مقایسه برخی از فاکتورهای حدت اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک 99K با دو روش PCR و SDS-PAGE

محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولی

یاسمین کیانی ¹ , یحیی تهمتن ² , محمد حسین حسینی ³ , معصومه حیاتی ⁴

1 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه میکروبیولوژی
2 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شیراز، گروه باکتری شناسی
3 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شیراز، گروه باکتری شناسی
4 - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شیراز، گروه باکتری شناسی

تاریخ دریافت : 1389/08/25 تاریخ پذیرش : 1389/10/25 تاریخ انتشار : 1389/10/11

کلید واژه: SDS-PAGE, PCR, گوساله, اشریشیاکلی 99K,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: اسهال ناشی از اشریشیاکلی 99K در گوساله‌ها به ویژه در نخستین روزهای پس از تولد، به علت تلفات و خسارات اقتصادی حاصله از اهمیت زیادی برخوردار است. در این مطالعه شیوع ژن‌های عوامل بیماریزایی اشریشیاکلی 99 K با استفاده از تکنیک Multiplex PCR و سپس الگوی پروتئینی این باکتری ها با روش های مختلف بید، اوره و پودر شیشه با SDS- PAGE ارزیابی گردید. موادوروش ها: 300 سواب رکتوم از گوساله‌های 1 تا 30 روزه مبتلا به اسهال طی سال های 1390-1389 جمع‌آوری شد. یک بخش جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی ژن‌های عوامل بیماریزایی 99K، 41F و STa استفاده گردید و بخش دیگر جهت کشت بر روی محیط‌های مختلف جهت جداسازی اشریشیا کلی و SDS-PAGE مورد استفاده قرار گرفت. یافته ها: نتایج PCR نشان داد از 200 اشریشیاکلی جداشده، 16مورد دارای ژن‌های عوامل بیماریزایی 99K، 41 Fو STa می‌باشند و در هیچکدام از نمونه های جدا شده از گوساله ها سم حساس به حرارت LT))وجود نداشت. همچنین نتایج حاصل از SDS-PAGE نشان داد که الگوهای پروتئینی باکتری های مختلف اشریشیا کلی متفاوت می باشد. نتایج SDS-PAGE حاصل از ستون بیانگر وجود تنها یک باند مربوط به آنتی ژن 99K بود. نتیجه گیری: مشاهده فاکتورهای حدت باکتری های اشریشیا کلی 99K جدا شده نشان داد که همه باکتری ها حداقل دارای سه ژن 99K، 41F و Staمی باشند. با وجود این که از نظر مولکولی تفاوت معنی داری در بین نمونه ها مشاهده نشد. اما از نظر الگوی پروتئینی تفاوت های قابل ملاحظه ای در بین باکتری های جدا شده وجود داشت. بنابر این می‌توان نتیجه گرفت که باکتری های متفاوت الگوهای پروتئینی مختلف و در نتیجه بیماریزایی متفاوتی دارند.

چکیده انگلیسی:

Background and Objective: Since E. coli K99 is a causative agent of diarrhea and casualties in calf, it has adverse impacts on economy. This research studied the pathogenic factors of the E. coli by Multiplex PCR, and determined protein pattern of different E. coli isolates by SDS-PAGE (sodium dodsil sulfate polyacryl amid gel electroforesis). Materials and methods: 300 rectal swabs were collected from 1-30 days-old calf during a period between 2010 to 2011. One part of the samples was studied with Multiplex PCR method for determination of the K99, F41 as well as STa genes, and another part was cultured for E. coli isolation and SDS-PAGE assay. Results: The PCR results indicated that 16 of the 200 isolated E. coli had K99, F41, and STa pathogenic factors. LT was not found in the isolates. SDS-PAGE results showed different protein pattern in the isolated E. coli strains. The results of SDS-PAGE column showed only one band for K99 antigen. Conclusion: Based on the found virulent factors in the isolated E. coli K99, it has been shown that the isolates contain at least three pathogenic genes (K99, F41, and STa). Although no significant difference has been seen between the isolates in terms of gene investigations, there was a meaningful difference in the protein patterns of the isolates. As a conclusion, different bacteria showed different protein patterns and consequently had different pathogenic ability.

منابع و مأخذ:

1. Levine MM. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroadherant. J Infect Dis. 1987; 155(3): 377-389.

2. Schoonderwoerd M, Clarke RC, van Dreumel AA, Rawluk SA. Colitis in calves: natural and experimental infection with a verotoxin-producing strain of Escherichia coli O111:NM. Can J Vet Res. 1988; 52(4): 484-487.

