تاثیر عناصر ترانسپوزونی بر بهبود بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین در سلول‌های تخمدان همستر چینی
محورهای موضوعی : فصلنامه زیست شناسی جانوریریحانه لهراسبی 1 , سیده هدی جزایری 2 , عباس دانشی پور 3 , زهرا هلفی نژاد 4 , ربابه محمدی 5 , پریسا جاویدزاده 6 , امیر امیری یکتا 7
1 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
2 - دانشکده علوم نوین، دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
4 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
5 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
6 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
7 - پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولیدمثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولیدمثل، گروه ژنتیک، تهران، ایران
کلید واژه: عنصر ترانسپوزونی, رده‌ی سلولی دارای بیان بالا, PiggyBac, اریتروپوئتین, پروتئین نوترکیب دارویی, CHO DG44.,
چکیده مقاله :
در صنعت زیست‌داروها و تولید پروتئین‌های نوترکیب به دلیل بازده پایین درج ژن هدف در ژنوم سلول میزبان و همچنین ادغام در مناطق هتروکروماتین که منجر به سرکوب رونویسی و ناپایداری بیان توالی مورد نظر می‌گردد، دستیابی به سلول‌های دارای بیان بالا با چالش رو برو است. به منظور غلبه بر این محدودیت‌ها، می‌توان از ترانسپوزون‌ها که عناصر ژنتیکی متحرک بوده و با مکانیسم Cut and Paste توانایی برش و درج قطعات هدف در نواحی خاصی از ژنوم را دارا می‌باشند، استفاده کرد. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر عنصر ترانسپوزونی PiggyBac بر میزان بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین و دست پیدا کردن به رده‌ی سلولی دارای بیان بالا دست میباشد. ابتدا توالی ژن اریتروپوئتین نوترکیب (rEPO) بهینه‌شده بر اساس ارجحیت کدونی سلول CHO در وکتور pOptiVECTM همسانه‌سازی شد. جهت ایجاد دومین وکتور بیانی، قطعه‌ی EPO-IRES-DHFR در پلاسمید PB513B-1 درج و سپس مراحل همسانه‌سازی در هر دو ناقل با استفاده از واکنش Colony PCR، هضم آنزیمی و توالی‌یابی سنگر تایید شد. جهت ایجاد لاین سلولی پایدار، هر دو وکتور به طور مجزا به سلول CHO DG44 ترانسفکت و سپس غربالگری آن‌ها انجام شد. پس از تایید درج وکتورها درون ژنوم سلول هدف، میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت و پروتئین به ترتیب با استفاده از تست‌های qRT-PCR و وسترن بلاتینگ در دو رده‌ی سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از آزمایش Real-Time PCR، افزایش 188 برابری میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در لاین سلولی PB513B-1-EPO نسبت به pOptiVEC-EPO را نشان داد. همچنین یافته‌های آزمایش وسترن بلاتینگ، سنتز و ترشح صحیح این پروتئین را تایید کرد. بررسی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که عنصر ترانسپوزونی به صورت چشمگیری سبب افزایش بیان ژن موردنظر در سطح رونوشت شده و توانایی ایجاد رده‌ی سلولی با بیان بالا از پروتئین هدف را دارا است.
In pharmaceutical biotechnology and recombinant protein production, due to the low efficacy of inserting the target gene into the host gene genome and its integration into the heterochromatin regions, which leads to the suppression of transcription as well as the instability of the expression of the desired sequence, achieving cells with highexpression is a challenge. To overcome the limitations transposons, which are mobile genetic elements and have the ability to cut and insert target fragments in certain regions of the genome with the “Cut and Paste” mechanism, are effective. This research aims to evaluate the effect of the PiggyBac transposon vector on the expression level of recombinant Erythropoietin (rEPO) protein and to find a cell line with high expression. First the optimized rEPO sequence based on CHO codon performance was cloned into the pOptiVECTM plasmid. To create the second expression vector, the EPO-IRES-DHFR fragment was inserted into the PB513B-1 plasmid, and then the homogenization steps in both vectors were confirmed using Colony PCR reaction, enzyme digestion, and Sanger sequencing. In order to create a stable cell line, both vectors were separately transfected into CHO DG44 cells and then screened. After confirming the insertion of the vectors into the genome of the target cell, the level of erythropoietin gene expression at the transcript and protein level was checked using qRT-PCR and western blotting tests, respectively, in two cell lines. The Real-Time PCR data indicate a 188-fold increase in erythropoietin gene transcript in the PB513B-1-EPO cell line compared to pOptiVEC-EPO. Additionally, the western blotting test's result confirmed the correct synthesis and secretion of this protein. Analysis of findings in this research revealed that the transposon element significantly increased the expression of the desired gene at the transcriptional level and had could create a cell line with high expression of the target protein.
1. Barnes L.M., Bentley C.M., Dickson A.J. 2004. Molecular definition of predictive indicators of stable protein expression in recombinant NS0 myeloma cells. Biotechnology and Bioengineering, 85(2):115-121.
