تعیین تنوع ژنتیکی باکتریها در شکمبه بز با استفاده از توالی یابی 16S rRNA
محورهای موضوعی : باکتری شناسیسید مهدی اصحابی 1 , محمد چمنی 2 , کاوه جعفری خورشیدی 3 , مهدی امین افشار 4
1 - دانش آموخته دکتری تخصصی گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران
2 - گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران
3 - گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قائمشهر
4 - گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران
کلید واژه:
چکیده مقاله :
تنوع ژنتیکی جمعیت باکتریایی در شکمبه بز با استفاده از یک روش مولکولی و مستقل از کشت مورد بررسی قرار گرفت. به دلیل شرایط منحصر بهفرد تغذیهای و زندگی، این انتظار وجود دارد که بزها دارای جمعیت باکتریایی متفاوتی نسبت به سایر نشخوارکنندگان باشند. در نتیجه درک صحیح این جمعیت میکروبی در نژادهای مختلف بز و بررسی تغییرات آنها در پاسخ به رژیمهای مختلف تغذیهای و بررسی تنوع آنها در زیستگاههای مختلف بسیار ضروری است. از این رو فرآیند PCR و تعیین توالی کتابخانه کلون ژن 16S rRNA با استفاده از یک نمونه مخلوط حاصل از کل محتویات شکمبه مربوط به 12 بز بومی شمال ایران با استفاده از پرایمرهای عمومی برای باکتریها انجام پذیرفت. بزها از گلههای پرواری تغذیه شده با خوراک مخلوط کنسانتره و علوفه انتخاب شدند. مجموعا 15 توالی 16S rRNA مورد آنالیز قرار گرفت. از این 15 توالی 4 توالی دارای شباهت با Streptococcus bovis بودند و 3 توالی با Selenomonas ruminantium همخوانی داشتند. همچنین 2 توالی شبیه به Megasphera elsdenii بودند و 2 توالی دیگر با Prevotella ruminicola شباهت داشتند. 2 کلون نیز با باکتریهای کشت نیافته شکمبه گاو شباهت داشتند. از این 15 توالی یک توالی به Lactobacillus plantarum شبیه بود و یک توالی باقیمانده نیز دارای شباهت با Prevotella multiformis بود.این تحقیق برای اولین بار تنوع مولکولی جمعیت باکتریها را در شکمبه بزها در ایران مورد مطالعه قرار داد. بررسی نتایج این تحقیق نشان داد که این حیوانات دارای جمعیت باکتریایی مشابه با سایر نشخوارکنندگان در سایر نقاط دنیا میباشند. هر چند که ما توالیهایی را نیز جداسازی نمودیم که با میکروارگانیسمهای شناخته شده در دستگاه گوارش در یک خوشه قرار نمیگرفتند که این مساله میتواند به علت اختلافات فردی در حیوانات میزبان در حین نمونه گیری، نوع جیره، روشهای استخراج DNA یا پرایمرهای مورد استفاده برای PCR بوده باشد.
1- توکلیان، ج. (1378). نگرشی بر ذخایر ژنتیکی دام و طیور بومی ایران. با همکاری مراکز تحقیقات منابع طبیعی و امور دام استان‌ها و معاونت امور دام استان‌ها. کرج: موسسه تحقیقات علوم دامی کشور.
2. Al Jassim, R.A.M., Gordon, G.L.R., Rowe. J.B., (2003). The effect of basal diet on lactate-producing bacteria and the susceptibility of sheep to lactic acidosis. Animal Science 77: 459–469.
3. An, D., Dong, X., Dong, Z. (2005). Prokaryote diversity in the rumen of yak (Bos grunniens) and Jinnan cattle (Bos taurus) estimated by 16S rDNA homology analyses. Anaerobe 11: 207–221.
4. Bekele, A.Z., Koike, S., Kobayashi, Y. (2010). Genetic diversity and diet specificity of ruminal Prevotella revealed by 16S rRNA gene-based analysis. FEMS Microbiology Letters 305: 49–57.
5. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostelland, J., Wheeler. D. (2007). GenBank. Nucleic Acids Research. 35: D1–D25.
6. Dehority, B.A., Tirabasso, P.A., Grifo, A.P. (1989). Most-probable-number procedures for enumerating ruminal bacteria, including the simultaneous estimation of total and cellulolytic numbers in one medium. Applied and Environmental Microbiology 55: 2789–2792.
7. Deng, D., Wanapat, M., Ma, S., Chen, J., Xi, D., He, T., Yang, Z., Mao. H. (2007). Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences manifest rumen bacterial diversity in gayals (Bos Frontalis) fed fresh bamboo leaves and twigs (Sinarum dinaria). Asian-Australasian Journal of Animal Science 20(7): 1057– 1066.
8. Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783–791.
9. Ghali, M.B., Scott, P.T., Al Jassim, R.A.M. (2004). Characterization of Streptococcus bovis from the rumen of the dromedary camel and Rusa deer. Letters in Applied Microbiology 39: 341–346.
10. Giesecke, D., Wiesmayr, S., Ledinek, M. (1970). Peptostreptococcus elsdenii from the caecum of pigs. Journal of Genetic Microbiology 64: 123–126.
11. Guo, T.J., Wang, J.Q., Bu, D.P., Liu, K.L., Wang, J.P., Li, D., Luan, S.Y., Huo, X.K., (2010). Evaluation of the microbial population in ruminal fluid using real time PCR in steers treated with virginiamycin. Czech Journal of Animal Science 55(7): 276–285.
12. Han, X., Yang, Y., Yan, H., Wang, X., Qu, L., Chen, Y. (2015). Rumen Bacterial Diversity of 80 to 110-Day-Old Goats Using 16S rRNA Sequencing. PLOS ONE. 10(2): e0117811.
13. Hespell, R.B., Akin, D.E., Dehority, B.A. (1997). In: Mackie RI, White BA, Isaacson R (eds) Gastrointestinal microbiology, vol 2. New York: Chapman and Hall. pp. 59–186.
14. Hungate, R.E. (1966). The Rumen and Its Microbes. Academic Press, New York.
15. Hungate, R.E. (1969). A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In: Methods in microbiology, Norris JR, Ribbons DW (Ed.) Vol. 3B. London and New York: Academic Press: pp. 117–132.
16. Jami, E., Mizrahi, I. (2012). Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals. PlOS one. 7: e33306.
17. Krause, D.O., Russell, J.B. (1996). How many ruminal bacteria are there? Journal of Dairy Science 79: 1467–1475.
18. Li, Z.P., Liu, H.L., Li, G.Y., Bao, K., Wang, K.Y., Xu, C., Yang, Y.F., Yang, F.H., Wrightو A.D.G. )2013(. Molecular diversity of rumen bacterial communities from tannin-rich and fiber-rich forage fed domestic Sika deer (Cervus nippon) in China. BioMedCentral Microbiology 13: 151-158.
19. Mackie, R. I. (2002). Mutualistic fermentative digestion in the gastrointestinal tract: diversity and evolution .Integr Comp Biol 42: 319–326.
20. Madden T.L, Tatusov, R.L., Zhan., J. (1996). Application of network BLAST server. Methods in Enzymology 266: 131-141.
21. Maidak, B.L, Cole, J. R., Lilburn, T.G., Jr, C., Saxman P.R., Farris. R.J. (2001). The RDP-II (Ribosomal Database Project). Nucl Acids Res 29: 173–174.
22. Marounek M., Fliegerova, K., Bartos, S. (1989). Metabolism and some characteristics of ruminal strains of Megasphaera elsdenii. Applied and Environmental Microbiology 55: 1570–1573.
23. Ministry of Agricultural Jahad. (2001). Jahad of Agriculture in the mirror of statistics. Ministry of Agricultural Jahad press, Tehran Iran.www. maj.ir.
