 نانومتر استفاده گردید (Ghiazdowska et al., 2010).

برای اندازه‏گیری مبزان پرولین مقدار 5/0 گرم از نمونه‏ی بذری را توزین و پودر نموده و سپس آنها را به لوله‏های آزمایش 15 میلی لیتری منتقل کرده و 10 میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک 3/3 درصد به آنها اضافه شد. سپس به مدت 15 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ و از محلول‏های حاصل جهت اندازه‏گیری میزان پرولین به روش Bates و همکاران (1973) با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر استفاده شد.

به منظور اندازه‏گیری میزان اسیدآسکوربیک 2/0 گرم بافت بذری با 2 میلی لیتر اسیدپرکلریک 5/0 میلی مولار در هاون چینی روی یخ ساییده شده و سپس در میکروتیوب ریخته و به مدت 20 دقیقه در 10000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شده و جذب نوری نمونه ها در طول موج 735 نانومتر انجام شد (Zhang et al., 2010).

برای سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز یک گرم از بافت بذری با 3 میلی لیتر با فر استخراج در هاون چینی روی یخ ساییده شده و پس از عبور از دو لایه پارچه ململ در میکروتیوب ریخته و به مدت 15 دقیقه در 10000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. تغییرات جذب در طول موج 240 نانومتر به مدت دو دقیقه اندازه گیری و از یک دقیقه اول آن برای محاسبه فعالیت کاتالاز استفاده گردید (Luck., 1962).

به منظور اندازه‏گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز به میزان 2 گرم از بافت بذری با 4 میلی‏لیتر بافر استخراج در هاون چینی روی یخ ساییده شده و پس از عبور از دو لایه پارچه ململ در میکروتیوب ریخته و به مدت 15 دقیقه در 10000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر به مدت 4 دقیقه اندازه‏گیری و از یک دقیقه اول آن برای محاسبه فعالیت پراکسیداز استفاده گردید (Resenda et al., 2002).

برای سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به میزان 3/0 گرم از بافت بذری با 2 میلی لیتر بافر استخراج در هاون چینی روی یخ ساییده شده و پس از عبور از دو لایه پارچه ململ در میکروتیوب ریخته و به مدت 30 دقیقه (دو زمان 15 دقیقه ای) در 15000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. تغییرات جذب در طول موج 290 نانومتر به مدت 3 دقیقه اندازه گیری و از یک دقیقه اول آن برای محاسبه فعالیت آسکوربات پراکسیداز استفاده گردید (Resenda et al., 2002).

سنجش سوپر اکسید دیسموتاز بر اساس تغییر شیمیائی نیترو بلو تترازولیوم و طبق روش Minami وYoshikawa  (1979) انجام شد. بدین منظور محلول واکنش شامل 55 هزارم مول نیترو بلو تترازولیوم، 42/1 درصد ترایتون X-100، 0.1 mM   EDTA، 16 میلی مول پیروگالول بود که پس از اضافه کردن عصاره نمونه بافت تغییر جذب در اسپکترو فتو متر در طول موج 560 نانو متر ارزیابی گردید.

سنجش فعالیت گلوتاتین ردوکتاز با روش (Sgherri et al., 1994)  انجام شد. بدین منظور 2 گرم از بافت مورد نظر در بافر با pH=7 حاوی 100 میلی مول فسفات پتاسیم، 1 میلی مول EDTA و 2/0 پلی وینیل فسفات در مجاورت یخ با دستگاه هموژن شد. سپس در g18000 به مدت 20 دقیقه در 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ گردید. محلول روئی جهت سنجش فعالیت گلوتاتین ردوکتاز مورد استفاده قرارگرفت. برای این منظور محلول واکنش شامل 200 میلی مول فسفات پتاسیم (pH=7.5)، 2 میلی مول EDTA، یک و نیم میلی مول کلرور منیزیم، نیم میلی‏مول اکسید گلوتاتیون، 50 میکرو مول NADH ساخته و ابتدا جذب در 340 نانومتر قرائت گردید و به 1 میلی‏لیتر از این محلول به مقدار 100 میکرولیتر از محلول استخراج شده از بافت گیاه اضافه و بعد از یک دقیقه مجددا جذب قرائت شد. با استفاده از منحنی استاندارد آنزیم، فعالیت نمونه استخراجی تعیین گردید.

تجزیه داده‏ها با استفاده از نرم افزار SAS و مقایسات میانگین با آزمون LSD در سطح پنج درصد انجام شد.

 

نتایج و بحث

 

براساس نتایج حاصل از این مطالعه مشخص شد که تولید مالون‏دی‏آلدئید تحت تأثیر تیمار پرایمینگ بذر قرار گرفت و نتایج نشان داد بیشترین تولید مالون دی آلدئید به میزان 87 نانومول برگرم در تیمار پرایم شده با غلظت 1800 میلی‏گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک حاصل گردید. افزایش غلظت اسید سالیسیلیک از 300 تا 1800 میلی‏گرم بر لیتر منجر به افزایش تولید مالون دی‏آلدئید شد که نشانه پراکسیداسیون لیپید بیشتر در این تیمارها می‏باشد. کمترین میزان تولید مالون‏دی‏آلدئید به میزان 37 نانومول بر گرم نیز متعلق به تیمار شاهد و عدم پرایم بذرها بود و دارای تفاوت آماری معنی‏داری با تیمار هیدروپرایمینگ (42 نانومول بر گرم) نداشت، این در حالی بود که این تیمار با سایر تیمارها دارای اختلاف آماری معنی‏داری بود (شکل 1).

