تاثیر عناصر ترانسپوزونی بر بهبود بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین در سلول‌های تخمدان همستر چینی
محورهای موضوعی : فصلنامه زیست شناسی جانوری
ریحانه لهراسبی
1
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
سیده هدی جزایری
2
(دانشکده علوم نوین، دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی، تهران، ایران)
عباس دانشی پور
3
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
زهرا هلفی نژاد
4
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
ربابه محمدی
5
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
پریسا جاویدزاده
6
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
امیر امیری یکتا
7
(پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران)
کلید واژه: عنصر ترانسپوزونی, رده‌ی سلولی دارای بیان بالا, PiggyBac, اریتروپوئتین, پروتئین نوترکیب دارویی, CHO DG44.,
چکیده مقاله :
در صنعت زیست‌داروها و تولید پروتئین‌های نوترکیب به دلیل بازده پایین درج ژن هدف در ژنوم سلول میزبان و همچنین ادغام در مناطق هتروکروماتین که منجر به سرکوب رونویسی و ناپایداری بیان توالی مورد نظر می‌گردد، دستیابی به سلول‌های دارای بیان بالا با چالش رو برو است. به منظور غلبه بر این محدودیت‌ها، می‌توان از ترانسپوزون‌ها که عناصر ژنتیکی متحرک بوده و با مکانیسم Cut and Paste توانایی برش و درج قطعات هدف در نواحی خاصی از ژنوم را دارا می‌باشند، استفاده کرد. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر عنصر ترانسپوزونی PiggyBac بر میزان بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین و دست پیدا کردن به رده‌ی سلولی دارای بیان بالا دست می¬باشد. ابتدا توالی ژن اریتروپوئتین نوترکیب (rEPO) بهینه‌شده بر اساس ارجحیت کدونی سلول CHO در وکتور pOptiVECTM همسانه‌سازی شد. جهت ایجاد دومین وکتور بیانی، قطعه‌ی EPO-IRES-DHFR در پلاسمید PB513B-1 درج و سپس مراحل همسانه‌سازی در هر دو ناقل با استفاده از واکنش Colony PCR، هضم آنزیمی و توالی‌یابی سنگر تایید شد. جهت ایجاد لاین سلولی پایدار، هر دو وکتور به طور مجزا به سلول CHO DG44 ترانسفکت و سپس غربالگری آن‌ها انجام شد. پس از تایید درج وکتورها درون ژنوم سلول هدف، میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت و پروتئین به ترتیب با استفاده از تست‌های qRT-PCR و وسترن بلاتینگ در دو رده‌ی سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از آزمایش Real-Time PCR، افزایش 188 برابری میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در لاین سلولی PB513B-1-EPO نسبت به pOptiVEC-EPO را نشان داد. همچنین یافته‌های آزمایش وسترن بلاتینگ، سنتز و ترشح صحیح این پروتئین را تایید کرد. بررسی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که عنصر ترانسپوزونی به صورت چشمگیری سبب افزایش بیان ژن موردنظر در سطح رونوشت شده و توانایی ایجاد رده‌ی سلولی با بیان بالا از پروتئین هدف را دارا است.
In pharmaceutical biotechnology and recombinant protein production, due to the low efficacy of inserting the target gene into the host gene genome and its integration into the heterochromatin regions, which leads to the suppression of transcription as well as the instability of the expression of the desired sequence, achieving cells with highexpression is a challenge. To overcome the limitations transposons, which are mobile genetic elements and have the ability to cut and insert target fragments in certain regions of the genome with the “Cut and Paste” mechanism, are effective. This research aims to evaluate the effect of the PiggyBac transposon vector on the expression level of recombinant Erythropoietin (rEPO) protein and to find a cell line with high expression. First the optimized rEPO sequence based on CHO codon performance was cloned into the pOptiVECTM plasmid. To create the second expression vector, the EPO-IRES-DHFR fragment was inserted into the PB513B-1 plasmid, and then the homogenization steps in both vectors were confirmed using Colony PCR reaction, enzyme digestion, and Sanger sequencing. In order to create a stable cell line, both vectors were separately transfected into CHO DG44 cells and then screened. After confirming the insertion of the vectors into the genome of the target cell, the level of erythropoietin gene expression at the transcript and protein level was checked using qRT-PCR and western blotting tests, respectively, in two cell lines. The Real-Time PCR data indicate a 188-fold increase in erythropoietin gene transcript in the PB513B-1-EPO cell line compared to pOptiVEC-EPO. Additionally, the western blotting test's result confirmed the correct synthesis and secretion of this protein. Analysis of findings in this research revealed that the transposon element significantly increased the expression of the desired gene at the transcriptional level and had could create a cell line with high expression of the target protein.
1. Barnes L.M., Bentley C.M., Dickson A.J. 2004. Molecular definition of predictive indicators of stable protein expression in recombinant NS0 myeloma cells. Biotechnology and Bioengineering, 85(2):115-121.
2. Barnes L.M., Bentley C.M., Dickson A.J. 2003. Stability of protein production from recombinant mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering, 81(6):631-639.
3. Burnight ER, Staber JM, Korsakov P, Li X, Brett BT, Scheetz TE, 2012. A hyperactive transposase promotes persistent gene transfer of a piggyBac DNA transposon. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2012(1):50-62.
4. Chusainow J, Yang YS, Yeo JH, Toh PC, Asvadi P, Wong NS, 2009. A study of monoclonal antibody‐producing CHO cell lines: What makes a stable high producer? Biotechnology and Bioengineering, 102(4):1182-1196.