24. Pandya, P.R., Singh, K.M., Parnerkar, S., Tripathi, A.K., Mehta, H.H., Rank, D.N., Kothari, R.K., Joshi, C.G. (2010). Bacterial diversity in the rumen of Indian Surti buffalo (Bubalus bubalis), assessed by 16S rDNA analysis. Journal of Applied Genetics 51(3): 395–402.
25. Patel, J.K.M., Jhala, M.K., Soni, P., Shabir, N., Pandya, P.R., Singh, K. M., Rank, D.N., Joshi, C.G. (2011). Molecular characterization and diversity of rumen bacterial flora in Indian goat by 16S rDNA sequencing. Vet scan journal 6(1): 77-87.
26. Paster, B.J., Dewhirst, F.E. Weisburg, W.G., Fraser, G. J., Tordoff, L.A., Hespell, R.B., Stanton, T.B., Zablen, L., Woese. C.R. (1991). Phylogenetic analysis of the spirochetes. Journal of Bacteriology 173: 6101–6109.
27. Petri, R.M., Forster, R.J., Yang, W., McKinnon, J.J., McAllister, T.A., (2012). Characterization of rumen bacterial diversity and fermentation parameters in concentrate fed cattle with and without forage. Journal of Applied Microbiology 112: 1152–1162.
28. Rawls, J.F., Samuel, B.S., Gordon, J.I. (2004). Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci USA 101: 4596–4601.
29. Russell, J.B. (1991). Resistance of Streptococcus bovis to acetic acid at low pH: relationship between intracellular pH and anion accumulation. Applied and Environmental Microbiology 51: 255–259.
30. Saitou, N., Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406–425.
31. Shin, E.C, Cho, K.M., Lim, W.J., Hong, S.Y., An, C.L., Kim, E.J., Kim, Y.K., Choi, B.R., An, J.M., Kang, J.M., Kim, H., Yun, H.D. (2004). Phylogenetic analysis of protozoa in the rumen contents of cow based on the 18S rDNA sequences. Journal of Applied Microbiology 97: 378-383.
32. Stevenson, D.M., Weimer, P.J. (2007). Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR. Applied Microbiology Biotechnology 75:165–174.
33. Stewart C.S., Bryant, M.P. 1998. The rumen bacteria, pp. 21–76 in P. N. Hobson (Ed.): The Rumen Microbial Ecosystem. Elsevier Applied Science, London–New York.
34. Stewart, C.S., Flint, H.J., Bryant, M.P. (1997). The rumen bacteria. In: The Rumen Microbial Ecosystem. 2nd ED. (Ed. P. N. Hobson and C. S. Stewart). Chapman and Hall, New York, pp. 10-72.
35. Sun, Y.Z., Mao, S.Y., Yao, W., Zhu, W.Y. (2008). DGGE and 16S rDNA analysis reveals a highly diverse and rapidly colonising bacterial community on different substrates in the rumen of goats. Animal 2(3): 391–398.
36. Sundset, M.A., Præsteng, K.E., Cann, I.K.O., Mathiesen, S.D., Mackie. R.I., 2007. Novel Rumen Bacterial Diversity in Two Geographically Separated Sub-Species of Reindeer. Microbial Ecology 54: 424–438.
37. Sylvester, J.T., Karnati, S.K.R., Yu, Z., Morrison, M., Firkins, J.L. (2004). Development of an assay to quantify rumen ciliate protozoal biomass in cows using real-time PCR. Journal of Nutrition 134: 3378–3384.
38. Thompson, J.D., Higgins D.G., Gibson. T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673–4680.
39. Yang, L.Y., Chen, J., Cheng, X.L., Xi, D.M., Yang, S.L., Deng, W.D., Mao, H.M. (2010). Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences reveals rumen bacterial diversity in Yaks (Bos grunniens). Molecular Biology Reports 37: 553–562.