 

 

 

 

شکل 1- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر میزان تولید مالون دی آلدئید در بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 1- The effect of different seed priming treatments on the amount of malondialdehyde production in chickpea seeds (columns with at least one similar letter do not have significant differences)

 

 

پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک و هیدروپرایمینگ سبب تغییرات مثبتی در روند افزایش تولید پراکسید هیدروژن گردید. براساس نتایج حاصل از این مطالعه مشخص شد که تولید پراکسید هیدروژن با افزایش غلظت کاربرد اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذرها افزایش یافت. در بین سطوح مختلف تیمار پرایمینگ بذر، بیشترین میزان تولید پراکسید هیدروژن مربوط به تیمار پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک 1800 میلی‏گرم بر لیتر به میزان 315 نانومول برگرم بود و کمترین میزان تولید پراکسید هیدروژن در تیمار شاهد به میزان 168 نانومول برگرم به دست آمد (شکل 2). در شرایط پرایمینگ بذر یا آب و اسیدسالیسیلیک تا غلظت 1800 میلی‏گرم در لیتر میزان تولید مالون دی‏آلدئید و پراکسید هیدروژن افزایش یافت. افزایش تولید گونه‏های فعالی اکسیژن در زمان شورع فرآیند جوانه‏زنی بذر به دلیل نقش فعال گونه‏های فعال اکسیژن در فرآیند شکست خواب و القای جوانه‏زنی در بذر می‏باشد (Yousif Abdullah Al Hijab et al., 2024). در فرآیند پرایمینگ بذر که به شروع مقدمات برای جوانه‏زنی بذر همراه می‏باشد میزان تولید گونه‏های فعالی اکسیژن از قبیل پراکسید هیدروژن افزایش یافته که به دنبال آن با پراکسیداسیون بیشتر غشای سلولی میزان نشت الکترولیت‏ها و همچنین میزان تولید مالون دی‏آلدئید که بیانگر افزایش پراکسیداسیون غشای سلولی است افزایش می‏یابد (Liu et al., 2022). در مطالعه حاضر نیز افزایش تولید مالون‏دی‏آلدئید و پراکسید هیدروژن با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک به دلیل نقش القایی این ماده در شروع فرآیند جوانه‏زنی بذر و در نتیجه افزایش پراکسیداسیون لیپیدی بوده که منجر به افزایش تولید مالون‏دی‏آلدئید و پراکسید هیدروژن شده است. در شرایط پرایمینگ بذر با آب و با محلول اسید سالیسیلیک به دلیل جذب آب و آزادی عمل بیشتر گونه‏های فعال اکسیژن و به خصوص در غلظت‏های بالای اسید سالیسیلیک در محلول پرایمینگ بذر و خسارت بالاتر به غشاها میزان پراکسیداسیون لیپیدی نسبت به تیمارهای انبارداری طبیعی افزایش یافته است. Mira و همکاران (2015) نیز بیان نمودند محتوای رطوبتی بذر بر میزان تولید گونه‏های فعال اکسیژن اثر دارند که با یافته‏های حاصل از این مطالعه مطابقت داشت. به گفته Gul (2023) افزایش میزان تولید مالون دی آلدئید همراه با نشت الکترولیت ها بخش قابل توجهی از کاهش قابلیت جوانه‏زنی بذور و رشد گیاهچه را توجیه می‏نماید. افزایش میزان تولید مالون دی آلدئید ناشی از افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن در بذر بوده که می تواند ناشی از ضعف سیستم آنتی اکسیدانت باشد (Bailly, 2004). Wani و همکاران (2023) بیان نمودند که افزایش بیش از اندازه تولید مالون‏دی آلدئید در بذور نشانه شروع کاهش قابلیت حیات در آنها می‏باشد و این تولید نیز با افزایش محتوای رطوبتی افزایش می‏یابد. Basit و همکارارن (2022) بیان نمودند که با افزایش میزان رطوبت بذر واکنش‏های از قبیل پراکسیداسیون لیپید بیشتر رخ می‏دهند.

 

 

شکل 2- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر میزان پراکسید هیدروژن تولید شده در بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 2- The effect of different seed priming treatments on the amount of hydrogen peroxide produced in chickpea seeds (columns that have at least one similar letter do not have significant differences)

 

 

میزان آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی در شرایط وقوع تنش اکسیداتیو دستخوش تغییراتی شده که ممکن است سلول را در برابر خسارت اکسیداتیو در امان نگه دارد. پرولین یکی از آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی بوده که در شرایط وقوع تنش‏های محیطی در بافت های مختلف گیاهی تولید آن افزایش می‏یابد. در این تحقیق مشاهده شد که تولید پرولین در تیمار پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک 600 میلی‏گرم بر لیتر بالاتر از سایر تیمارهای پرایمینگ بذر بود (39/0 میلی‏گرم بر گرم). این در حالی بود که افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر منجر به کاهش میزان تولید پرولین گردید به طوری که در شرایط پرایمینگ بذر با مقدار 1800 میلی‏گرم بر لیتر کمترین میزان پرولین به مقدار 1/0 میلی‏گرم بر گرم حاصل گردید (شکل 3).