5. Dahodwala H., Lee K.H. 2019. The fickle CHO: a review of the causes, implications, and potential alleviation of the CHO cell line instability problem. Current Opinion in Biotechnology, 60:128-137.
6. Dehnavi E., Siadat S.O.R., Roudsari M.F., Khajeh K. 2016. Cloning and high-level expression of β-xylosidase from Selenomonas ruminantium in Pichia pastoris by optimizing of pH, methanol concentration and temperature conditions. Protein Expression and Purification, 124:55-61.
7. Domínguez Á., Fermiñán E., Sánchez M., González F.M., Pérez-Campo F.M., García S., 1998. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. International Microbiology, 1(2):131-142.
8. Galvan D.L., Nakazawa Y., Kaja A., Kettlun C., Cooper L.J., Rooney C.M. 2009. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. Journal of Immunotherapy, 32(8):837.
9. Ghavim M., Abnous K., Arasteh F., Taghavi S., Nabavinia M.S., Alibolandi M., 2017. High level expression of recombinant human growth hormone in Escherichia coli: crucial role of translation initiation region. Research in Pharmaceutical Sciences, 12(2):168.
10. Grabherr R., Nilsson E., Striedner G., Bayer K. 2002. Stabilizing plasmid copy number to improve recombinant protein production. Biotechnology and Bioengineering, 77(2):142-147.
11. Grabundzija I., Irgang M., Mátés L., Belay E., Matrai J., Gogol-Döring A. 2010. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy, 18(6):1200-1209.
12. Huang X., Guo H., Tammana S, Jung Y.C., Mellgren E., Bassi P. 2010. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Molecular Therapy, 18(10):1803-1813.
13. Kim C.H., Oh Y., Lee T.H. 1997. Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells. Gene, 199(1-2):293-301.
14. Lalonde M.E., Durocher Y. 2017. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology, 251:128-140.
15. Li Z.M., Fan Z.L., Wang X.Y., Wang T.Y. 2022. Factors affecting the expression of recombinant protein and improvement strategies in chinese Hamster ovary cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 10:880155.
16. Makino T., Skretas G., Georgiou G. 2011. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories, 10(1):1-10.
17. Meir Y.J., Weirauch M.T., Yang H.S, Chung P.C., Yu R.K., Wu S.C. 2011. Genome-wide target profiling of piggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnology, 11:1-19.
18. Muñoz-López M., García-Pérez J.L. 2010. DNA transposons: nature and applications in genomics. Current Genomics, 11(2):115-128.
19. Okumura T., Masuda K., Watanabe K., Miyadai K., Nonaka K., Yabuta M. 2015. Efficient enrichment of high-producing recombinant Chinese hamster ovary cells for monoclonal antibody by flow cytometry. Journal of Bioscience and Bioengineering, 120(3):340-346.
20. Peng C., Shi C., Cao X., Li Y., Liu F., Lu F. 2019. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7(139):1-9.
21. Ritacco F.V., Wu Y., Khetan A. 2018. Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies. Biotechnology Progress, 34(6):1407-1426.
22. Sandoval-Villegas N., Nurieva W., Amberger M., Ivics Z. 2021. Contemporary transposon tools: a review and guide through mechanisms and applications of sleeping beauty, piggyBac and Tol2 for genome engineering. International Journal of Molecular Sciences, 22(10):5084-5113.
23. Stach C.S., McCann M.G., O’Brien C.M., Le T.S., Somia N., Chen X., 2019. Model-driven engineering of N-linked glycosylation in Chinese hamster ovary cells. ACS Synthetic Biology, 8(11):2524-2535.
24. Walsh G. 2018. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology, 36(12):1136-1145.
25. Wang T.Y., Guo X. 2020. Expression vector cassette engineering for recombinant therapeutic production in mammalian cell systems. Applied Microbiology and Biotechnology, 104(13):5673-5688.
26. Wei M., Mi C.L., Jing C.Q., Wang T.Y. 2022. Progress of transposon vector system for production of recombinant therapeutic proteins in mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 10:879222.
27. Wilson M.H., Coates C.J., George A.L. 2007. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Molecular Therapy, 15(1):139-145.
28. Wurm F.M. 2004. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology, 22(11):1393-1398.
29. Yang Y., Chusainow J., Yap M.G. 2010. DNA methylation contributes to loss in productivity of monoclonal antibody-producing CHO cell lines. Journal of Biotechnology, 147(3-4):180-185.
