غربالگری مولکولی سراشیا مارسیسنس تولید کننده پروتئاز خارج سلولی از محیط های مختلف غرب مازندران
محورهای موضوعی : میکروب شناسی کاربردی
راحله سلطانمرادی
1
(کارشناس ارشد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و فناوری های نوین تهران، گروه میکروب شناسی)
امیر سلیم رزم آرا
2
(کاردان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد چالوس، گروه دامپزشکی)
سید رضا حسینی دوست
3
(استاد، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و فناوری های نوین تهران، گروه میکروب شناسی)
کلید واژه: SDS-PAGE, سراشیا مارسیسنس, 16S rDNA, فعالیت آنزیمی, سراشیوپپتیداز,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: پروتئازها یکی از مهم ترین آنزیم های کاربردی در بیوتکنولوژی و صنایع مختلف مانند صنایع چرم، صنایع غذایی، داروسازی، شوینده ها و غیره می باشند. میکروب ها به دلیل رشد سریع، سهولت کشت، دستکاری ژنتیکی در جهت تولید بهینه آنزیم، از منابع عمده تولید پروتئازها به شمار می روند. این مطالعه با هدف جداسازی سویه های سراشیا مارسیسنس از منابع طبیعی غرب مازندران و ارزیابی قابلیت تولید آنزیم پروتئاز انجام شده است. مواد و روش ها: این پژوهش به صورت مقطعی بر روی150 نمونه جمع آوری شده از عمق 0 تا 10 سانتی متری خاک ها و آب های مناطق غرب مازندران انجام شد. به منظور جداسازی و شناسایی اولیه میکروارگانیسم های دارای فعالیت پروتئولیتیک از محیط کشت Skim milk agar و آزمون های یوشیمیایی استفاده شد. پس از استخراج DNA و با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن 16S rDNA گونه سراشیا مارسیسنس شناسایی گردید. سپس بهینه سازی دمایی و زمانی بر روی سویه های برتر مولد آنزیم انجام شد. همچنین وزن مولکولی تقریبی آنزیم به وسیله رسوب دهی پروتئین و روش SDS-PAGE تعیین گردید. یافته ها: در مجموع از 2 سویه سراشیا مارسیسنس جداسازی شده در این مطالعه، نمونه N به عنوان سویه جدید با نام سراشیا مارسیسنس سویه 424 در بانک جهانی ژن با شماره KC790390 به ثبت رسید. این دو سویه بیشترین مقدار تولید آنزیم را در دمای 37 درجه سانتی گراد و در مدت 24 ساعت نشان دادند. بیشترین تولید آنزیم مربوط به سراشیا مارسیسنس سویه 424 با فعالیت معادلU/ml 199/80و وزن مولکولی 52 کیلو دالتون بود. نتیجه گیری: نتایج به دست آمده در این مطالعه نشان دهنده پتانسیل بالای سراشیا مارسیسنس سویه 424 در تولید پروتئاز و سراشیوپپتیداز می باشد. بنابراین ارزیابی پتانسیل کاربردی این آنزیم ها در صنایع مختلف پیشنهاد می شود.
Background and Objectives: Proteases are a useful family of enzymes in microbiology with applications in leather industry, food industry, pharmacy, cleaners, and many other industries. Due to rapid replication, fast growing and facility in their genetic manipulations, microorganisms are used as the main resources of production of proteases. This paper aimed to isolate the Serratia marcescens strains from the natural environments at western Mazandaran, with the ability to produce proteolytic enzymes. Materials and Methods: In the present study, 150 natural samples were taken from different depth (0-10 cm) of soils and waters located at western part of Mazandaran. In order to isolate and to identify the microorganisms the samples were grown on Skim milk agar, and the isolates were underwent different biochemical tests. Next, Serratia marcescens strains were screened by molecular tests and 16SrRNA. After isolation of the strains, several time and temperature optimization steps were performed on the most potent enzyme producing strains. As well, approximate molecular weight of the enzymes were measured abased on protein deposition and SDS-PAGE. Results: Only two isolates were identified as Serratia marcescens. One of the two isolates belongs to a novel strain nominated as Serratia marcescens 424, which recorded in Genbank as KC790390. These two isolates could produce high levels of proteolytic enzyme in 24 hours under 37oC. The highest amount of enzyme belonged to a 52 Dalton molecular weight isolated from Serratia marcescens 424. Conclusion: Our studies show a high potential of the isolated Serratia marcescens strains in production of protease and Serratiopeptidase. As a result these strains can be useful in various industries.
1. Grimont F, Grimont PAD. The Genus Serratia. Prokaryotes. 2006; 6: 219-244.
2. Salamone PR, Wodzinski RJ. Production, purification and characterization of a 50-kDa extracellular metalloprotease from Serratia marcescens. Appl Microbiol Biotechnol. 1997; 48(3): 317-324.