 

 

شکل 3- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر میزان پرولین تولید شده در بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 3- The effect of different seed priming treatments on the amount of proline produced in chickpea seeds (columns with at least one letter in common do not have significant differences)

 

 

یکی از آنتی اکسیدانت‏های غیرآنزیمی دخیل در فرآیند پالایش گونه‏های فعال اکسیژن اسید آسکوربیک بوده که در این مطالعه تحت تأثیر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر دستخوش تغییراتی شده است. نتایج نشان داد علاوه بر اینکه هیدروپرایمینگ منجر به افزایش مقدار تولید آن شده است، افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر تا 600 میلی‏گرم در لیتر منجر به افزایش اسید آسکوربیک گردید. بالاترین میزان اسید آسکوربیک به میزان 8/9 میلی‏گرم بر گرم در تیمار پرایمینگ با اسید سالیسیلیک 600 میلی‏گرم بر لیتر حاصل گردید و با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک درفرآیند پرایمینگ بذر میزان تولید اسید سالیسیلیک کاهش یافت، به طوری که میزان آن در تیمار پرایمینگ با اسید سالیسیلیک 1800 میلی‏گرم بر لیتر به 5/7 میلی‏گرم بر گرم رسید. همچنین نتایج نشان داد کمترین میزان اسید سالیسیلیک به مقدار 8/6 میلی‏گرم بر گرم متعلق به تیمار شاهد بود (شکل 4).

 

 

 

شکل 4- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر میزان آسکوربیک اسید تولید شده در بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 4- The effect of different seed priming treatments on the amount of ascorbic acid produced in chickpea seeds (columns with at least one similar letter do not have significant differences)

 

 