3. Johnson MW, Fitzgerald GR, Welter MW, Welter CJ. The six most common pathogens responsible for diarrhea in newborn  pig. Vet Med. 1992; 87(4): 382-386.

4. Hacker J. Role of fimbrial adhesions in the pathgenesis of Escherichia coli infections. Can J Microbiol. 1992; 38(7): 720-727.

5. Klemm P. Fimbrial adhesions of Escherichia coli. Rev Infect Dis. 1985; 7(3): 321-340.

6. Nagy B, Fekete PZ.  Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. Int J Med Microbiol. 2005; 295(6-7): 443–454.

7. Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of shiga toxigenic Esherishia Coli by using multiplex PCR  assay for stx(1), stx (2), eaeA, enterohemorragic  E.coli hlyA , rfbom. J Clin Microbiol. 1998; 36(2): 598- 602.

8. Elwell LP. Plasmid- mediated factors associated with virulence of bacteria to animals. Ann Rev Microbiol. 1980; 34: 465-496.

9. Shimizu M, Sakano T, Yamamoto J, Kitajima K. Incidence and  some characteristics of fimbriae FY and 31A of Esherishia coli isolated from calves with diarrhea in Japan. Microbiol Immunol. 1987; 31(5): 417-426.

10. Acha SJ, Kuhn I, Jonsson P, Mbazima G, Katouli M, Mollby R. Studies on calf diarrhea in Mozambique: prevalence of bacterial pathogens. Acta Vet Scand. 2004; 45(1-2): 27-36.

11- Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 1998; 11(1):  142-201.

12. Akam A, Khelef D, Kaidi R, Othmani A, Lafri M, Tali-Maamar H, Rahal K, Tahrat N, Chirila F, Cozma V, Abdul Hussain MS.  Frequency of Cryptosporidium parvum, Escherichia coli K99 and Salmonella spp. isolated from healthy and unhealthy calves in six breeding farms from Mitidja, Algeria (Preliminary results). Rev Sci Parasitol. 2004; 5(1-2): 13-21.

13. Li SG, Shen ZQ, Shan H. Cloning and nucleotide sequencing of fusion gene of K99 antigen and heat stable toxin I of Escherichia coli. Zhongguo Shou Yao Zazhi. 2007; 4: 11-14.

14. Sunderland SJ, Sarasola P, Rowan TG, Giles CJ, Smith DG. Efficacy of danofloxacin 18% injectable solution in the treatment of Escherichia coli diarrhoea in young calves in Europe. Res Vet Sci. 2003; 74(2): 171-178.

15. Guler L, Gunduz K, Ok U. Virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherihia coli isolated from calves  in Turky. Zoonoses Public Health. 2008; 55(5): 249-257.

16. Hariharan H, Coles M, Poole D, Page R. Antibiotic resistance among enterotoxigenic Escherichia coli from piglets and calves from piglets and calves from piglts and calves with diarrhea. Can Vet J. 2004; 45(7): 605-606.

17. Khai LTL, Voung PQ, Kobayashi H, Phan TT, Loc CB, Yamasaki S, Taniguchi T. Isolation,identification and treatment of piglet'diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli K88,K99,987P in Cantho Province,Vietnam. Res Microbiol. 2008; 24: 210-21.

18. Guinee PAM, Jansen WH, Agterberg CM. Detection of the K99 antigen by means of agglutination  and immunoelectrophoresis in Escherichia coli isolates from calves and its correlation with enterotoxigenicity. Infect Immun. 1976; 13(5): 1369-1377.

19. Guinee PAM, Veldkamp MJ, Jansen WH.  Improved minca medium for the detection of K99 antigen in calf enterotoxigenic strains of Escherichia coli. Infect Immun. 1977; 15(2): 676-678.

20. Evans DG, Evans DJ, Tjoa WS, DuPont HL. Detection and characterization of colonization factor enterotoxigenic Escheriachia coli isolated from adults with diarrhea. Infect Immun. 1978; 19(2): 727-736.

21. Franck SM, Bosworth BT, Moon HW.  Multiplex PCR for enterotoxigenic, attaching and effacing, and Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from calves. J Clin Microbiol. 1998; 36(6): 1795-1797.

22. Bourgouin H. The place of cryptosporidium among the diseases of new born claves in correze. Bulletin-des- G.T.V. 1996; 2: 19-41

23. Isaacson RE. K99 surface antigen of Esherichia coli: purification and partial characterization . Infect Immun. 1977; 15(1): 272-279.