بررسی تاثیر عناصر ترانسپوزونی بر بهبود بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین در سلول‌های تخمدان همستر چینی
ریحانه لهراسبی1، سیده هدی جزایری2، عباس دانشی‌پور1، زهرا هلفی‌نژاد1، ربابه محمدی1، پریسا جاویدزاده1، امیر امیری‌یکتا1*
1پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولید مثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
2 دانشکده علوم نوین، دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی، تهران، ایران
*مسئول مکاتبات: amir.amiriyekta@royaninstitute.org
چکیده:
در صنعت زیست‌داروها و تولید پروتئین‌های نوترکیب به دلیل بازدهی پایین درج ژن هدف در ژنوم سلول میزبان و همچنین ادغام در مناطق هتروکروماتین که منجر به سرکوب رونویسی و همچنین ناپایداری بیان توالی مورد نظر می‌گردد، دستیابی به سلول‌های دارای بیان بالا با چالش رو برو است. به منظور غلبه بر این محدودیت‌ها، می‌توان از ترانسپوزون‌ها که عناصر ژنتیکی متحرک بوده و با مکانیسم "Cut and Paste" توانایی برش و درج قطعات هدف در نواحی خاصی از ژنوم را دارا می‌باشند، استفاده کرد. در این پژوهش قصد داریم که تاثیر عنصر ترانسپوزونی PiggyBac را بر میزان بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین بررسی کرده و به رده‌ی سلولی دارای بیان بالا دست پیدا کنیم.ابتدا توالی ژن اریتروپوئتین نوترکیب (rEPO) بهینه‌شده بر اساس ارجحیت کدونی سلول CHO در وکتور pOptiVECTM همسانه‌سازی شد. جهت ایجاد دومین وکتور بیانی، قطعه‌ی EPO-IRES-DHFR در پلاسمید PB513B-1 درج و سپس مراحل همسانه‌سازی در هر دو ناقل با استفاده از واکنش Colony PCR، هضم آنزیمی و توالی‌یابی سنگر تایید شد. جهت ایجاد لاین سلولی پایدار، هر دو وکتور به طور مجزا به سلول CHO DG44 ترانسفکت و سپس غربالگری آن‌ها انجام شد. پس از تایید درج وکتورها درون ژنوم سلول هدف، میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت و پروتئین به ترتیب با استفاده از تست‌های qRT-PCR و وسترن بلاتینگ در دو رده‌ی سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از آزمایش Real-Time PCR، افزایش 188 برابری میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در لاین سلولی PB513B-1-EPO نسبت به pOptiVEC-EPO را نشان داد. همچنین یافته‌های آزمایش وسترن بلاتینگ، سنتز و ترشح صحیح این پروتئین را تایید کرد. بررسی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که عنصر ترانسپوزونی به صورت چشمگیری سبب افزایش بیان ژن موردنظر در سطح رونوشت شده و توانایی ایجاد رده‌ی سلولی با بیان بالا از پروتئین هدف را دارا است.
کلمات کلیدی: عنصر ترانسپوزونی، رده‌ی سلولی دارای بیان بالا، PiggyBac، اریتروپوئتین، پروتئین نوترکیب دارویی، CHO DG44
مقدمه
در سال‌های اخیر پروتئین‌های نوترکیب دارویی، سریع‌ترین بخش در حال رشد صنعت زیست‌داروها را تشکیل داده و امروزه بیش از 300 داروی مبتنی بر پروتئین در ایالات متحده‌ی آمریکا و اروپا تایید و مورد استفاده قرار گرفته‌اند (1). به طور کلی تقاضا برای استفاده از این داروها رو به افزایش بوده و به کارگیری تکنیک‌ها و استراتژی‌هایی جهت بهبود و افزایش تولید آن‌ها از اهمیت بالایی برخوردار است (2). در میان سیستم‌های بیانی، سلول‌های تخمدان همستر چینی ((CHO) Chinese hamster ovary) با توجه به دارا بودن تغییرات پس از ترجمه‌ی مشابه پروتئین‌های انسانی، توانایی رشد در محیط‌های کشت سوسپانسیون فاقد سرم و کاملا مشخص با چگالی بالا و همچنین ایمن بودن نسبت به عفونت‌های ویروسی انسانی، برای تولید پروتئین‌های نوترکیب دارویی ارجحیت دارند (3-6).
صرف نظر از انتخاب میزبان مناسب، بهینه‌سازی توالی ژن هدف، انتخاب پروموتر مناسب، به کارگیری عناصر تنظیم‌کننده‌ی کروماتین و فاکتورهای رونویسی و همچنین استفاده از سیگنال‌های ترشحی برای بهبود کیفیت و کمّیت پروتئین نوترکیب ضروری هستند (7-10). با این حال، همچنان تولید رده‌ی سلولی با بازدهی بالا از ژن مورد نظر یکی از چالش‌های بزرگ و مهم پیش روی محققین در این زمینه است (11, 12). تکنیک درج تصادفی به صورت متداول برای دستیابی به سلول‌های دارای بیان بالا از ژن هدف، مورد استفاده قرار می‌گیرد؛ اما عوامل خاموش‌کننده‌ی رونویسی و همچنین درج در نواحی هتروکروماتین می‌تواند بیان ترانس‌ژن را تحت تاثیر قرار دهند (13-16). به همین منظور هدف قراردادن مناطق فعال رونویسی در ژنوم سلول میزبان می‌تواند بهبود و افزایش میزان بیان پروتئین مورد نظر را در پی داشته باشد. ترانسپوزون‌ها، عناصر DNAای متحرک حاوی توالی‌های معکوس تکرارشونده ((ITRs) Inverted terminal repeats) و ترانسپوزاز هستند که با به کارگیری استراتژی "Cut and Paste" در میان ژنوم جا به جا می‌شوند (17, 18). طی این فرآیند، آنزیم ترانسپوزاز توالی‌های کوتاه خاصی را که در ITRهای موجود در ناقل ترانسپوزونی قرار دارد، شناسایی کرده و برش می‌دهد. سپس دو رشته‌ی DNA را در نواحی مشخصی هضم و قطعات ترانسپوزون را درج می‌کند (19). در میان عناصر ترانسپوزونی، PiggyBac (PB) که توالی‌های TTAA در ژنوم سلول را مورد هدف قرار می‌دهد، به صورت متداول در حوزه‌ی بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار گرفته و توالی احاطه شده با ITR را در نواحی بالادست مناطق شروع رونویسی، جزایر CpG و مناطق حساس به DNaseI که از لحاظ رونویسی بسیار فعال هستند، درج می‌کند (19, 20). همین امر سبب شده تا جمعیت‌های سلولی به دست آمده از ترانسپوزون PB، دارای بازده و بیان بالاتری نسبت به سایر روش‌های متداول تولید رده‌ی سلولی باشند (21).