براساس نتایج حاصل از این مطالعه مشخص شد که فعالیت آنزیم های آنتی‏اکسیدانت از قبیل کاتالاز تحت تأثیر تیمارهای پرایمینگ بذر قرارگرفت. نتایج نشان داد که هیدروپرایمینگ میزان فعالیت آنزیم کاتالاز را نسبت به تیمار شاهد افزایش داد. از طرفی افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر تا غلظت 900 میلی‏گرم در لیتر منجر به افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز گردید به طوری که بالاترین میزان فعالیت این آنزیم به میزان 3777 نانومول بر دقیقه بر گرم متعلق یه تیمار پرایمینگ بذر با مقدار 900 میلی‏گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک بود و از این مقدار به بعد افزایش میزان اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر منجر به کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز شد به طوری که کمترین میزان فعالیت این آنزیم به مقدار 665 نانومول بر دقیقه بر گرم در تیمار پرایمینگ بذر با مقدار 1800 میلی‏گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک حاصل گردید (شکل 5). در شرایطی که میزان گونه‏های فعال اکسیژن در گیاه افزایش یافته و پراکسیداسیون لیپیدی نیز افزایش می‏یابد، گیاه در شرایط تنش اکسیداتیو قرار گرفته که در نتیجه آن ممکن است خساراتی جبران ناپذیر به گیاه وارد گردد. از این رو در گیاه مکانیسم‏هایی برای مقابله با فرآیند اکسیداسیون قرارداشته که مشتمل بر آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و غیرآنزیمی می‏باشد. آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی نظیر پرولین و اسیدآسکوربیک در مقابله با افزایش گونه‏های فعال اکسیژن افزایش می‏یابند که در این مطالعه نیز افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر تا غلظت 600 میلی‏گرم در لیتر منجر به افزایش تولید پرولین و اسیدآسکوربیک شده است و میزان این دو را نسبت به تیمار شاهد به ترتیب به میزان 30 و 31 درصد افزایش داده است و اختلاف بین آنها از نظر آماری معنی‏دار بود. همچنین بر طبق این نتایج مشخص شد که میزان پرولین و اسید سالیسیلیک با افزایش بیشتر اسید سالیسیلیک در محلول پرایمینگ بذر منجر به کاهش میزان پرولین و اسیدآسکوربیک شده است و در غلظت 1800 میلی‏گرم در لیتر از اسید سالیسیلیک به کمترین میزان رسیده که به احتمال زیاد نشان دهنده عدم کارایی سیستم آنتی‏اکسیدانی غیرآنزیمی در غلظت مذکور در جهت مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از تولید زیاد گونه‏های فعال اکسیژن می‏باشد. آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی سبب کاهش میزان گونه‏های فعال اکسیژن می‏شوند (Oliveira et al., 2012). به گفته Hoekstra و همکاران (2021) در اثر وقوع تنش در گیاهان تولید برخی متابولیت‏های با وزن مولکولی کم که نقش اسمولیتی حفاظتی بر عهده دارند از قبیل پرولین افزایش می‏یابد. در این زمینه Wani و همکاران (2020) در تحقیق خود عنوان نمودند که پرولین از عملکرد طبیعی سلولی با استفاده از سم‏زدایی گونه‏های فعال اکسیژن محافظت می‏نماید. Kong و همکاران (2015) نیز در تحقیق خود بیان نمودند که افزایش شدت تنش اکسیداتیو سبب افزایش محتوای پرولین در بذور زوال یافته می‏گردد. در شرایط عدم کارایی سیستم آنتی‏اکسیدانی آنزیمی، آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی این کمبود را جبران می‏نمایند و این بدین دلیل است که سیستم‏های آنتی اکسیدانی در شرایط مختلف تکمیل کننده یکدیگر می‏باشد (Kong et al., 2015). فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت وابسته به محتوای رطوبتی بذر می‏باشد (شعبان و همکاران، 1397). با شروع فرآیند پرایمینگ بذر و آبگیری بذر از محلول پرایمینگ مشتمل بر هیدروپرایمینگ و پرایمینگ با اسیدسالیسیلیک فعالیت آنزیم پروکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز شروع به افزایش نمود به طوری که میزان فعالیت آنها تا حدود غلظت 600 تا 900 میلی‏گرم بر لیتر افزایش یافت و میزان فعالیت این آنزیم‏ها با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک شروع به کاهش یافتن نمود. کاهش میزان فعالیت این آنزیم‏ها با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک به دلیل غلبه گونه‏های فعال اکسیژن بر سیستم آنتی‏اکسیدانی و شروع فعالیت‏های آنزیمی مورد نیاز جهت فرآیند جوانه‏زنی بذر می‏باشد. افزایش میزان تولید پراکسید هیدروژن و مالون دی‏آلدئید در غلظت‏های بالای اسید سالیسیلیک نیز دلیلی بر این مدعا بوده زیرا افزایش بیشتر گونه‏های فعال اکسیژن در شرایط وقوع تنش اکسیداتیو دلیل عدم کارایی لازم سیستم‏های آنتی اکسیدانی آنزیمی تحت این شرایط می‏باشد که در این مطالعه این واقعیت مشهود بود. میزان پراکسید هیدروژن در نتیجه‏ی افزایش پراکسیداسیون لیپید با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک شدت زوال مصنوعی و مدت زمان انبارداری طبیعی افزایش یافت. این در حالی بود که فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت مورد نظر در این آزمایش نیز با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در فرآیند پرایمینگ بذر تا حدی افزایش یافت و از آن به بعد کاهش یافت. افزایش در شدت غلظت اسید سالیسیلیک تا 1800 میلی‏گرم بر لیتر سبب تولید بیشتر پراکسید هیدروژن در بذور شد ولی در این شدت از زوال تجمع پرکسید هیدروژن و سایر گونه‏های فعال اکسیژن با اثر سیمت خود سبب غلبه آنها بر فعالیت سیستم آنتی‏اکسیدانی آنزیمی و کاهش فعالیت آنزیم‏های کاتالاز، پروکسیداز، آسکوربات پروکسیداز، سوپراکسیدیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز شد (Kong et al., 2016). آنزیم کاتالاز از مهمترین آنزیم‏های آنتی اکسیدانت بوده که با افزایش فعالیت در طی افزایش گونه‏های فعال اکسیژن می‏تواند خسارت های ناشی از این گونه‏ها را طی تنش اکسیداتیو کاهش دهد (توکل افشاری و همکاران، 1386). آنها بیان نمودند که با آبگیری بذور فعالیت آنزیم کاتالاز به طور چشمگیری افزایش یافت. آنزیم های آنتی اکسیدانت از جمله مکانیسم‏هایی هستند که میتوانند در پروسه ترمیمی بذور طی فرآیند تنش اکسیداتیو دخالت داشته و با تأثیر رویدادهای زوالگر در بذور مقابله نماید (توکل افشاری و همکاران، 1386). با افزایش آبگیری بذور میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت تا حدودی افزایش یافته، ولی از آن حد به بعد به دلیل افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن ممکن است این گونه‏های فعال بر فعالیت این آنزیم‏ها غلبه نموده و سبب کاهش کارایی آنها گردند.

 

 

 

شکل 5- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر فعالیت آنزیم کاتالاز بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 5- The effect of different seed priming treatments on catalase enzyme activity of pea seeds (columns with at least one similar letter do not have significant differences)

 

 

آنزیم پراکسیداز نیز روندی مشابه با آنزیم کاتالاز داشت و نتایج نشان داد در شرایط پرایمینگ بذر با مقدار 600 میلی‏گرم بر گرم اسید سالیسیلیک بالاترین فعالیت این آنزیم به مقدار 390 نانومول بر دقیقه بر گرم به‌دست آمد. روند تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز به گونه‏ای بود که افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک تا 1800 میلی‏گرم بر لیتر منجر به کاهش فعالیت آنزیم پراکسیداز تا مقدار 141 نانومول بر دقیقه بر گرم شد. این در حالی بود که فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار هیدروپرایمینگ با تیمار شاهد از نظر آماری اختلاف معنی‏داری وجود نداشت (شکل 6).