3. Ahamed A, Vermette P. Effect of mechanical agitation on the production of cellulases by Trichoderma reesei RUT-C30 in a draft-tube airlift bioreactor. Biochem Eng J. 2010; 49(3): 379-387.
4. Sharma A, Tiwari R. Extracellular enzyme production by environmental strains of Serratia spp. isolated from river Narmada. Indian J Biochem Biophys. 2005; 42(3): 178-181.
5. Someya N, Nakajima M, Hirayae K, Hibi T, Akutsu K. Synergistic antifungal activity of chitiolytic enzymes and prodigiosin produced by biocontrol bacterium, Serratia marcescens strain B2 against gray mold pathogen Botrytis cinerea. J Gen Plant Pathol. 2001; 67(4): 312-317.
6. Gupta R, Beg Q.K, Lorenz P. Bacterial alkaline protease: molecular approaches and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2002; 59(1):15-32.
7. Anwar A, Saleemuddin M. Alkaline proteases: a review. Bioresour Technol. 1998; 64 (3): 175-183.
8. Mazzone A, Catalani M, Costanzo M, Drusian A, Mandoli A, Russo S, Guarini E, Vesperini G. Evaluation of Serratia peptidase in acute or chronic inflammation of otorhinolaryngology pathology: a multicentre, double-blind, randomized trial versus placebo. J Int Med Res. 1990; 18(5): 379-388.
9. Klein G, Kullich W. Short-term treatment of painful osteoarthritis of the knee with oral enzymes, a randomized, double-blind study versus diclofenac. Clin Drug Invest. 2000; 19)1): 15-23.
10. Fujisaki S, Ohnuma S, Horiuchi T, Takahashi I, Tsukui S, Nishimura Y, Nishino T, Kitabatake M, Inokuchi H. Cloning of a gene from Escherichia coli that confers resistance to fosmidomycin as a consequence of amplification. Gen. 1996; 175(1-2): 83-87.
11. Decedue CJ, Broussard EA, Larson AD, Braymer HD. Purification and characterization of the extracellular proteinase of Serratia marcescens. Biochem Biophys Acta. 1979; 569(2): 293-301.
12. Miyata K, Tomoda K, Isono M. Serratia protease Part III. Characteristics of the enzyme as a metalloenzyme. Agric Biol Chem. 1971; 35: 460-467.
13. Braun V, Schmitz G. Excretion of a protease by Serratia marcescens. Arch Microbiol. 1980; 124(1): 55-61.
14. Casta eda-Agullo M. Studies on the biosynthesis of extracellular proteases by bacteria: I. Serratia marcescens, synthetic and gelatin media. J Gen Physiol. 1956; 39(3): 369-375.
15. Miyazaki H, Yanagida N, Horinouchi S, Beppu T. Specific excretion into the medium of a serine protease from Serratia marcescens. Agric Biol Chem. 1990; 54(10): 2763-2765.
16. Giri AV, Anandkumar N, Muthukumaran G, Pennathur G. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiol. 2004; 4(11): 1-10.
17. Blakebrough N, Moresi M. Scale-up of whey fermentation in a pilot-scale fermenter. Eur J Appl Microbiol Biotechnol. 1981; 12(3): 173-178.
18. Tamilmani P, Umamaheswari A, Vinayagam A, Prakash B. Production of an extra cellular feather degrading enzyme by farm soil in Namakkal district (Tamilnadu). International Journal of Poultry Science. 2008; 7(2): 184-188.
19. Ustariz FJ, Laca A, Garcia LA, Diaz M. Fermentation conditions increasing protease production by Serratia marcescens in fresh whey. Rev Tec Ing Univ Zulia. 2008; 31(1): 79-89.
20. Michaelis S, Chapon C, D'Enfert C, Pugsley AP, Schwartz M. Characterization and expression of the structural gene for pullulanase, a maltose-inducible secreted protein of Klebsiella odeling. J Bacteriol. 1985; 164(2): 633-638.
21. Mohankumar A, Hari Krishna Raj R. Indirect genetic characterization of Serratia marcescens. Journal of Biology and Life Science. 2012; 3(1): 174-188.
22. Badhe RV, Nanda RK, Kulkarni MB, Bhujbal MN, Patil PS, Badhe SR. Media optimization studies for Serratiopeptidase production from Serratia marcescens ATCC 13880, Hindustan Antibiot Bull. 2009; 51(1-4): 17-23.
23. Mukesh Kumar DJ, Lawrence L, Rajan R, Priyadarshini S, Sandhiya K. Characterization of lipase and protease from Serratia Marcescens DEPTK21 and its destaining capability. Asian J Exp Biol Sci. 2012; 3(3): 621-628.