در این مطالعه ابتدا، توالی SRP (Signal recognition particle) و ژن اریتروپوئتین نوترکیب ((rEPO) Recombinant Erythropoietin) بهینه‌سازی شده بر اساس ارجحیت کدونی سلول CHO، در دو وکتور بیانی pOptiVECTM و PB513B-1، تحت پروموتر CMV همسانه‌سازی شده و پس از دستیابی به جمعیت‌های پایدار از هر دو ناقل در سلول CHO DG44، تاثیر عنصر ترانسپوزونی بر میزان بیان ژن هدف، مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
آماده‌سازی سازه‌های ژنی
در این پژوهش توالی اریتروپوئتین نوترکیب انسانی به عنوان ژن هدف به کار گرفته شد. ابتدا توالی این ژن و SRP که به منظور ترشح شدن پروتئین نوترکیب به خارج از سلول، دقیقا پیش از توالی هدف قرارگرفته، براساس ارجحیت کدونی سلول CHO DG44 بهینه و پس از سنتز در وکتور pUC57 دریافت شد. وکتور PB513B-1، ناقل حاوی عنصر ترانسپوزونی بوده و پلاسمید pOptiVECTM به عنوان کنترل در نظر گرفته شده است. شکل شماره‌ی 1 این دو وکتور بیانی را به صورت شماتیک نشان می‌دهد.
شکل 1. تصویر شماتیک دو وکتور بیانی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO. A) به منظور ساخت وکتور pOptiVEC-EPO، توالی اریتروپوئتین از طریق واکنش PCR بر وکتور pUC57 تکثیر و سپس در پلاسمید pOptiVECTM همسانه‌سازی شد. B) جهت تکثیر قطعه‌ی EPO-IRES-DHFR، وکتور pOptiVEC-EPO به عنوان الگوی واکنش PCR قرار گرفت. سپس توالی تکثیر شده به پلاسمید PB513B-1 منتقل شد.
طراحی و ساخت سازه ژنی برپایه‌ی وکتور pOptiVECTM حاوی ژن اریتروپوئتین: به منظور همسانه‌سازی ژن اریتروپوئتین نوترکیب در وکتور pOptiVECTM، ابتدا واکنش هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های XbaI و NotI (ThermoScientific) روی این پلاسمید انجام و سپس جهت آماده‌سازی این ناقل برای مرحله‌ی الحاق، محصول این واکنش با استفاده از کیت High Pure PCR Product Purification (Roche) تخلیص شد. جهت تکثیر قطعه‌ی SRP و اریتروپوئتین نوترکیب که طولی برابر 593 جفت باز دارد، واکنش PCR روی وکتور pUC57-EPO با استفاده از آغازگرهای دارای جایگاه نشست آنزیم‌های XbaI و NotI در سمت ׳5 (جدول شماره‌ی 1) و آنزیم DNA پلیمراز Phusion (ThermoScientific) انجام و سپس قطعه‌ی تکثیرشده، تحت واکنش هضم با دو آنزیم بالا، برش خورده و با استفاده از کیت تجاری High Pure PCR Product Purification (Roche) تخلیص شد. پس از الحاق دو قطعه‌ی SRP-EPO و وکتور خطی‌شده pOptiVECTM ، ترانسفورماسیون محصول الحاق از طریق روش شوک گرمایی به باکتری E. coli سویه‌ی DH5α ، انجام شد. سپس تایید حضور وکتور نوترکیب در باکتری، از طریق واکنش Colony PCR و به دنبال آن هضم آنزیمی انجام و صحت توالی همسانه‌سازی شده در وکتور با روش توالی‌یابی سنگر بررسی شد.
طراحی و ساخت سازه‌ی ژنی PB513B-1 حاوی ژن اریتروپوئتین: ابتدا وکتور PB513B-1 (SBI) با استفاده از کیت High Pure Plasmid Isolation شرکت Roche از باکتری استخراج، با آنزیم‌های برشی XbaI و EcoRI (ThermoScientific) هضم و سپس به منظور حذف بافر، محصول واکنش با استفاده از کیت ذکر شده در بالا، تخلیص شد. باتوجه به اینکه وکتور pOptiVECTM در ساختار اصلی خود دارای قطعه‌ی IRES-DHFR است، پلاسمید pOptiVEC-EPO به عنوان الگو برای تکثیر توالی 1781 جفت بازی SRP-EPO-IRES-DHFR طی واکنش PCR انجام شده با آنزیم DNA پلیمراز Phusion (ThermoScientific) و آغازگرهای دارای جایگاه نشست دو آنزیم XbaI و EcoRI در انتهای ׳5 (جدول شماره‌ی 1)، قرار گرفت. سپس محصول واکنش با استفاده از کیت High Pure PCR Product Purification (Roche) تخلیص شد. در نهایت برش دو انتهای قطعه‌ی تکثیر شده، طی واکنش هضم با دو آنزیم XbaI و EcoRI (ThermoScientific) انجام و خالص‌سازی آن با استفاده از کیت ذکر شده در بالا صورت گرفت. پس از انجام واکنش الحاق پلاسمید خطی PB513B-1 و قطعه‌ی SRP-EPO-IRES-DHFR، وکتور نوترکیب از طریق روش شوک گرمایی به باکتری اشریشیاکولای، سویه‌ی DH5α، ترانسفورم و تایید کلون‌های مثبت با استفاده از واکنش Colony PCR و هضم آنزیمی انجام شد. سپس عدم وجود جهش در قطعه‌ی همسانه‌سازی شده، از طریق توالی‌یابی سنگر مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 1. آغازگرهای به کارگرفته‌شده در این پژوهش.
