استخراج و کلون سازی ژن اینترلوکین-2 جوجه پرورشی ایران

محورهای موضوعی : زیست فناوری میکروبی

حمیده امینی ¹ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، گروه میکروبیولوژی)
سید داود حسینی ² (بخش مولکولی و بیوتکنولوژی، موسسه واکسن و سرم سازی رازی اراک)
جمیله نوروزی ³ (دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، گروه میکروبیولوژی)
دلاور شهباززاده ⁴ (بخش بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران)

تاریخ دریافت : 1392/01/25 تاریخ پذیرش : 1392/01/25 تاریخ انتشار : 1389/01/12

کلید واژه: IL-2 جوجه, واکسن نوترکیب, سیتوکین, ادجوانت, کلون سازی,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: در سال‌های اخیر سیتوکین‌های ایمنی مانند اینترلوکین-2 جوجه (chIL-2)، همراه با رژیم‌های واکسیناسیونی در صنعت ماکیان مورد استفاده قرار گرفته است. این سیتوکین‌ها می توانند به واسطه تکثیر لمفوسیت های T، توسعه لمفوسیت‌های B و فعال‌سازی سلول‌های کشنده ایمنی (NK) موجب افزایش کارایی واکسن ها گردند. این مطالعه با هدف استخراج و کلونینگ ژن اینترلوکین-2 جوجه پرورشی انجام گرفت. مواد و روش ها: در ابتدا برای جداسازی chIL-2، RNA تام به وسیله کشت سلول‌های طحال جوجه و با استفاده از فرآیند Trizol جداسازی گردید. با استفاده از تکنیک تک مرحله‌ای RT-PCR و پرایمرهای طراحی شده، mRNA به DNA تبدیل و تکثیر شد. سپس محصول PCR در وکتور PTZ57R/T از کیت TA-cloning وارد و توسط شوک حرارتی به باکتری اشریشیا کلی Top10، منتقل گردید. یافته‌ها: نتیجه RT-PCR نشان دهنده حضور یک باند bp 668 بود. درستی انجام فرآیند کلون‌سازی ژن در باکتری میزبان، از طریق واکنش هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های برش دهنده HindIII و EcoRI و سپس انجام PCR از کلنی‌های مورد نظر و تعیین توالی ژن بدست آمده اثبات گردید. نتیجه گیری: در این پژوهش برای اولین بار در ایران، ژن chIL-2 جداسازی و در باکتری کلون شد و تعیین توالی و بررسی آن در سایت NCBI نیز نشان‌دهنده شباهت 99% آن با توالی سایر ژن‌های chIL-2 جداسازی شده در مطالعات مختلف بود.

چکیده انگلیسی:

Background and Objectives: Nowadays, the immune cytokines, such as the chicken IL-2 (chIL-2) gene are incorporated into vaccination regimens used by the poultry industry. The cytokines can potentially enhance the efficiency of vaccines according to increase T lymphocyte proliferation, B lymphocyte development and natural killer cell (NK) activation. The aim of this study was extraction and cloning of Iranian chicken interleukine-2 (chIL-2). Materials and Methods: First of all, in order to extract chIL-2 gene, total cell RNAs were isolated by culturing the harvested splenocytes and using Trizol reagent. The chIL-2 specific mRNA was converted into cDNA using reverse Transcriptase (RT) and specific designed primers. Then, The PCR product was ligated into the PTZ57R/T plasmid (TA-cloning kit) and was transformed into the competent Top10 E. coli using heat shock method. Results: A unique band of 668-bp was obtained after RT-PCR amplification. The results of restriction enzyme, colony PCR from transformed colonies and also gene sequencing confirmed the existence of desired gene in transformants bacteria. Conclusion: For the first time in Iran we could extract and clone the chIL-2 gene in bacteria and gene alignment. A direct sequencing test showed 99% similarity between this gene and the established data in NCBI.

منابع و مأخذ:

1. Bowersock TL. Evolving importance of biologics and novel delivery systems in the face of microbial resistance. AAPS Pharm. Sci. 2002; 4:1–7.


2. Iovine NM, Blaser MJ. Antibiotics in animal feed and spread of resistant Campylobacter from poultry to humans. Emerg. Infect. Dis. 2004; 10:1158–1159.


3. 3.      Heath, WW, Playfair, JHL. Cytokines as immunological adjuvants. Vaccine. 1992; 10:427–434.


4. Hughes, HPA, Babiuk LA. The adjuvant potential of cytokines. Biotechnol Therapeut. 1992; 3:101–117.


5. 5.      Husband AJ, Bao S, Muir W, Ramsay AJ, Ramshaw IA. Cytokine regulation of mucosal responses: a rational basis for new vaccine delivery strategies. Reprod Fertil Dev. 1994; 6:381-388.


6. Sundick RS, Gill-Dixon C. A cloned chicken lymphokine homologous to both mammalian IL-2 and IL-15. J. Immunol. 1997; 159:720–725.


7. Schumann R, Nakaral T, Gruss HJ, Brach MA, Vanm AU, Kirschning C. Transcript synthesis and surface expression of the interleukin-2 receptor (alpha, beta, and gamma chain) by normal and malignant myeloid cells. Blood. 1996; 87:2419–2427.