2. Barnes L.M., Bentley C.M., Dickson A.J. 2003. Stability of protein production from recombinant mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering, 81(6):631-639.
3. Burnight ER, Staber JM, Korsakov P, Li X, Brett BT, Scheetz TE, 2012. A hyperactive transposase promotes persistent gene transfer of a piggyBac DNA transposon. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2012(1):50-62.
4. Chusainow J, Yang YS, Yeo JH, Toh PC, Asvadi P, Wong NS, 2009. A study of monoclonal antibody‐producing CHO cell lines: What makes a stable high producer? Biotechnology and Bioengineering, 102(4):1182-1196.
5. Dahodwala H., Lee K.H. 2019. The fickle CHO: a review of the causes, implications, and potential alleviation of the CHO cell line instability problem. Current Opinion in Biotechnology, 60:128-137.
6. Dehnavi E., Siadat S.O.R., Roudsari M.F., Khajeh K. 2016. Cloning and high-level expression of β-xylosidase from Selenomonas ruminantium in Pichia pastoris by optimizing of pH, methanol concentration and temperature conditions. Protein Expression and Purification, 124:55-61.
7. Domínguez Á., Fermiñán E., Sánchez M., González F.M., Pérez-Campo F.M., García S., 1998. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. International Microbiology, 1(2):131-142.
8. Galvan D.L., Nakazawa Y., Kaja A., Kettlun C., Cooper L.J., Rooney C.M. 2009. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. Journal of Immunotherapy, 32(8):837.
9. Ghavim M., Abnous K., Arasteh F., Taghavi S., Nabavinia M.S., Alibolandi M., 2017. High level expression of recombinant human growth hormone in Escherichia coli: crucial role of translation initiation region. Research in Pharmaceutical Sciences, 12(2):168.
10. Grabherr R., Nilsson E., Striedner G., Bayer K. 2002. Stabilizing plasmid copy number to improve recombinant protein production. Biotechnology and Bioengineering, 77(2):142-147.
11. Grabundzija I., Irgang M., Mátés L., Belay E., Matrai J., Gogol-Döring A. 2010. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy, 18(6):1200-1209.
12. Huang X., Guo H., Tammana S, Jung Y.C., Mellgren E., Bassi P. 2010. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Molecular Therapy, 18(10):1803-1813.
13. Kim C.H., Oh Y., Lee T.H. 1997. Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells. Gene, 199(1-2):293-301.
14. Lalonde M.E., Durocher Y. 2017. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology, 251:128-140.
15. Li Z.M., Fan Z.L., Wang X.Y., Wang T.Y. 2022. Factors affecting the expression of recombinant protein and improvement strategies in chinese Hamster ovary cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 10:880155.
16. Makino T., Skretas G., Georgiou G. 2011. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories, 10(1):1-10.
17. Meir Y.J., Weirauch M.T., Yang H.S, Chung P.C., Yu R.K., Wu S.C. 2011. Genome-wide target profiling of piggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnology, 11:1-19.
18. Muñoz-López M., García-Pérez J.L. 2010. DNA transposons: nature and applications in genomics. Current Genomics, 11(2):115-128.
19. Okumura T., Masuda K., Watanabe K., Miyadai K., Nonaka K., Yabuta M. 2015. Efficient enrichment of high-producing recombinant Chinese hamster ovary cells for monoclonal antibody by flow cytometry. Journal of Bioscience and Bioengineering, 120(3):340-346.
20. Peng C., Shi C., Cao X., Li Y., Liu F., Lu F. 2019. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7(139):1-9.
21. Ritacco F.V., Wu Y., Khetan A. 2018. Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies. Biotechnology Progress, 34(6):1407-1426.
22. Sandoval-Villegas N., Nurieva W., Amberger M., Ivics Z. 2021. Contemporary transposon tools: a review and guide through mechanisms and applications of sleeping beauty, piggyBac and Tol2 for genome engineering. International Journal of Molecular Sciences, 22(10):5084-5113.
23. Stach C.S., McCann M.G., O’Brien C.M., Le T.S., Somia N., Chen X., 2019. Model-driven engineering of N-linked glycosylation in Chinese hamster ovary cells. ACS Synthetic Biology, 8(11):2524-2535.
24. Walsh G. 2018. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology, 36(12):1136-1145.
25. Wang T.Y., Guo X. 2020. Expression vector cassette engineering for recombinant therapeutic production in mammalian cell systems. Applied Microbiology and Biotechnology, 104(13):5673-5688.
26. Wei M., Mi C.L., Jing C.Q., Wang T.Y. 2022. Progress of transposon vector system for production of recombinant therapeutic proteins in mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 10:879222.
27. Wilson M.H., Coates C.J., George A.L. 2007. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Molecular Therapy, 15(1):139-145.
28. Wurm F.M. 2004. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology, 22(11):1393-1398.
29. Yang Y., Chusainow J., Yap M.G. 2010. DNA methylation contributes to loss in productivity of monoclonal antibody-producing CHO cell lines. Journal of Biotechnology, 147(3-4):180-185.