توالی آغازگر ('3 '5) | دمای اتصال | طول قطعه | هدف از استفاده | |
1 | ATATCTAGAGCCGCCACCATGGA | 63 | bp 593 | تکثیر قطعه‌ی SRP-EPO |
2 | ATTGCGGCCGCTTTTTTGTCG | 5/63 | ||
3 | ATATCTAGAGCCGCCACCATGGA | 63 | bp 1781 | تکثیر قطعه‌ی SRP-EPO-IRES-DHFR |
4 | CGGGAATTCGTTTTAGTCTTTCTTCTCG | 6/62 | ||
5 | ATGCTCCTCCTCGGCTGAT | 5/60 | bp 83 | بررسی درج سازه درون ژنوم سلول میزبان و واکنش Real-Time PCR بر روی ژن EPO |
6 | GGTGGTGATATTCTCGGCCTC | 3/60 | ||
7 | GACTTCAACAGCAACTCCCAC | 4/59 | bp 125 | انجام واکنش Real-Time PCR بر روی ژن GAPDH |
8 | TCCACCACCCTGTTGCTGTA | 1/61 |
ایجاد رده‌ی سلولی CHO DG44 نوترکیب
در این پژوهش از سلول‌های CHO DG44 به عنوان میزبان، جهت تولید پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین استفاده شد. ابتدا سلول‌های ترانسکفت‌نشده‌ی CHO DG44 با چگالی اولیه‌ی Cell/ mL 106 × 5/0، در محیط CD DG44 (Gibco) حاوی غلظت mM 8 از L-Glutamine (Gibco) و mL/L 18 از PluronicTM F-68 (Gibco) ذوب و پس از گذشت سه پاساژ و دستیابی به زنده‌مانی بالای 95%، برای ترانسفکشن آماده شدند. در تمامی مراحل، سلول‌ها در شرایط دمایی C° 37، 8 درصد CO2 و میزان رطوبت %85 نگه‌داری شدند. در ادامه به نحوه‌ی انتقال پایدار وکتورهای مورد نظر به سلول CHO DG44 پرداخته می شود.
تهیه‌ی لاین سلولی پایدار pOptiVEC-EPO: به منظور درج وکتور pOptiVEC-EPO درون ژنوم سلول هدف و ایجاد رده‌ی سلولی پایدار، این پلاسمید با استفاده از آنزیم PvuII (ThermoScientific) خطی و سپس تخلیص شد. 48 و 24 ساعت پیش از ترانسفکشن، سلول‌های CHO DG44 با چگالی اولیه‌ی Cell/ mL 106 × 3/0 در mL 3 محیط کشت کامل CD DG44 پاساژ و به پلیت 6 خانه منتقل شدند. در روز ترانسفکشن، پس از شمارش سلول‌ها و اطمینان حاصل کردن از تعداد Cell/ mL 106 × 5/0 سلول و درصد زنده‌مانی بالای 95، انتقال وکتور pOptiVEC-EPO با استفاده از واکنش‌گر (Reagent) FreeStyleTM Max بر اساس پروتکل سلول CHO DG44 شرکت Gibco انجام شد.
تهیه‌ی رده‌ی سلولی پایدار PB513B-1-EPO: جهت آماده‌سازی سلول‌های CHO DG44 برای ترانسفکت وکتور PB513B-1-EPO، 24 ساعت پیش از انجام واکنش، سلول‌ها با چگالی اولیه‌ی Cell/ mL 106 × 5/0 در پلیت 6 خانه حاوی mL 3 محیط کشت CD DG44 کامل، پاساژ داده شدند. سپس در روز ترانسفکشن، پس از تایید تعداد 106 × 1 سلول در هر میلی‌لیتر محیط کشت و همچنین درصد زنده‌مانی بالای 95، وکتور PB513B-1-EPO به همراه پلاسمید کدکننده‌ی ترانسپوزاز به صورت همزمان (Co-transfection) و نسبت 5/2 به 1، با استفاده از واکنش‌گر FreeStyleTM Max به جمعیت CHO DG44 منتقل شدند.
با توجه به حضور توالی ژن DHFR در هر دو ناقل بیانی و توانایی رشد سلول‌های دریافت‌کننده‌ی وکتور در محیط فاقد GHT (Glycine, Hypoxanthine and Thymidine) پس از گذشت 48 ساعت از ترانسفکشن، هر دو لاین سلولی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO شمارش شده و به منظور غربالگری، پس از سانتریفیوژ، با چگالی اولیه‌ی Cell/ mL 106 × 5/0 در محیط انتخابی CD OptiCHOTM حاوی غلظت mM 8 از L-Glutamine (Gibco) پاساژ داده شدند.
بررسی درج سازه‌های ژنی در ژنوم سلول CHO DG44 با استفاده از PCR: پس از غربالگری سلول‌های دریافت‌کننده‌ی وکتور بیانی و دستیابی به درصد زنده‌مانی بالای 90، جهت بررسی درج سازه درون ژنوم میزبان، تعداد 106 × 1 سلول از هر لاین جداسازی و استخراج DNA از آن‌ها با استفاده از کیت تجاری High Pure PCR Template Preparation (Roche) صورت گرفت. سپس واکنش PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن اریتروپوئتین (جدول شماره‌ی 1)، طبق شرایط جدول شماره‌ی 2، روی نمونه‌های DNA استخراج شده انجام شد.