8. Bartlett Y. Potential monitoring value of functional interleukin-2 receptors on human neutrophils. Clinic. Diagnos. Lab. Immunol. 1998; 5:270.


9. Wu CC, Dorairajan T, Lin TL. Effect of ascorbic acid supplementation on the immune response of chickens vaccinated and challenged with infectious bursal disease virus. Vet. Immunol. Immunopathol. 2000; 749:145–152.


10. 10.  Xing Z, Schat KA. Expression of cytokine genes in Marek’s disease virus-infected chickens and chicken embryo fibroblast cultures. Immunology. 2000; 100:70–76.


11. Thiagarajan D, Ram GC, Bansal MP. Optimum conditions for in vitro chIL-2 production and in vivo role in Newcastle disease vaccinated chickens. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999; 67:79–91.


12. Markowski-Grimsrud CJ, Schat KA. Infection with chicken anaemia virus impairs the generation of pathogen-specific cytotoxic T lymphocytes. Immunology. 2003; 109:283–294.


13. Chio KD, Lillehoj HS. Role of chIL-2 on gamma delta T-cells and Eimeriaacervulina-induced changes in intestinal IL-2 mRNA expression and gamma delta T-cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 2000; 73:309–321.


14. Jianrong L, Xueya L, Yaowei H, Songshu M, Ronghui X, Ruitang D, Lian Y. Enhancement of the immunogenicity of DNA vaccine against infectious bursal disease virus by co-delivery with plasmid encoding chicken interleukin 2. Virology. 2004; 329:89–100.


15. Diane H, Carlos R. Partial protection against infectious bursal disease virus through DNA-mediated vaccination with the VP2 capsid protein and chicken IL-2 genes. Vaccine. 2004; 22:1249–1259.


16. Robb RJ. Interleukin-2: The molecule and its function. Immunol. 1984; 5:203-209.


17. Gillis S, Smith KA. Long term culture of tumor specific cytotoxic T cells. Nature. 1977; 268:154-156.


18. Howard M, Matis L, Malek TR, Shevach R, Kell W, Cohen D, Nakamishi K, Paul WF. Interleukin-2 induces antigen-reactive T-cell lines to secrete BCGF-I. J.Exp. Med. 1983; 158:2024-2039.


19. Gillis S, Watson J. Interleukin-2 induction of hapten specific cytolytic T-cells in nude mice. J. Immunol. 1981; 126:1245-1248.


20. Arunachalam, B, Subba Rao MV, Ram GC. Bovine Interleuke 2: Biochemical and biological characterization. Vet. Immunol. Immunopatho. 1989; 23:377-383.


21. 21.  English LS, Latta H, Whitehurst M. Initial characterization of sheep T-cell growth factor and its species restricted activity on human, rat and mouse cells. Cellular Immunol. 1985; 90:314-321.


22. 22.  Ram GC, Subba Rao MV, Singh VP, Bansal MP. Isolation and characterization of goat interleukin 2. Indian J. Exp. Biol. 1987; 25:589-591.


23. Schnetzler M, Ocmen A, Nowak JS, Franklin RM. Characterization of chicken T cell growth factor. Eur. J. Immunol. 1983; 13:560-566.


24. Heckert RA, Elankumaran S, Oshop GL, Vakharia VN. A novel transcutaneous plasmid-dimethylsulfoxide delivery technique for avian nucleic acid immunization. Vet. Immunol. Immunopatho. 2002; 89:67–81.


25. Moore AC, Kong WP, Chakrabarti BK, Nabel GJ. Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice. J. Virol. 2002; 76:243–250.


26.  Kuhnle G, Collins RA, Scott JE, Keil GM. Bovine interleukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins. J. Gen. Virol. 1996; 77:2231–2240.


27. Geissler M, Gisien A, Tokushige K, Wands JR. Enhancement of cellular and hurmoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids. J. Immunol. 1997; 158:1231–1237.


28. Chow YH, Huang W, Chi W, Chu Y, Tao M. Improvement of Hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids co-expressing Hepatitis B surface antigen and interleukin-2. J. Virol. 1997; 71:169-178.


29. Chow YH, Chiang BL, Lee YL. Development of Th1 and Th2 population and the nature of immune response to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by co-delivery of various cytokine genes. J. Immunol. 1998; 160:1320–1329.


30. 30.  Nobiron I, Thompson I, Brownlie J, Collins ME. Cytokine adjuvancy of BVDV DNA vaccine enhances both humoral and cellular immune responses in mice. Vaccine. 2001; 19:4226–4235.


31. Wong HT, Cheng SC, Sin FW, Chan EW, Sheng ZT, Xie Y. A DNA vaccine against foot-and-mouth disease elicits an immune response in swine which is enhanced by co-administration with interleukin-2. Vaccine. 2002; 20:2641–2647.


32. Premenko-Lanier M, Rota PA, Rhodes G, Verhoeven D, Barouch DH, Lerche NW, Letvin NL, Bellini WJ, Mc Chesney MB. DNA vaccination of infants in the presence of maternal antibody: a measles model in the primate. Virol. 2003; 307:67–75.