 

 

 

شکل 6- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر فعالیت آنزیم پروکسیداز بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 6- The effect of different seed priming treatments on the peroxidase enzyme activity of chickpea seeds (columns with at least one letter in common do not have significant differences)

 

 

براساس نتایج اساس نتایج این مطالعه مشخص شد که کمترین فعالیت آنزیم آسکوربات پروکسیداز در تیمار شاهد و به میزان 30 نانومول بر دقیقه بر گرم حاصل گردید. بالاترین فعالیت آن نیز در تیمار پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک 900 میلی‏گرم بر لیتر حاصل گردید. این نتایج همچنین نشان داد که هر چند فعالیت آنزیم آسکوربات پروکسیداز در تیمار هیدروپرایمینگ نیبت به تیمار شاهد بیشتر بود، ولی اختلاف آنها از نظر آماری معنی‏دار نبود (شکل 7). براساس نتایج مشخص شد که هیدروپرایمینگ منجر به افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت نسبت به تیمار شاهد شد. افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک در تیمار پرایمینگ بذر تا غلظت 600 میلی‏گرم در لیتر بود در حالی که افزایش فعالیت آنزیم‏های کاتالاز، آسکوربات پروکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز تا غلظت 900 میلی‏گرم بر لیتر بود و از این غلظت به بعد میزان فعالیت این آنزیم‏ها با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک در محلول پرایمینگ بذر کاهش یافت تا کمترین میزان فعالیت آنها در غلظت 1800 میلی‏گرم در لیتر از اسید سالیسیلیک به دست آمد. در مطالعه صور آذر و همکاران (1401) نیز مشخص شد که تیمارهای پرایمینگ بذر با آب منجر به افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت از قبیل کاتالاز و پراکسیداز شد که با یافته‏های حاصل از این مطالعه مطابقت داشت. افزایش غلظت اسید سالیسیلیک تا حدی منجر به افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت شد و از آن به بعد با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک میزان فعالیت آنها کاهش یافت. نتایج مشابهی در مطالعه صورآذر و همکاران (1401) گزارش شده است که تأیید کننده نتایج حاصل از این مطالعه می‏باشد. در توجیه کاهش فعالیت آنزیمی در شرایط افزایش غلظت اسید سالیسیلیک می‏توان عنوان داشت که افزایش بیش از حد غلظت اسید سالیسیلیک خود می‏تواند القا کننده تنش اکسیداتیو بوده و این احتمال وجود دارد که در برخی موارد، پاسخ هاي تنش با واسـطه اسید سالیسیلیک بـه افـزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن مانند پراکسید هیدروژن منجر به مهار فعالیت آنزیم کاتالاز گردد که در این مطالعه مشهود بود. ممکن است دلیل این فرآیند اثر سالیسـیلات بـر کمـپلکس‏هاي حاوي آهن از طریق کلات کردن آهن باشد (Liu et al., 2016). همچنین در مطالعه‏ای دیگر مشخص شد که کاربرد اسید سالیسیلیک تا غلظت مشخصی منجر به افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت گردید و با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک در محلول، میزان فعالیت این آنزیم‏ها با کاهش قابل توجه مواجه گردید (Zhang et al., 2015)، که با یافته‏های حاصل از این مطالعه مطابقت داشت. همچنین عنوان شده است که در شرایط افزایش بیش از اندازه تولید گونه‏های فعال اکسیژن، کاهش فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت رخ داده و همین امر سبب افزایش پراکسیداسیون لیپید می‏گردد (Yousif Abdullah Al Hijab et al., 2024). به دنبال کاهش کارایی سیستم آنتی‏اکسیدانی در شرایط افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن در فرآیند پرایمینگ بذر قابلیت جوانه‏زنی بذور با تجمع گونه‏های فعال اکسیژن کاهش می‏یابد (Wojtyla et al., 2016).Yousif Abdullah Al Hijab و همکاران (2024) بیان نمود که تجمع پراکسید هیدروژن سبب افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و به دنبال آن افزایش تولید مالون‏دی‏آلدئید شده که در نهایت سبب کاهش قابلیت حیات بذور می‏گردد. همچنین در این زمینه گزارش شده است که فعالیت بالاي آنـزیم‏های آنتی‏اکسیدان در گیاهچه‏هاي پیش تیمار شده ممکن است سـلول را بـراي مقابلـه و غلبـه بـر تـنش از طریق تثبیت غشـأها و تشکیل یـک ظرفیـت بـالا بـراي مقاومت در برابر اکسیداسیون آماده کند (Amuaghaee, 2011). پرایمینـگ بـذر آویشـن بـاغی با اسید سالیسیلیک موجـب افـزایش فعالیـت سیستم دفاع آنتی‏اکسیدان آنزیمی مثل آنزیم های CAT، SOD،PPO  و POD شده است (Mahmoodi Tarkhorani et al., 2017).  هنگـــامی کـــه اسید سالیسیلیک در غلظت و زمان مناسب بـه کـار بـرده می‏شود با تغییر فعالیت آنزیم هـایی نظیـر سـوپر اکسـید دیسموتاز، کاتالاز، آسـکوربات پراکسـیداز یـا آنـزیم‏هـاي دخیـل در تولیـد یـا تجزیـه پراکسید هیدروژن متصل بـه غشـأي سیتوپلاسمی موجب افزایش موقـت و جزیـی در مقـدار پراکسید هیدروژن شده که منجر به القاي ظرفیـت آنتـی‏اکسـیدانی سلول می‏گردد (Hayat et al., 2007).