جدول 2. شرایط دمایی واکنش PCR انجام شده برای بررسی درج سازه‌ها درون ژنوم سلول CHO DG44.
مرحله | دما | تعداد تکرار | |
1 | واسرشت اولیه DNA | C° 94 | 1 |
2 | واسرشت DNA | C° 94 | 30 |
3 | اتصال آغازگر | C° 58 | |
4 | تکثیر | C° 72 | |
5 | تکثیر نهایی | C° 72 | 1 |
بررسی کمی میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین با استفاده از تست Real Time PCR
پس از دستیابی به درصد زنده‌مانی بالای 90 در هر دو لاین pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO، سلول‌ها با چگالی اولیه‌ی Cell/ mL 106 × 3/0 در mL 10 محیط کشت کامل CD OptiCHOTM (Gibco) معلق شده و به مدت 6 روز در انکوباتور با دمای C° 37، 8 درصد CO2 و میزان رطوبت 85% و دور چرخش rpm 135، کشت داده شدند. سپس میزان 106 × 3 سلول از هر رده سلولی جداسازی و RNA آن با استفاده از کیت NucleoSpin RNA (MACHEREY-NAGEL) استخراج و پس از بررسی کمیت و کیفیت RNA استخراج شده با دستگاه اسپکتروفتومتر (NanoDrop® ND-1000, ThermoScientific)، به منظور حذف کامل DNA، نمونه‌ها با آنزیم DNaseI (ThermoScientific) تیمار و در نهایت سنتز cDNA (Complementary DNA) با غلظت 1 میکروگرم، از طریق کیت تجاری RevertAid H Minus First Strand cDNA (ThermoScientific) انجام شد. در نهایت به منظور بررسی و مقایسه‌ی میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در دو رده‌ی سلولی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO، واکنش Real-Time PCR با غلظت 25 نانوگرم از نمونه‌ی cDNA هر لاین سلولی، آغازگرهای اختصاصی ژن هدف و خانه‌دار GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) (جدول شماره‌ی 1) و همچنین مسترمیکس RealQ Plus 2X Master Mix Green (AMPLIQON) مطابق شرایط دمایی ذکر شده در جدول شماره‌ی 3 با دستگاه StepOnePlusTM انجام و سپس تغییرات بیان ژن مورد نظر از طریق روش - ΔΔCt2 کمّی شد. در این مطالعه آنالیز آماری با استفاده از IBM SPSS Statistics 26.0 و روش T-Test انجام و P value کمتر از 05/0 نشان دهنده‌ی معنادار بودن تغییرات است.
جدول 3. شرایط دمایی واکنش qRT-PCR جهت بررسی میزان بیان رونوشت EPO در دو رده‌ی سلولی.
نام ماده | دما | تعداد تکرار | |
1 | واسرشت اولیه DNA | C° 95 | 1 |
2 | واسرشت DNA | C° 95 | 40 |
3 | اتصال آغازگرها و تکثیر | C° 60 | |
4 | رسم نمودار دمای ذوب | C° 95 | 1 |
C° 60 | |||
افزایش مرحله‌ای دما هر بار به میزان C° 3/0 تا دستیابی به دمای C° 95 |
بررسی سنتز پروتئین اریتروپوئتین با استفاده از تست وسترن بلاتینگ
جهت بررسی تولید پروتئین اریتروپوئتین نوترکیب در دو رده‌ی سلولی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO، ابتدا هر دو لاین سلولی در mL 10 محیط CD OptiCHOTM (Gibco) با چگالی اولیه‌ی 106 × 3/0، شرایط دمایی C° 37، 8 درصد CO2، میزان رطوبت %85 و دور چرخش rpm 135، کشت داده شدند. با توجه به اینکه توالی اریتروپوئتین همسانه‌سازی شده در هر دو وکتور، دارای قطعه‌ی SRP بوده و پروتئین سنتزشده ترشحی است، پس از گذشت 6 روز از پاساژ اولیه، میزان mL 2 از محیط کشت جداسازی، به مدت 10 دقیقه با دور rpm 4000، سانتریفیوژ و به منظور انجام تست وسترن بلاتینگ، محیط رویی به میکروتیوب جدید منتقل شد. سپس غلظت پروتئین در هر نمونه با استفاده از دستگاه نانودراپ در جذب نور 280 نانومتر، خوانش شد. در این تست از محیط رویی سلول‌های CHO DG44 ترانسفکت شده با وکتور pOptiVECTM همسانه‌سازی نشده و داروی اریتروپوئتین (Cinnapoietin، شرکت سیناژن) به ترتیب به عنوان کنترل منفی و مثبت استفاده شد. ابتدا میزان 100 نانوگرم از هر نمونه پس از ترکیب با Sample Buffer 5X و دناتوره شدن در دمای C° 100، روی ژل 12% پلی‌اکریل آمید ( SDS-PAGE) بارگذاری و الکتروفورز به مدت ۲0 دقیقه با ولتاژ ۸0 و دو ساعت با ولتاژ 120 انجام شد. سپس پروتئین‌ها طی 14 ساعت با ولتاژ 17 به کاغذ PVDF (Amersham™ Hybond™) منتقل شدند. به منظور مسدودسازی، ابتدا کاغذ نیتروسلولزی به مدت 2 ساعت و نیم در محلول 5% از Skim milk و پس از آن یک ساعت و نیم در غلظت µg/mL 1 از آنتی‌بادی اولیه rabbit anti-human Erythropoietin شرکت Bio-Rad غوطه‌ور شد. پس از سه بار شستشو، در مرحله‌ی بعد کاغذ PVDF به مدت یک ساعت در مجاورت رقت 1 به 350.000 از آنتی‌بادی ثانویهanti-rabbit IgG peroxidase antibody produced in goat از شرکت Sigma-Aldrich قرار گرفت. در نهایت پس از چهار بار شستشو، سوبسترای آنزیم (HRP) به کاغذ نیتروسلولزی اضافه و با استفاده از دستگاه GelDoc مشاهده شد.