 

 

 

شکل 7- تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر فعالیت آنزیم آسکوربات پروکسیداز بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 7- Different treatments of seed priming on the level of ascorbate peroxidase enzyme activity of chickpea seeds (columns with at least one letter in common do not have significant differences)

 

 

با افزایش غلظت اسید سالیسیلک در فرآیند پرایمینگ بذر تا غلظت 900 میلی‏گرم بر لیتر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز تا مقدار 46/1 میکرومول بر دقیقه بر گرم افزایش یافت. افزایش بیشتر غلظت سالیسیلک اسید منجر به کاهش فعالیت این آنزیم شد، به طوری که کمترین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در تیمار پرایمینگ با اسید سالیسیلیک 1800 میلی‏گرم در لیتر به مقدار 12/0 میکرومول بر دقیقه بر گرم به‌دست آمد. اختلاف بین دو تیمار شاهد و هیدروپرایمینگ نیز از نظر آماری معنی‏دار نبود (شکل 8).

 

 

شکل 8- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 8- The effect of different seed priming treatments on the activity level of superoxide dismutase enzyme in chickpea seeds (columns with at least one letter in common do not have significant differences)

 

 

فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز نیز تحت تأثیر سطوح مختلف تیمار پرایمینگ بذر قرار گرفت. بر اساس این نتایج مشخص شد که بالاترین و کمترین میزان فعالیت این آنزیم به مقادیر 99/0 و صفر میکرومول بر دقیقه بر گرم به ترتیب در تیمارهای پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک در غلظت های 900 و 1800 میلی‏گرم بر لیتر حاصل گردید. نتایج همچنین نشان داد اختلاف بین فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در دو تیمار هیدروپرایمینگ (56/0 میکرومول بر دقیقه بر گرم) و شاهد (42/0 میکرومول بر دقیقه بر گرم) از نظر آماری معنی‏دار بود (شکل 9). در شرایط پرایمینگ بذر یا اسیدسالیسیلیک 1800 میلی‏گرم بر لیتر فعالیت آنزیم‏های سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز کمترین میزان بود که نشانه عدم کارایی این آنزیم ها برای مقابله با افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن در این غلظت از اسید سالیسیلیک می‏باشد. این شرایط به احتمال زیاد با شروع فرآیندهای بعدی زمینه‏ساز شروع جوانه‏زنی بذر همراه است که با تولید انبوه گونه‏های فعال اکسیژن همراه می‏باشد (Yousif Abdullah Al Hijab et al., 2024). Ellouzi و همکاران (2023) بیان داشتند که گلیکاسیون غیرآنزیمی در مرحله‏ی اول از سری واکنشهای آمادوری و مایلارد منجر به کاهش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز میشود که این فرآیند در سطح تیمار 1800 میلی‏گرم بر لیتر از تیمار پرایمینگ مشهود بود. کاهش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در شرایط پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک 1800 میلی‏گرم بر لیتر نیز به احتمال زیاد به دلیل کاهش سطوح گلوتاتیون احیا شده که یک فاکتور مهم در جلوگیری از خسارت اکسیداتیو می‏باشد (Hongna et al., 2021). به نظر می‏رسد در پرایمینگ بذر یا اسید سالیسیلیک 1800 میلی‏گرم بر لیتر میزان گلوتاتیون احیا شده نسبت به غلظت‏های کمتر اسید سالیسیلیک کاهش بیشتری داشته و در نتیجه میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در غلظت 1800 میلی‏گرم بر لیتر در فرآیند پرایمینگ بذر کاهش بیشتری داشته است. به هر حال نتایج این مطالعه نشان داد که با افزایش غلظت اسید سالیسیلیک به میزان زیاد میزان پراکسیداسیون لیپید و تولید گونه‏های فعال اکسیژن بیشتر شده که ممکن است کارایی آنزیم‏های آنتی اکسیدانت کاهش یافته و در نهایت منجر به عدم کارایی آنها در غلظت های بسیار بالا گردد که همین امر تا حدودی خود می‏تواند به دلیل نقش اسیدسالیسیلیک در غلظت های بالا در وقوع تنش اکسیداتیو در بذر باشد که سامانه‏های آنتی‏اکسیدانی آنزیمی را با اختلال مواجه نموده است (Ellouzi et al., 2023).

 

 

 

شکل 9- اثر تیمارهای مختلف پرایمینگ بذر بر فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز بذور نخود (ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشابه باشند دارای تفاوت معنی‏دار با هم نمی‏باشند)

Fig 9- The effect of different seed priming treatments on glutathione reductase enzyme activity of pea seeds (columns with at least one letter in common do not have significant differences)

 

 

نتیجه‌گیری کلی

پرایمینگ بذر با آب و اسید سالیسیلیک منجر به تغییراتی در مقدار آنتی‏اکسیدانت‏های غیرآنزیمی و فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت گردید. هیدروپرایمینگ و پرایمینگ بذر با اسید سالیسیلیک تا غلظت 600 الی 900 میلی‏گرم بر لیتر منجر به افزایش میزان پرولین، اسید آسکوربیک و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پروکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز گردید. براساس نتایج این مطالعه مشخص شد که پرایمینگ بذر با آب و اسید سالیسیلیک تا غلظت 600 الی 900 میلی‏گرم بر لیتر منجر به افزایش میزان آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت گردید. از طرفی با افزایش بیشتر غلظت اسید سالیسیلیک تا 1800 میلی‏گرم بر لیتر به دلیل افزایش تولید مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن از میزان و فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و غیرآنزیمی کاسته شد.

منابع 

1)       پرمون، ق.، عبادی، ع.، جهانبخش گده کهریز، س. و م، داوری. 1393. تأثیر پرایمینگ با اسید سالیسیلیک بر خصوصیات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بذور پیر شده ماریتیغال. نشریه تولید گیاهان زراعی، 7(4): 223-234.

2)       توکل افشاری، ر.، قاسم، ف.، مجنون حسینی، ن.، علیزاده، ه. و م.ر، بی همتا. 1386. تأثیر پیری بذر بر صفات جوانه‏زنی و فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت کاتالاز و پراکسیداز در ژنوتیپ‏های جو. مجله علوم کشاورزی ایران، 37(2): 337-346.

3)       شعبان، م.، قادری فر، ف.، صادقی پور، ح.ر. و ا، یامچی. 1397. بررسی جوانه زنی و فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و غیرآنزیمی کلیدی دخیل در زوال بذر نخود در طی انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی. نشریه تولید گیاهان زراعی، 11(7): 71-51.

4)       صورآذر، خ.، صدقی، م. و ر، سیدشریفی. 1401. تأثیر انواع پرایمینگ بر صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی لوبیا قرمز تحت تنش کلریدکبالت. پژوهش هاي بذر ایران، 9(1): 126-111.

5)       Amuaghaee, R. 2011. The effect of hydro and osmopriming on alfalfa seed germination and antioxidant defenses under salt stress. African Journal of Biotechnology, 10(3): 6269-6275.

6)       Aymen, E.M. 2018. Seed Priming with Plant Growth Regulators to Improve Crop Abiotic Stress Tolerance. In: Rakshit, A. and H.B, Singh. (eds.). Advances in Seed Priming. Institute of Agricultural Sciences, BHU, Varanasi, Uttar Pradesh, India, 95-106.

7)       Basit, F. Bhat, J.A. Ulhassan, Z. Noman, M. Zhao, B. Zhou, M. and W.Y, Guan. 2022. Seed priming with spermine mitigates chromium stress in rice by modifying the ion homeostasis, cellular ultrastructure and phytohormones Balance. Antioxidants, 11: 1704. 

8)       Bates, L.S., Walden, R.P. and I.D, Teave. 1973. Rapid defermination of free praline for water stress studies. Plant and Soil, 39: 205-207.

9)       Bose, B., Kumar, M. Singhal, R.K. and S, Mondal. 2018. Impact of Seed Priming on the Modulation of Physico-chemical and Molecular Processes during Germination, Growth, and Development of Crops. In: Rakshit, A. and Singh, H.B. (eds.). Advances in Seed Priming. Institute of Agricultural Sciences, BHU, Varanasi, Uttar Pradesh, India, 23-40.

10)       Eftekhar, N., Fallah, S., Abbasi Sooraki, A., Khodaverdiloo, H. and A, Rahimi. 2019. Effect of salicylic acid and potassium nitrate pretreatment on enhancing the sunflower tolerance in contaminated soils with cadmium. Iranian Journal of Seed Sciences and Research, 6(2): 161-175.

11)       Ellouzi, H., Zorrig, W., Amraoui, S., Oueslati, S., Abdelly, C., Rabhi, M. and H.M, Kadambot. 2023. "Seed Priming with Salicylic Acid Alleviates Salt Stress Toxicity in Barley by Suppressing ROS Accumulation and Improving Antioxidant Defense Systems, Compared to Halo- and Gibberellin Priming" Antioxidants, 12: (9): 1779. https://doi.org/10.3390/antiox12091779.

12)       Eskandari, H. 2012. Seed quality variation of crop plants during seed development and maturation. International Journal of Plant Production, 3(11): 557-560.

13)       Ghiazdowska, A., Krasuska, U. and R, Bogatek. 2010. Dormancy removal in apple embryos by nitric oxid or cyanide involves modifications in ethylene biosynthetic pathway. Planta, 232: 1397-1407.

14)       Gill, S.S. and N, Tuteja. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909-930.

15)       Goel, A., Coel, A.K. and I.S, Sheoran. 2023. Changes in oxidative stress enzymes during artificial ageing in cotton (Gossypium hirsutum L.) seeds. Journal of Plant Physiology, 160: 1093-1100.
Hoekstra, F.A., Golovina, E.A. and J, Buitink. 2021. Mechanisms of plant desiccation tolerance. Trends in Plant Sciences, 6: 431–438.

16)       Gul, F., Arfan, M., Shahbaz, M. and S, Basra. 2020. Salicylic acid seed priming modulates morphology, nutrient relations and photosynthetic attributes of wheat grown under cadmium stress. International Journal of Agriculture and Biology, 23: 197-204.