نتایج
تایید درج وکتور بیانی درون ژنوم سلول CHO DG44 با استفاده از واکنش PCR
آغازگرهای به کارگرفته شده در واکنش PCRی که بر روی DNA استخراج شده از لاین‌های سلولی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO انجام شد، اختصاصی ژن هدف بوده و در هر دو جمعیت، باند مورد انتظار 83 جفت بازی مشاهده و درج وکتورها درون ژنوم سلول CHO DG44 تایید شد. در شکل شماره‌ی 2 نتیجه‌ی حاصل از این واکنش نشان داده شده است.
شکل 2. نتایج واکنش PCR جهت تایید درج سازه درون ژنوم سلول CHO DG44. 1) نشانگر وزن مولکولی 1kb Plus. 2) محصول واکنش PCR بر روی ژنوم رده‌ی سلولی pOptiVEC-EPO. 3) محصول واکنش PCR بر روی ژنوم لاین سلولی PB513B-1-EPO. 4) کنترل مثبت. 5) کنترل منفی فاقد الگو.
تایید افزایش میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین با استفاده از تست qRT-PCR
بررسی کمّی و مقایسه‌ی میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت در دو رده‌ی سلولی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO، با استفاده تست Real-Time PCR انجام شد. در این آزمایش بیان ژن ارتیروپوئتین در جمعیت سلولی pOptiVEC-EPO به عنوان پایه قرار گرفته و میزان رونوشت این ژن در لاین PB513B-1-EPO نسبت به آن سنجیده شد. همچنین در این تست ژن GAPDH به عنوان استاندارد در نظر گرفته و میزان بیان هر نمونه نسبت به آن نرمال گردید. نتایج این آزمایش افزایش معنادار (0001/0 > P) و 188 برابری میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در رده‌ی سلولی PB513B-1-EPO نسبت به pOptiVEC-EPO را نشان داد (شکل شماره‌ی 3).
شکل 3. بررسی میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت در دو رده‌ی سلولی PB513B-1-EPO و pOptiVEC-EPO. در نمودار حاصل از تست Real-Time PCR، افزایش 188 برابری رونوشت ژن اریتروپوئتین در جمعیت ترانسپوزونی نسبت به رده‌ی کنترل، نشان داده شده است ( 0001/0 > P ****).
تایید سنتز پروتئین اریتروپوئتین با استفاده از تست وسترن بلاتینگ
همانطور که در شکل شماره‌ی 4 نشان داده شده است، در تست اختصاصی وسترن بلاتینگ انجام شده روی نمونه‌ی سوپرناتانت سلولی دو رده‌ی pOptiVEC-EPO و PB513B-1-EPO، باند مورد انتظار 30 کلیودالتونی اریتروپوئتین نوترکیب مشاهده و در نهایت سنتز و ترشح صحیح این پروتئین در دو جمعیت سلولی تایید شد.
شکل 4. نتایج حاصل از تست وسترن بلاتینگ انجام شده روی سوپرناتانت سلولی دو رده‌ی PB513B-1-EPO و pOptiVEC-EPO. 1) نشانگر وزن مولکولی پروتئین. 2) کنترل مثبت Cinnapoietin. 3) محیط رویی جمعیت سلولی pOptiVEC-EPO. 4) سوپرناتانت رده‌ی سلولی PB513B-1-EPO. 5) کنترل منفی ( محیط رویی سلول CHO DG44 ترانسفکت شده با وکتور همسانه‌سازی نشده‌ی pOptiVECTM).
بحث
در تولید پروتئین‌های نوترکیب دارویی، از ساختار ژن تا ایجاد پروتئینی با تاخوردگی صحیح، مراحلی مانند رونویسی، ترجمه، تغییرات پس از ترجمه و ترشح دخیل بوده و ساخت آن‌ها در سیستم بیانی پستاندارن با کیفیت و بازدهی بالا، نیازمند به کارگیری استراتژی‌هایی مانند تغییرات و اصلاحات ژنی، بهینه‌سازی ناقل بیانی، بهبود شرایط کشت سلولی و فرآیندهای پس از ترجمه است (2). با توجه به پیچیده و پرهزینه بودن تولید زیست‌داروها، توسعه‌ی روش‌هایی جهت دستیابی به سلول‌های دارای بیان بالا از پروتئین هدف در کمترین زمان و با پایین‌ترین هزینه، از ارزش بالایی برخوردار است.
به طور کلی بهینه‌سازی توالی ژن هدف براساس ارجحیت کدونی سلول میزبان می‌تواند سبب پایداری بیشتر رونوشت شده و همچنین افزایش چندین برابری (تا 7 برابر) سنتز پروتئین موردنظر را در بر داشته باشد (22, 23). از طرفی به کارگیری توالی سیگنال پپتید که پروتئین را در مسیر ترشح قرار می‌دهد، از مشکلاتی مانند ایجاد اختلال در تاخوردگی، انباشت پروتئین در سلول و تخریب آن‌ها توسط پروتئاز جلوگیری کرده و سبب افزایش بازدهی سنتز و همچنین سهولت فرآیند خالص‌سازی می‌گردد (24). در این طرح توالی سیگنال پپتید در انتهای ׳5 ژن هدف قرار گرفته و سپس قطعه‌ی SRP-EPO براساس ارجیحت کدونی سلول CHO بهینه‌سازی شد.