17)       Hongna, C., Leyuan, T., Junmei, S., Xiaori, H. and C, Cheng Xianguo. 2021. Exogenous salicylic acid signal reveals an osmotic regulatory role in priming the seed germination of Leymus chinensis under salt-alkali stress. Environmental and Experimental Botany, 188: 104–498.

18)       Jisha, K.C., Vijayakumari, K. and J.T, Puthur. 2013. Seed priming for abiotic stress tolerance: an overview. Acta Physiologiae Plantarum, 35(5): 1381-1396.

19)       Khan, W., Prithiviraj, B. and D, Smith. 2023. Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. Plant Physiology, 160: 485-492.

20)       Kong, L., Huo, H. and P, Moa. 2015. Antioxidant response and related gene expression in aged oat seed. Frontiers in Plant Science, 6: 1-9.

21)       Lehner, A., Mamadou, N., Poels, P., Come, D., Bailly, C. and F, Corbineau. 2008. change in soluble carbohydrates, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activityes in the embryo during aging in wheat grains. Journal of Cereal Science, 47(3): 555-565.

22)       Liu, X., Quan, W. and D, Bartels. Stress memory responses and seed priming correlate with drought tolerance in plants: An overview. Planta, 255: 45. 

23)       Liu, Z., Ding, Y., Wang, F., Ye, Y. and C, Zhu. 2016. Role of salicylic acid in resistance to cadmium stress in plants. Plant Cell Reports, 35(4): 719-731.

24)       Luck, H. 1962. Methods of enzymatic analysis. E.B. By Bergmeyer (1th edition), Verlag chemie Weinheim, 885-894.

25)       Minami, M. and H, Yoshikawa, 1979. A simplified assay method of superoxide dismutase activity for clinical use. Clinival and Chimical Acta, 92: 337–342.

26)       Mira, S., Estrelles, E. and M.E, González-Benito. 2015. Effect of water content and temperature on seed longevity of seven Brassicaceae species after 5 years of storage. Plant Biology, 17: 153–162.

27)       Moller, I.M., Jensen, P.E. and A, Hansson. 2017. Oxidative modifications to cellular components in plants. Annual Review in Plant Bioligy, 58: 459–481.

28)       Nouairi, I., Jalali, K., Zribi, F., Barhoumi, F., Zribi, K. and H, Mhadhbi. 2019. Seed priming with calcium chloride improves the photosynthesis performance of faba bean plants subjected to cadmium stress. Photosynthetica, 57(2): 438-445.

29)       Oliveira, J.T.A., Andrade, N.C., Martins-Miranda, A.S., Soares, A.A., Gondim, D.M.F. and J.H, Araujo. 2012. Differential expression of antioxidant enzymes and PR-proteins in compatible and incompatible interactions of cowpea (Vigna unguiculata) and the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Plant Physiology and Biochemistry, 51: 145–152.

30)       Raskin, I. 2022. Role of salicylic acid in plants. An. Rev. Plant Physiology, 43: 168-160.

31)       Resenda, M.L.V., Nojosa, G.B.A., Cavalcanti, L.S., Aguilar, M.A.G., Silva, L.H.C.P., Perez, J.O., Sairam, P.K., Deshmukh, P.S. and D.S, Shukla. 2017. Tolerance of drought and temperature stress in relation to increased antioxidant enzyme activity in wheat. Journal of Agronomy and Crop Science, 178: 171- 178.

32)       Sgherri, C.L.M., Liggini, B. Puliga, S. and F, Navari-Izzo. 1994. Antioxidant system in Sporoblus stapfianus. Changes in response to desiccation and rehydration, Phytochemistry, 35: 561-565.

33)       Singh, H., Jassal, R.K., Keng, J.S., Sandhu, S.S., Kang H. and K, Grewal. 2015. Seed priming techniques in field crops - a review. Agricultural Review, 36(4): 251-264.

34)       Wani, A.S., Ahmad, A., Hayat, S. and I, Tahir. Epibrassinolide and proline alleviate the photosynthetic and yield inhibition under salt stress by acting on antioxidant system in mustard. Plant Physiology and Biochemistry, 135: 385–394.

35)       Wojtyla, Ł., Garnczarska, M., Zalewski, T., Bednarski, W., Ratajczak, L. and S, Jurga. 2016. A comparative study of water distribution, free radical production and activation of antioxidative metabolism in germinating pea seeds. Journal of Plant Physiology, 163: 1207–1220.

36)       Yousif Abdullah Al Hijab, L., Al-Hazmi, N. E. and D.M, Naguib. 2024. Rhizobacteria-priming improves common bean seeds germination under different abiotic stresses through improving hydrolysis and antioxidant enzymes kinetics parameters. Rhizosphere, 29: 100842.

37)       Zhang, M., Zhuo, J. J., Wang, X., Wu, S. and X.F, Wang. 2010. Optimizing seed water content: relevance to storage stability and molecular mobility. Journal of integrative plant biology, 52: 324–33.

38)       Zhang, Y., Xu, S., Yang, S. and Y, Chen. 2015. Salicylic acid alleviates cadmium-induced inhibition of growth and photosynthesis through upregulating antioxidant defense system in two melon cultivars (Cucumis melo L.). Protoplasma, 252(3): 911-924.