علاوه بر موارد ذکر شده، وکتورها نقش مهمی در سطح بیان و پایداری پروتئین‌های هدف ایفا می‌کنند (19). با توجه به اینکه سطح بیان پروتئین نوترکیب به موقعیت درج ناقل نیز بستگی داشته و همچنین بیشتر مکان‌های ژنومی از لحاظ رونویسی غیرفعال هستند، به کارگیری عناصر مناسب در وکتور بیانی می‌تواند منجر به غلبه بر اثرات خاموشی ژن و سبب پایداری و افزایش بیان ترانس‌ژن گردد (25). طی مطالعات انجام شده در این زمینه، مشخص شد که به کارگیری وکتورهای ترانسپوزونی می‌تواند توالی هدف را با بازدهی بالا در موقعیت‌های فعال رونویسی ژنوم درج نموده و سبب بهبود بیان ژن موردنظر شود (26-29). همچنین در سال 2016 میلادی افزایش 4 تا 12 برابری بیان پروتئین هدف در رده‌ی ترانسپوزونی PB نسبت به کنترل در مطالعه‌ای مشاهده شد.
هدف اصلی این پژوهش، بررسی تاثیر وکتور ترانسپوزونی بر میزان بیان ترانس‌ژن بود. ناقل PB513B-1 به عنوان وکتور ترانسپوزونی و پلاسمید pOptiVECTM به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. نتایج حاصل از تست Real-Time PCR انجام شده، افزایش حدود 188 برابری سطح رونوشت در لاین سلولی PB513B-1-EPO نسبت به رده‌ی pOptiVEC-EPO را نشان داد. این امر تاکیدی بر تاثیر عنصر ترانسپوزونی در بهبود و افزایش میزان رونوشت ژن هدف داشته و نشان می‌دهد که این وکتور نسبت به ناقل کنترل، سبب افزایش درج توالی مورد نظر در مناطق فعال رونویسی شده است. علاوه بر این با توجه به اینکه در تست وسترن بلاتینگ، میزان نمونه‌ی بارگذاری شده از هر دو رده، هم غلظت بوده و این آزمایش پاسخی نیمه‌کمّی در اختیار ما قرار می‌هد، می‌توان ادعا کرد که سنتز پروتئین اریتروپوئتین در جمعیت سلولی PB513B-1-EPO نسبت pOptiVEC-EPO با نرخ بالاتری انجام شده که البته برای بررسی کمّی و دقیق‌تر نیاز به انجام تست‌هایی مانند الایزا است.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این پژوهش همسو با مطالعات انجام شده در گذشته بوده و قدرت و بازدهی بالای عناصر ترانسپوزونی بر افزایش میزان بیان ژن هدف را نشان می‌دهد. در انتها بایستی تاکید کرد که در حال حاضر بهینه‌سازی و بهبود بیان پروتئین نوترکیب در سطوح مختلف مولکولی و سلولی در حال توسعه بوده و همچنان نیاز به انجام پژوهش‌های بیشتری در این حوزه دارد.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه با کد IR.ACECR.ROYAN.REC.1400.011 در کمیته‌ی اخلاق پژوهشگاه رویان و جهاد دانشگاهی تصویب شده است.
حامی مالی
این پژوهش با حمایت مالی پژوهشگاه رویان و جهاد دانشگاهی با شماره گرنت 99000004 انجام و کلیه‌ی هزینه‌های آن از این طریق تامین اعتبار شده است.
منابع
1. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature biotechnology. 2018;36(12):1136-45.
Utilizing the Transposon Vector to Enhance the Expression of Recombinant Erythropoietin in Chinese Hamster Ovary Cells
Reyhane Lohrasbi1, Seyede Hoda Jazayeri 2, Abbas Daneshipour1, Zahra Halfinezhad1, Robabe Mohammadi1, Parisa Javidzade1, Amir Amiri-Yekta1*
1 Department of Genetics, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran
2 Faculty of Advanced Sciences and Technology, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran
*Corresponding Email: amir.amiriyekta@royaninstitute.org
Abstract:
Materials and Methods: In this study, the optimized rEPO sequence based on CHO codon usage was cloned into the pOptiVECTM plasmid. This vector was used as a template to construct the PB513B-1-EPO plasmid, which entailed an EPO-IRES-DHFR fragment. The cloning process was verified through colony PCR, digestion, and followed by Sanger sequencing. Subsequently, expression cassettes were stably transfected to the CHO DG44 cells. As the presence of DHFR sequence in vectors, the cells were resuspended in selection media for screening purposes. Then, PCR was performed to assess the integration of recombinant cassettes in the CHO cell's genome. Ultimately, the expression level of Erythropoietin in PB513B-1-EPO and pOptiVEC-EPO pools was evaluated using qRT-PCR and western blotting techniques.
Results: The Real-Time PCR data indicate a 188-fold increase in Erythropoietin transcript level in the PB513B-1-EPO cell line compared to pOptiVEC-EPO. Additionally, the western blotting test's result provides explicit confirmation of this protein's synthesis and secretion.
Conclusion: Analysis of findings in this research revealed that the transposon element significantly improves the expression of the target gene at the transcriptional level and demonstrated the potential of this strategy to obtain the high-expression cell line of the desired protein in mammalian cells.
Keywords: Transposon element, High-expression cell line, PiggyBac, Erythropoietin,
Therapeutic recombinant protein, CHO DG44